基于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討香參丸治療潰瘍性結(jié)腸炎的分子機(jī)制

繆濤聲，李逸婷，鄭鴻銘，胡芝凡，莫喬蘭，邱澤鑫，陳斌

作者單位：1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；

2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃科，廣東 廣州510405

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）一種常見的慢性、非特異性結(jié)、直腸炎性疾病［1］，臨床表現(xiàn)主要有腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，如今UC 因其發(fā)病率的不斷上升已成為全球公共衛(wèi)生問題［2］。UC 目前的治療藥物主要有5-氨基水楊酸、生物制劑及激素等，但仍具有藥物依賴性、病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較大等問題［3］，因此迫切需要為UC 病人開發(fā)新型有效、副作用較低且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的治療方法。

中醫(yī)藥是我國(guó)重要的醫(yī)學(xué)資源寶庫(kù)，具有經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)與副作用較低、療效較好、病人依從性較高等優(yōu)勢(shì)。香參丸出自《奇方類編》，由木香、苦參以及甘草組成，具有清熱燥濕、行氣止痛的功效，常用于治療痢疾。最新研究表明香參丸可用于治療UC［4-5］，但目前關(guān)于香參丸治療UC 的臨床研究相對(duì)較少，且相應(yīng)作用機(jī)制尚未明確，本研究自2023年1—5 月通過生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討香參丸治療UC 的分子機(jī)制，以期為香參丸的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并為其作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料基因表達(dá)綜合（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt（https：//www.uniprot.org/），STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cn.string-db.org/），Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//metascape.org/），Cytoscape3.7.2軟件，GraphPad Prism 9.0 軟件，R 語(yǔ)言4.0.1 軟件，Autodock4.0 軟件，PyMOL2.5軟件。

1.2 方法

1.2.1GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)潰瘍性結(jié)腸炎差異表達(dá)基因篩選 從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索“ Ulcerative colitis”，篩選并下載GSE38713芯片，其平臺(tái)為GPL570，該芯片有43 個(gè)樣本，其中包括13 例健康受試者與15 例活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎病人。以log|FC|≥1，校正P＜0.05 為條件進(jìn)行差異基因表達(dá)分析。

1.2.2加權(quán)共表達(dá)分析 將GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的差異基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入R 語(yǔ)言進(jìn)行加權(quán)共表達(dá)分析，構(gòu)建無標(biāo)度共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。利用R 語(yǔ)言WGCNA 包goodSamplesGenes 方法去除離群的基因和樣本，使用冪函數(shù)a_mn=|C_mn|^β（a_mn：基因與基因的鄰間矩陣；C_mn：所有基因?qū)Φ钠栠d相關(guān)性獲得的相似性矩陣；β：軟閾值）構(gòu)建加權(quán)鄰接矩陣，并轉(zhuǎn)換為拓?fù)渲丿B矩陣（TOM）及其相關(guān)的相似度（1-tom），以最小基因組數(shù)30 和敏感度3 為條件構(gòu)建1-tom 矩陣的層次聚類樹。在與潰瘍性結(jié)腸炎高度相關(guān)的模塊中根據(jù)|MM|＞0.8 篩選獲得潰瘍性結(jié)腸炎的HUB基因。

1.2.3香參丸化學(xué)成分的篩選及其靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“木香”“苦參”以及“甘草”分別作為關(guān)鍵詞對(duì)香參丸的主要化學(xué)成分及其相關(guān)作用靶點(diǎn)進(jìn)行搜索。香參丸的主要化學(xué)成分的篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18。將篩選得到的化學(xué)成分在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢相關(guān)靶點(diǎn)信息，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)將相關(guān)靶點(diǎn)信息轉(zhuǎn)化為基因靶點(diǎn)信息，最終得到243個(gè)基因靶點(diǎn)信息。

1.2.4預(yù)測(cè)香參丸治療UC 的作用靶點(diǎn) 將香參丸UniProt 的基因靶點(diǎn)信息與UC 相關(guān)的HUB 基因信息取交集，篩選出可能共同作用的基因靶點(diǎn)信息并繪制韋恩圖，最終得到37個(gè)共同作用靶點(diǎn)。

1.2.5PPI 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建與分析 將香參丸與UC 的共同靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，蛋白種屬設(shè)置為“ Homo Sapiens”，得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein proteinInteractio，PPI）數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件進(jìn)行進(jìn)一步可視化處理，得到PPI網(wǎng)絡(luò)模型。同時(shí)利用Cytoscape 3.7.2 軟件工具中的Network Analyzer 進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到香參丸與UC交集靶點(diǎn)的度值。

1.2.6KEGG 與GO 通路富集分析 利用Metascape對(duì)香參丸與UC 的共同基因靶點(diǎn)做KEGG 與GO 通路富集分析，蛋白種屬設(shè)置為“ Homo Sapiens”，其中GO 通路包括生物學(xué)過程（biological process，BP），細(xì)胞組分（cellular component，CC），分子功能（molecular function，MF）。將獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步可視化處理得到功能富集氣泡圖。

1.2.7“中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建與分析 將香參丸的主要成分、香參丸與UC的交集靶點(diǎn)信息、Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的KEGG 富集通路信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，構(gòu)建“中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)模型。

1.2.8分子對(duì)接 根據(jù)“中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)模型篩選關(guān)鍵藥物成分及靶點(diǎn)，利用Chem3D MM2 進(jìn)行能量最小化結(jié)構(gòu)優(yōu)化，利用PyMOL 軟件移除水分子、無機(jī)鹽、配體等，通過Autodock軟件對(duì)篩選出的核心藥物成分及核心靶點(diǎn)進(jìn)行半柔性分子對(duì)接預(yù)測(cè)，利用PyMOL 對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理，并通過R 語(yǔ)言pheatmap 包繪制結(jié)合能熱圖。

2 結(jié)果

2.1 潰瘍性結(jié)腸炎差異表達(dá)基因篩選從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE38713 芯片數(shù)據(jù)和GPL570 平臺(tái)數(shù)據(jù)，借助R語(yǔ)言對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。最終獲得潰瘍性結(jié)腸炎差異表達(dá)基因共8 020 個(gè)，其中UC 病人結(jié)腸黏膜組織中上調(diào)基因3 953 個(gè)，下調(diào)基因4 067 個(gè)，根據(jù)UC 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果繪制火山圖與熱圖（圖1）。圖1A 中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，其中紅色代表UC 中上調(diào)的基因，綠色代表UC 中表達(dá)下調(diào)的基因。圖1B 中橫坐標(biāo)為樣本信息，縱坐標(biāo)為基因名，每一個(gè)色塊代表基因在該樣本的表達(dá)量。

圖1 潰瘍性結(jié)腸炎差異表達(dá)基因：A為潰瘍性結(jié)腸炎病人結(jié)腸黏膜與正常結(jié)腸黏膜差異基因火山圖；B為結(jié)腸黏膜與正常結(jié)腸黏膜差異基因熱圖

2.2 潰瘍性結(jié)腸炎差異表達(dá)基因加權(quán)共表達(dá)分析利用函數(shù)pick Soft Threshold選擇軟閾值構(gòu)建無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)（圖2），圖2 中A 和B 的橫坐標(biāo)為軟閾值，縱坐標(biāo)分別為相關(guān)系數(shù)和基因連接數(shù)的均值，如圖2 所示β=14 時(shí)相關(guān)系數(shù)為0.85，基因連接數(shù)均值為38.13，因此選擇β=14 構(gòu)建無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)。模塊特征向量分析中共篩選得到4個(gè)加權(quán)基因模塊（圖3），圖3 的B 中橫坐標(biāo)代表分組情況，其中藍(lán)色為正常結(jié)腸黏膜，紅色代表UC 病人的結(jié)腸黏膜，縱坐標(biāo)代表聚類的模塊，圖中左上角的三角色塊代表相關(guān)性，右下角三角色塊代表顯著性，其中青色模塊和粉色模塊在UC 與正常組的結(jié)腸黏膜之間相關(guān)性高，所以選取青色模塊中的796 個(gè)基因和粉色模塊中的954 個(gè)基因共1 750 個(gè)基因用于后續(xù)香參丸治療UC的靶點(diǎn)分析。圖3 的C 為青色模塊基因與UC 相關(guān)性的散點(diǎn)圖，可見基因集中于y=x 上，位于圖片中央，與UC高度相關(guān)。

圖2 潰瘍性結(jié)腸炎差異表達(dá)基因篩選的散點(diǎn)圖：A為軟閾值與標(biāo)度獨(dú)立性散點(diǎn)圖；B為軟閾值與標(biāo)度連通性散點(diǎn)圖

圖3 潰瘍性結(jié)腸炎差異表達(dá)基因加權(quán)共表達(dá)分析：A為加權(quán)共表達(dá)分析基因聚類樹；B為聚類模塊與潰瘍性結(jié)腸炎（UC）相關(guān)性熱圖；C 為cyan青色模塊基因與UC相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.3 香參丸主要化學(xué)成分的篩選與其靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 為篩選條件利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)分別檢索“木香”“苦參”以及“甘草”獲取有效成分，共得到木香主要有效成分6個(gè)，苦參主要有效成分45 個(gè)，甘草主要有效成分92 個(gè)，經(jīng)去除重復(fù)項(xiàng)后共得到香參丸主要有效成分136 個(gè)。利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索其主要成分相關(guān)作用靶點(diǎn)，經(jīng)去除重復(fù)項(xiàng)、UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)化并以“ Reviewed”“ Human”為條件篩選后得到香參丸主要作用靶點(diǎn)243個(gè)。

2.4 香參丸與UC 共同作用靶點(diǎn)的獲取將UC 的1 750 個(gè)靶點(diǎn)與香參丸的243 個(gè)活性成分靶點(diǎn)信息繪制成韋恩圖（圖4），其中左側(cè)圓圈代表香參丸的活性成分靶點(diǎn)，右側(cè)圓圈為UC 的相關(guān)靶點(diǎn)，交集部分為香參丸與UC的共同靶點(diǎn)共37個(gè)。

圖4 香參丸與UC的共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將香參丸與UC 的37個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“ Homo Sapiens”，分析得到PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化（圖5）。該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的顏色越深、越靠近中心，大小越大代表其度值越高且同一圓圈上的靶點(diǎn)的度值從大到小以逆時(shí)針為順序進(jìn)行排列。每條邊則是代表PPI 網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系，線條越多關(guān)聯(lián)度越大。

圖5 香參丸與潰瘍性結(jié)腸炎共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 KEGG 與GO 通路富集分析使用Metascape網(wǎng)站對(duì)37 個(gè)香參丸與UC 的共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 與GO 通路富集分析。KEGG 富集分析共富集至49 條通路，其中主要的通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE 信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、松弛素信號(hào)通路（Relaxin signaling pathway）、TNF 信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、Toll 樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway）、HIF-1 信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）以及MAPK 信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）等（圖6）。GO 通路分析包括MF、BP、CC 分析，所有的富集分析按P值大小從小到大進(jìn)行排序。結(jié)果顯示GO 富集分析BP共有440條、CC共有28條、MF共有30條，涉及的生物學(xué)過程主要有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正調(diào)節(jié)（positive regulation of cell motility）、對(duì)損傷反應(yīng)的調(diào)節(jié)（regulation of response to wounding）、血管生成調(diào)節(jié)（regulation of angiogenesis）等。分子功能夠涉及絲氨酸型內(nèi)肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、生長(zhǎng)因子的結(jié)合（growth factor binding）、核受體結(jié)合（nuclear receptor binding）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）等。細(xì)胞組分涉及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）、細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)域（serine-type peptidase complex）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（endoplasmic reticulum lumen）等（圖7）。

圖6 香參丸與潰瘍性結(jié)腸炎共同靶點(diǎn)KEGG富集氣泡圖

圖7 香參丸與潰瘍性結(jié)腸炎共同靶點(diǎn)GO富集分析：A為 GO BP分析；B 為GO CC分析；C 為GO MF分析

2.7 “中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)將香參丸所含的中藥、37 個(gè)共同作用靶點(diǎn)、含有共同靶點(diǎn)的共90 個(gè)成分、KEGG 富集通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，構(gòu)建“中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)（圖8）。其中橙色方塊形節(jié)點(diǎn)代表香參丸所含的中藥，紅色菱形節(jié)點(diǎn)代表各中藥含有的成分，黃色菱形節(jié)點(diǎn)代表中藥間含有的相同成分，位于網(wǎng)絡(luò)左側(cè)的三個(gè)黃色菱形節(jié)點(diǎn)為甘草和苦參的共同成分，位于網(wǎng)絡(luò)右側(cè)黃色菱形節(jié)點(diǎn)為甘草和木香的共同成分。藍(lán)色橢圓形節(jié)點(diǎn)為香參丸與UC 的共同作用靶點(diǎn)。綠色三角形節(jié)點(diǎn)為KEGG 富集的主要通路。通過Cytoscape 對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的中藥成分及靶點(diǎn)進(jìn)行分析得到對(duì)應(yīng)度值，網(wǎng)絡(luò)度值＞4 的中藥成分度值排名見表1，主要靶點(diǎn)度值排名見圖9。

表1 香參丸治療UC的主要成分

圖8 “中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

圖9 “中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)度值排序圖

2.8 分子對(duì)接利用PubChem 及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（protein data bank，PDB）獲取小分子配體及蛋白質(zhì)受體結(jié)構(gòu)文件，利用Chem3D MM2 進(jìn)行能量最小化結(jié)構(gòu)優(yōu)化，利用PyMOL 軟件移除水分子、配體、無機(jī)鹽等，通過Cytoscape 對(duì)“中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，根據(jù)度值大小排序篩選出度值排名前十的化合物和靶點(diǎn)并利用Autodock 進(jìn)行半柔性對(duì)接（具體排序可見表1及圖9），后通過火山圖對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理，如圖10 所示，橫坐標(biāo)代表靶點(diǎn)，縱坐標(biāo)為化合物，熱圖中的數(shù)字為對(duì)接結(jié)合能，平均結(jié)合能為-5.598 6 kCal/mol，結(jié)果顯示對(duì)接良好。結(jié)合能排名前四的對(duì)接為MMP2和甘草查爾酮B（Licochalcone B，結(jié)能為-7.00 kCal/mol）、PDE3A 和豆甾醇（Stigmasterol，結(jié)合能為-6.97 kCal/mol）、MMP2 和刺果甘草查耳酮（glypallichalcone，結(jié)合能為-6.92 kCal/mol）、ICAM1 和甘草查爾酮B（Licochalcone B，結(jié)合能為-6.66 kCal/mol），結(jié)果展示見圖11。篩選的核心靶點(diǎn)NOS2、PPARG、PDE3A、IL1B、MMP2、ICAM1、TGFB1、ERBB2、MMP9、STAT1 分別對(duì)應(yīng)的PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)X 衍射晶體結(jié)構(gòu)ID 為5XN3、8B8Y、7LRE、7Z3W、8H78、3E2M、1KLC、3BCZ、5OM6以及8D3F。

圖10 分子對(duì)接結(jié)合能熱圖

圖11 分子對(duì)接圖：A為MMP2和Licochalcone B；B為PDE3A和Stigmasterol；C為MMP2和Glypallichalcone；D為ICAM1和Licochalcone B

3 討論

通過分析香參丸治療UC 的“中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，推測(cè)槲皮素（quercetin）、刺芒柄花素（formononetin）、木犀草素（luteolin）以及山柰酚（kaempferol）等成分可能是香參丸治療UC的主要成分。槲皮素為黃酮醇類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤等藥理作用［6］，而氧化應(yīng)激是UC發(fā)生的重要機(jī)制之一［7］，減輕腸道炎癥以及氧化應(yīng)激反應(yīng)則是治療UC 的重要手段，因此槲皮素已被列為治療UC 的重要候選化合物之一［8］。Riemschneider 等［9］通過用槲皮素治療由葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的UC 小鼠發(fā)現(xiàn)槲皮素可以顯著改善UC 小鼠的癥狀以及結(jié)腸的組織病理學(xué)評(píng)分，經(jīng)槲皮素治療后小鼠的結(jié)腸黏膜上皮炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)減少且腸上皮屏障可以得到一定程度的恢復(fù)。另一項(xiàng)研究表明槲皮素可下調(diào)LCN-2、TNF-α抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而減輕腸道炎癥，發(fā)揮治療UC 的作用［10］。刺芒柄花素是一種異黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［11-12］。Wu 等［13］通過研究證實(shí)刺芒柄花素可通過抑制NLRP3 炎性小體通路（NLRP3、ASC、IL-1β等）蛋白水平，并上調(diào)緊密連接蛋白（ZO-1、claudin-1等）治療經(jīng)DSS 誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎。楊倩等［14］給予UC 小鼠刺芒柄花素后，結(jié)腸的TNF-α、IL-6 以及COX-2 的含量都出現(xiàn)明顯下降，并通過基因敲除等技術(shù)推測(cè)刺芒柄花素可能通過激活Nrf2 的表達(dá)來改善UC 的癥狀。木犀草素和山柰酚與槲皮素一樣也是黃酮類化合物，李越、沈磊［15］發(fā)現(xiàn)木犀草素可以顯著降低UC 小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分（DAI），其機(jī)制可能與激活Nrf2信號(hào)通路、抑制促炎因子TNF-α、IL-6 mRNA 等表達(dá)有關(guān) 。Andrade 等［16］證實(shí)山柰酚和槲皮素可下調(diào)NF-κB 與Toll 樣受體的表達(dá)，使促炎、趨化因子及細(xì)胞黏附分子減少，改善腸道損傷、減少腸道的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。

結(jié)合PPI 網(wǎng)絡(luò)和“中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，推測(cè)NOS2、PPARG、IL1B、MMP2 以及ICAM1等是香參丸治療UC 的靶點(diǎn)。有研究表明NOS2 編碼的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）在UC 病人的結(jié)腸黏膜上被顯著上調(diào)［17］，研究表明iNOS 在炎癥性疾病中發(fā)揮著重要作用，其機(jī)制可能與超氧陰離子相互作用生成過氧亞硝酸鹽破壞腸上皮有關(guān)［18-19］。Bernstein 等［20］則證實(shí)抑制NOS2 可以減輕腸道炎癥，所以NOS2 可能是治療UC 的重要靶點(diǎn)。PPARG為過氧化物酶體增生激活受體，可以激活結(jié)腸上皮細(xì)胞的線粒體增加耗氧量，使結(jié)腸黏膜上皮缺氧壞死并破壞腸道菌群穩(wěn)態(tài)［21-22］，Stephanie 等［23］研究表明5-氨基水楊酸可能通過激活腸上皮中的PPAR-γ發(fā)揮治療UC 的作用，其機(jī)制可能與PPARG 抑制NF-κB 活化［24］和腸黏膜中前列腺素的產(chǎn)生［25］有關(guān)。IL1B 即為IL-1β，為促炎細(xì)胞因子之一，已有許多研究表明其存在與腸道炎癥關(guān)系密切［26-27］。Rawat等［28］證實(shí)IL1B 可以上調(diào)MIR200C-3p 從而增加腸黏膜的緊密連接降低腸細(xì)胞occludin 蛋白的表達(dá)，從而增加緊密連接的通透性。

KEGG 富集分析中主要富集在TNF 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路以及MAPK 信號(hào)通路等。TNF 稱為腫瘤壞死因子，是參與NF-κB通路的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，而NF-κB 信號(hào)通路已被證實(shí)是參與UC 發(fā)生發(fā)展的重要通路之一［29-30］。有研究表明NF-κB 信號(hào)通路可在UC 的腸固有層中的單核細(xì)胞中被激活，參與UC炎癥的產(chǎn)生［31］，目前UC的主要治療藥物柳氮磺胺吡啶和糖皮質(zhì)激素的作用機(jī)制之一就是抑制NF-κB 信號(hào)通路的表達(dá)［32］。“中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)分析得到的關(guān)鍵成分如槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素等都能通過調(diào)節(jié)核因子NF-κB 的表達(dá)來抑制腸道炎癥反應(yīng)減少腸道損傷［14，16］。關(guān)鍵靶點(diǎn)PPARG 也被證實(shí)可以抑制NF-κB 活化［24］，且NF-κB 信號(hào)通路的激活則會(huì)通過LPS/IFN-γ 或IL-1β/IFN-γ 誘導(dǎo)關(guān)鍵靶點(diǎn)iNOS 的表達(dá)［33］，所以富集得到的TNF 信號(hào)通路與篩選出的關(guān)鍵成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)相吻合。Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）是一種跨模信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與人體免疫、炎癥反應(yīng)。有研究表明TLR 可以與相應(yīng)的配體結(jié)合，激活TLR-NF-κB 信號(hào)通路，介導(dǎo)IFN-γ、TNF、IL-1β 等因子的釋放［34］，目前研究認(rèn)為TLR4/NF-κB 信號(hào)通路是UC 發(fā)生發(fā)展的重要信號(hào)通路之一，且如山柰酚等香參丸的關(guān)鍵成分也可作用于TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)結(jié)腸的保護(hù)作用［35］，所以Toll 樣受體信號(hào)通路可能是香參丸作用于UC 的潛在通路。缺氧誘導(dǎo)因子HF-1 在缺氧狀態(tài)下可被誘導(dǎo)產(chǎn)生，活化后可形成HF-1α 介導(dǎo)炎癥、氧化應(yīng)激等反應(yīng)。蘇淑伶等［36］表明HIF-1α、COX-2 等因子水平與UC 病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可為臨床診斷及臨床治療評(píng)估提供可靠依據(jù)。Tang 等［37］則研究證實(shí)HF-1α 可激活NF-κB 信號(hào)通路，從而介導(dǎo)NLRP3炎癥小體產(chǎn)生，引起一系列級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)，所以HIF-1 信號(hào)通路與TNF 信號(hào)通路息息相關(guān)。如今，MAPK 信號(hào)通路在IBD 中的作用已被許多研究所證實(shí)，成為研究治療IBD 的經(jīng)典通路之一［38-39］。在UC中MAPK 信號(hào)通路可以調(diào)控下游的能調(diào)控下游的NF-κB 信號(hào)通路，介導(dǎo)TNF-α、IL-6、IL-1等炎癥因子的釋放、嗜中性粒細(xì)胞活化和細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)NO的表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)INOS活性［40-41］。

綜上所述，香參丸主要成分槲皮素、刺芒柄花素、木犀草素以及山柰酚等可能通過TNF 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路以及MAPK 信號(hào)通路作用于NOS2、PPARG、IL1B、MMP2以及ICAM1等靶點(diǎn)發(fā)揮治療UC的作用。