加巴噴丁減輕骨折模型大鼠焦慮情緒及海馬神經(jīng)炎癥的作用機(jī)制研究

徐禮玲，付恒，曾思

作者單位：1自貢市精神衛(wèi)生中心，四川 自貢 643020；

2四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川 成都610000

骨折屬于臨床常見(jiàn)骨科疾病，各年齡階段均有較高發(fā)生率，尤其是兒童及老年人［1］。骨折后易合并感染、神經(jīng)血管損傷等并發(fā)癥，還可能誘發(fā)焦慮抑郁疾病等心理疾病，對(duì)病人生活質(zhì)量產(chǎn)生極大影響［2-3］。外科手術(shù)屬于疾病治療首選方案。圍手術(shù)期病人普遍存在骨折疼痛、手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)，誘發(fā)焦慮情緒風(fēng)險(xiǎn)較高，因此臨床認(rèn)為有必要加強(qiáng)骨折疾病病人管理［4-5］。加巴噴丁成分為加巴噴丁和普瑞巴林，最早主要用于抗癲癇輔助治療［6］。近年來(lái)逐漸應(yīng)用于各類疼痛相關(guān)治療，諸多研究證實(shí)加巴噴丁對(duì)骨折疼痛［7-9］、疼痛誘發(fā)的焦慮有著重要價(jià)值。Huo 等［10］研究中報(bào)道，骨折將增加小鼠中風(fēng)損傷及中風(fēng)后記憶功能障礙，其影響機(jī)制與 α-7 煙堿型乙酰膽堿受體 （α-7 nAchR） 誘發(fā)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)元受損有著密切關(guān)聯(lián)性。海馬區(qū)作為大腦中具有豐富神經(jīng)連接環(huán)路區(qū)域，具有記憶、信息儲(chǔ)存等功能，同時(shí)還參與了情感、認(rèn)知活動(dòng)調(diào)控機(jī)制，其神經(jīng)炎癥與手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)、焦慮情緒發(fā)病有著密切關(guān)聯(lián)性［11-13］。目前臨床對(duì)加巴噴丁治療骨折所致的焦慮情緒及海馬神經(jīng)炎癥的影響機(jī)制未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，仍有待進(jìn)一步研究及論證?；诖?，本研究自2022年1—6 月將加巴噴丁對(duì)骨折模型大鼠焦慮情緒及海馬神經(jīng)炎癥的影響進(jìn)行分析，旨在通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究作用機(jī)制，為后續(xù)臨床試驗(yàn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇健康雄性無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)SD 大鼠48 只，雌雄各半，體質(zhì)量范圍為200～300 g，3 月齡，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供［SCXK（滬）2019-0033］。大鼠培養(yǎng)環(huán)境：溫度22～25 ℃，濕度49%～51%，12 h 光亮/12 h 黑暗交替培養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。所有動(dòng)物均分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d（每4 只為1 籠），方可用于實(shí)驗(yàn)。本研究中對(duì)于大鼠的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器加巴噴丁來(lái)自于海南賽立克藥業(yè)有限公司，戊巴比妥鈉來(lái)自于上海市欣誠(chéng)化工有限公司，大鼠白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定試劑盒來(lái)自于上海臻科生物科技有限公司，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）比色法試劑盒來(lái)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）ELISA試劑盒來(lái)自上海信裕生物工程有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA 試劑盒來(lái)自上海滬震生物科技有限公司。蘇木素伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色液來(lái)自于錸博（上海）生化科技有限公司，BCA 試劑盒來(lái)自于上海炎熙生物科技有限公司，Tris-HCl 緩沖鹽溶液來(lái)自于北京匯智和源生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠二抗稀釋液來(lái)自于上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。大鼠高架十字迷宮（型號(hào)PM-200）來(lái)自于成都泰盟軟件有限公司，酶標(biāo)儀（MK3 型）來(lái)自于美國(guó)Thermo 公司，光學(xué)顯微鏡（Primo Vert 型）來(lái)自于德國(guó)Leica 公司，凝膠成像分析儀（ChemiDoc XRS+型）來(lái)自于美國(guó) Bio-Rad公司。

1.3 分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將48 只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、治療組，各16只。假手術(shù)組正常飼養(yǎng)，未做任何處理，其余兩組大鼠均進(jìn)行骨折造模。治療組給予加巴噴丁干預(yù)，將1 mg/kg 加巴噴丁與0.9%氯化鈉注射液配置為水溶液100 mg/kg，并給予腹腔注射。模型組給予生理鹽水干預(yù)，腹部注射等量0.9%氯化鈉注射液代替。兩組均連續(xù)給藥12 d。

1.4 骨折動(dòng)物模型準(zhǔn)備操作方法［14］：采用40 mg/kg 的1%戊巴比妥鈉實(shí)施腹腔麻醉，確定右下肢髕骨內(nèi)緣做一1 cm 的縱行切口，并對(duì)其股四頭肌腱性組織部分進(jìn)行縱行分離；緩慢屈曲膝關(guān)節(jié)，并對(duì)髕骨進(jìn)行外側(cè)脫位牽拉，充分暴露股骨髁間凹；確定股骨髁間凹處采用手鉆逆行髓腔鉆入直徑1.0 mm克氏針，當(dāng)遇到股骨大轉(zhuǎn)子阻力時(shí)可往回抽，并進(jìn)行切斷操作，將斷段埋于膝關(guān)節(jié)軟骨表面下，并對(duì)其切口進(jìn)行逐層閉合。將大鼠調(diào)整為仰臥體位，保持右下肢外展內(nèi)旋，并將其固定于造模支架的鐵砧間距15 mm的調(diào)節(jié)砧上。將造模支架中柱下端的骨刀放置并壓在大腿中部，由實(shí)驗(yàn)助手提起500 g的砝碼調(diào)整到20 cm 處，并讓其沿導(dǎo)桿保持自由落體撞擊到鋼板，導(dǎo)致大鼠發(fā)生股骨中段骨折。并基于X線輔助下完成對(duì)骨折動(dòng)物模型的檢查。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1焦慮情緒 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：高架十字迷宮區(qū)域包括2 個(gè)開(kāi)放臂（50 cm×10 cm）、2 個(gè)閉合臂（50 cm×10 cm×40 cm）、中央?yún)^(qū)（10 cm×10 cm），迷宮距離地面50 cm。測(cè)試前將大鼠放入實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)30 s再進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)中將大鼠放置于開(kāi)放臂、閉合臂交界處，且大鼠頭部面向開(kāi)放臂；實(shí)驗(yàn)人員遠(yuǎn)離迷宮并進(jìn)行同步攝像，設(shè)置觀察時(shí)間為5 min。采用軟件分析大鼠總穿臂次數(shù)（TE）、進(jìn)入比例（OE）、停留時(shí)間比例（OT）。采用軟件分析大鼠中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離、進(jìn)入次數(shù)、停留時(shí)間及總運(yùn)動(dòng)距離。每只動(dòng)物完成實(shí)驗(yàn)后均需要采用10%乙醇對(duì)方箱內(nèi)壁及底面進(jìn)行清洗，以消除上只動(dòng)物殘留的氣味、大小便等信息。進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)越少，停留時(shí)間越短表明動(dòng)物焦慮情緒越嚴(yán)重。

1.5.2海馬神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激因子 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)每組大鼠進(jìn)行斷頭取海馬組織操作，并在冰上進(jìn)行海馬組織（選擇自枕骨大孔沿矢狀縫撬開(kāi)顱骨，采用玻璃分針撥開(kāi)大腦皮層，充分暴露海馬區(qū)域）剝離與稱重，并將其分為3 份，分別用于炎癥因子檢測(cè)、蘇木素染色、蛋白質(zhì)印跡法。

（1）炎癥因子IL-4、IL-6、IL-1β 及SOD、MDA、GSH-Px的檢測(cè)：加入生理鹽水制備10%大鼠海馬組織勻漿液，進(jìn)行10 min 離心操作（12 000 r/min）后獲取上層清液，采用對(duì)應(yīng)ELISA 試劑盒檢測(cè)海馬勻漿液中的炎癥因子（IL-4、IL-6、IL-1β）、SOD、MDA 水平，采用比色法檢測(cè)GSH-Px，具體操作按照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，包括稀釋、加樣、溫育、洗滌、加酶、顯色、終止反應(yīng)。并將酶標(biāo)儀調(diào)零后，確定450 nm 波長(zhǎng)參數(shù)，并檢測(cè)海馬組織中IL-4、IL-6、IL-1β、GSH-Px、SOD 的OD 值，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中對(duì)應(yīng)因子的濃度。

（2）海馬區(qū)HE 染色：將大鼠腦組織進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋、冰凍切片操作。加入HE 染色，20 min 二甲苯透明，并采用中性樹脂封片。選擇海馬區(qū)域5個(gè)視野（400 倍），于光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。

（3）蛋白質(zhì)印跡法：取出海馬組織進(jìn)行碾磨、裂解、提取蛋白操作。用含有蛋白質(zhì)酶抑制劑的裂解液制備海馬組織蛋白質(zhì)提取物，應(yīng)用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。加入10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）完分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并將膜在5%脫脂乳中封閉 1 h。采用去離子水稀釋Tris-HCl 緩沖鹽溶液一抗（1∶1 000），保持 4 ℃孵育過(guò)夜；TBS 漂洗3 次，每次3 min，再加入兔抗鼠二抗稀釋液（1∶8 000），保持37 ℃恒溫箱內(nèi)避光孵育2 h，進(jìn)行3 次同樣的漂洗，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯影液顯色，并采用凝膠成像系統(tǒng)完成膠片曝光和成像操作，采用軟件測(cè)量相應(yīng)蛋白條帶灰度值［腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、人核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析，多組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠焦慮情緒比較假手術(shù)組大鼠TE、

OE、OT均高于治療組、模型組大鼠，治療組大鼠TE、OE、OT均高于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠焦慮情緒比較/± s

表1 三組大鼠焦慮情緒比較/± s

注：TE為總穿臂次數(shù)，OE為進(jìn)入比例，OT為停留時(shí)間比例。①與假手術(shù)組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

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2.2 三組大鼠海馬神經(jīng)炎癥因子的比較假手術(shù)組大鼠IL-4、IL-6、IL-1β 均低于治療組、模型組大鼠，治療組大鼠IL-4、IL-6、IL-1β 均低于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組大鼠海馬神經(jīng)炎癥因子比較/（ng/L，± s）

表2 三組大鼠海馬神經(jīng)炎癥因子比較/（ng/L，± s）

注：IL為白細(xì)胞介素。①與假手術(shù)組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

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2.3 三組大鼠海馬神經(jīng)氧化應(yīng)激因子比較假手術(shù)組大鼠GSH-Px、SOD 均高于治療組、模型組大鼠，MDA 低于兩組；且治療組大鼠GSH-Px、SOD 均低高于模型組，MDA低于該組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 三組大鼠海馬神經(jīng)氧化應(yīng)激因子比較/± s

表3 三組大鼠海馬神經(jīng)氧化應(yīng)激因子比較/± s

注：GSH-Px 為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，SOD 為超氧化物歧化酶，MDA為丙二醛。①與假手術(shù)組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

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2.4 大鼠海馬組織病理形態(tài)分析假手術(shù)組大鼠（圖1A）海馬神經(jīng)元呈現(xiàn)排列規(guī)則、分布均勻特征，且胞體無(wú)空泡癥狀。模型組大鼠（圖1B）表現(xiàn)出部分海馬區(qū)域神經(jīng)元散亂特征，可見(jiàn)點(diǎn)狀軟化灶，且胞體表現(xiàn)出空泡現(xiàn)象，神經(jīng)細(xì)胞存在崩解、碎裂、深染等明顯凋亡特征。治療組大鼠（圖1C）神經(jīng)元損傷現(xiàn)象出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，其海馬區(qū)域神經(jīng)元呈現(xiàn)排列相對(duì)規(guī)則、分布相對(duì)均勻特征，且變形壞死的細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯較少，但仍存在部分細(xì)胞空泡化。

圖1 大鼠海馬組織神經(jīng)元排列特征（ HE染色×200）：A為假手術(shù)組；B為模型組；C為治療組

2.5 三組大鼠海馬組織蛋白表達(dá)量比較假手術(shù)組大鼠NF-κB、TNF-α 蛋白表達(dá)均低于治療組、模型組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而治療組大鼠NF-κB、TNF-α 蛋白表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2；表4。

圖2 各組大鼠海馬NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)電泳

表4 三組大鼠海馬組織蛋白表達(dá)量的比較/± s

表4 三組大鼠海馬組織蛋白表達(dá)量的比較/± s

注：TNF-α為腫瘤壞死因子α，NF-κB為核因子κB。①與假手術(shù)組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

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3 討論

很多研究顯示，骨折后疼痛、外科手術(shù)治療應(yīng)激反應(yīng)不僅會(huì)增加軀體痛苦感覺(jué)，還易誘發(fā)抑郁不良情緒［15-20］。因此有必要加強(qiáng)骨折導(dǎo)致的焦慮情緒病人臨床管理，干預(yù)致病病理機(jī)制，降低疾病風(fēng)險(xiǎn)。加巴噴丁屬于GABA結(jié)構(gòu)類似物，既往研究證實(shí)，該藥物具有良好鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其藥理機(jī)制通過(guò)結(jié)合突觸前膜鈣通道GABA亞型，發(fā)揮抑制鈣離子內(nèi)流功效，繼而阻斷神經(jīng)細(xì)胞的病理傳導(dǎo)通路，減少興奮性遞質(zhì)濃度，阻斷神經(jīng)凋亡途徑及相關(guān)蛋白［21-22］。

近年來(lái)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)加巴噴丁有著確切海馬功能及神經(jīng)保護(hù)作用。Swartzwelder 等［23］研究顯示，加巴噴丁可以通過(guò)拮抗血小板反應(yīng)蛋白 （TSPs） 與α2δ-1 受體的相互作用，逆轉(zhuǎn)或改善青少年間歇性乙醇 （AIE）對(duì)海馬功能的影響。臧穎卓等［24］研究顯示，加巴噴丁可以通過(guò)抑制海馬神經(jīng)元組織學(xué)改變，影響凋亡相關(guān)基因P75NTR 表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，治療組大鼠TE、OE、OT 均高于模型組。說(shuō)明骨折狀態(tài)下，大鼠出現(xiàn)焦慮情緒較高；而加巴噴丁應(yīng)用可以改善焦慮癥狀。治療組大鼠神經(jīng)元損傷現(xiàn)象出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，其海馬區(qū)域神經(jīng)元呈現(xiàn)排列相對(duì)規(guī)則、分布相對(duì)均勻特征，且變形壞死的細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯較少，但仍存在部分細(xì)胞空泡化。說(shuō)明加巴噴丁可以減輕海馬區(qū)神經(jīng)元損傷及凋亡。其原因可能是病理狀態(tài)下，炎癥因子升高將影響血腦屏障通透性，增加氧自由基水平，繼而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡，促使其細(xì)胞加速死亡［25］。而加巴噴丁可以通過(guò)干預(yù)炎癥機(jī)制，保護(hù)神經(jīng)元，修復(fù)海馬神經(jīng)元形態(tài)，維持神經(jīng)突觸可塑性。

治療組大鼠IL-4、IL-6、IL-1β、MDA 均低于模型組，GSH-Px、SOD 均高于模型組。治療組大鼠NFκB、TNF-α 蛋白表達(dá)均低于模型組。說(shuō)明加巴噴丁可以改善海馬區(qū)神經(jīng)炎癥狀態(tài)。NF-κB、TNF-α 炎癥因子可以激活神經(jīng)病理狀態(tài)，對(duì)5-HT釋放及合成產(chǎn)生影響，繼而增加焦慮病情。該藥物可以改善骨折引起的焦慮狀態(tài)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)海馬神經(jīng)炎癥因子表達(dá)，減少NF-κB/TNF-α 信號(hào)通路含量，繼而改善海馬神經(jīng)元認(rèn)知功能障礙有關(guān)。

綜上所述，骨折導(dǎo)致大鼠焦慮情緒增加，而加巴噴丁可以有效削弱骨折大鼠的焦慮情緒，可能與加巴噴丁減弱海馬炎癥反應(yīng)有關(guān)，從而增強(qiáng)NF-κB/TNF-α信號(hào)通路對(duì)海馬神經(jīng)的保護(hù)作用。