柴胡提取物及其所含皂苷a和皂苷d對(duì)小鼠骨骼增長(zhǎng)的作用比較

梁國(guó)輝，靳國(guó)強(qiáng)，呂艷艷，謝艷

作者單位：河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院）髖關(guān)節(jié)外五科，河南 洛陽(yáng)471002

如今，孩子們的身高問(wèn)題越來(lái)越成為了家長(zhǎng)們關(guān)注的重點(diǎn)。兒童身高增長(zhǎng)的方法很多，其中包括體育鍛煉、睡眠、健康飲食等［1］。隨著中醫(yī)藥健康養(yǎng)生理念的普及，中醫(yī)藥干預(yù)兒童身高增長(zhǎng)研究逐漸被關(guān)注，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為兒童身高增長(zhǎng)的重中之重就是疏肝理氣，在此基礎(chǔ)上輔以睡眠和鍛煉，才能事半功倍［2］。柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根，具有解表退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣的功效，現(xiàn)代研究表明柴胡具有多種生物學(xué)活性，有著較為廣泛的臨床用途［3］。我們的前期實(shí)驗(yàn)顯示，柴胡提取物可以促進(jìn)動(dòng)物體長(zhǎng)的增長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)提高腦組織5-羥色胺（5-HT）含量升高，延長(zhǎng)慢波睡眠時(shí)長(zhǎng)，從而促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌引起的，其促進(jìn)慢波睡眠的主要活性成分為皂苷類成分［4］。柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 為柴胡的主要活性成分［5］。本研究于2021年3月至2022年1月在前期實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定柴胡提取物中皂苷a和皂苷d的含量，探討柴胡提取物在延長(zhǎng)動(dòng)物慢波睡眠時(shí)長(zhǎng)中起主導(dǎo)作用的活性成分，為進(jìn)一步驗(yàn)證柴胡促進(jìn)骨骼增長(zhǎng)的分子機(jī)制提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康昆明種小鼠40 只，SPF 級(jí)，雄性，25 日齡，體質(zhì)量15～17g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（豫）2017-0001。由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～24 ℃，濕度50%～70%，12 h 明暗交替，光照7：00～19：00，噪音＜50 dB。

1.2 藥物與試劑柴胡提取物，由西安四季生物技術(shù)有限公司提供（批號(hào)STC160910-05），使用時(shí)按照0.94 mg/g 體質(zhì)量灌胃。柴胡皂苷a 標(biāo)準(zhǔn)品，柴胡皂苷d 標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院生產(chǎn)，批號(hào)18072507，18030501）；酸棗仁皂苷A標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院生產(chǎn)，批號(hào)A0274），按照0.013 mg/g 體質(zhì)量灌胃，使用時(shí)藥物用純凈水溶解。RIPA細(xì)胞裂解液（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)KI-4741.362）；SDS（Sigma 批號(hào)20160105487）；小鼠5-HT ELISA 試劑盒（上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)201510）；小鼠生長(zhǎng)激素ELISA 試劑盒（上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)201511）；TPH2 一抗（abcam 公司ab44635）；驢抗兔二抗（abcam 公司ab16284）；硝酸纖維素膜（美國(guó)PALL公司提供）。

1.3 主要儀器島津LC-20AT 系列高效液相色譜儀 （日本島津），浙大N-2000 色譜工作站， UV-1800紫外分光光度計(jì)（日本島津），BSA6325-CW 電子天平。離心機(jī)（北京雷博爾離心機(jī)有限公司，LDZ5-2型）；酶標(biāo)儀（Labsystems Multiskan MS，芬蘭，352型）；VE-186 型轉(zhuǎn)膜儀；VE-180 型電泳槽（Tanon）；EPS300型電泳儀（Tanon）。

1.4 方法

1.4.1柴胡提取物中柴胡皂苷a 與d 含量的檢測(cè)供試品溶液的制備：精密稱取柴胡提取物1.001 5 g，25 mL 5%氨水甲醇超聲提取30 min，過(guò)濾，20 mL 甲醇分兩次洗滌藥渣和容器，過(guò)濾，合并濾液。所得樣品揮干溶劑，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，定容為5 mL，即得。對(duì)照品溶液濃度：柴胡皂苷a 濃度為0.400 5 g/L，柴胡皂苷d濃度為0.501 2 g/L。

色譜條件：以Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ（250 mm ×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～1 min，25%→90% A；50～55 min，90% A→10% A），檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，對(duì)照品溶液進(jìn)樣量為5 μL，供試品溶液進(jìn)樣量為10 μL。

1.4.2動(dòng)物分組 昆明種小鼠40 只隨機(jī)數(shù)字表法分為健康對(duì)照組、柴胡皂苷a 組（簡(jiǎn)稱皂苷a 組）、柴胡皂苷d 組（簡(jiǎn)稱皂苷d 組）、柴胡提取物組（簡(jiǎn)稱提取物組）和陽(yáng)性對(duì)照組，每組8只。健康對(duì)照組灌胃去離子水，皂苷a 組灌胃柴胡皂苷a1.15 μg/g 體質(zhì)量，皂苷d 組灌胃柴胡皂苷d 0.2 μg/g 體質(zhì)量，提取物組按照0.94 mg/g 體質(zhì)量灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃酸棗仁皂苷a 0.013 mg/g體質(zhì)量灌胃。

1.4.3給藥后各組小鼠腦組織色氨酸羥化酶2（tryptophan hydroxylase 2，TPH2）含量變化 灌胃25 d 后，于末次給藥30 min 后取腦組織稱重，取1/3腦組織，稱重，RIPA充分裂解提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。在收集的蛋白樣品中加入等量的2×SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱10 min，充分變性蛋白。待樣品冷卻到室溫，將蛋白樣品上樣到SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)，每孔15 μL。濃縮膠電壓為80 V，時(shí)間30 min；分離膠電壓為120 V，時(shí)間1.5 h。將預(yù)先裁好的膠條同樣大小的濾紙和PVDE 在甲醇中浸泡3 min，然后浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5 min。按照陽(yáng)極板、3 層濾紙、PVDE 膜、凝膠、3 層濾紙、陰極板的順序放好轉(zhuǎn)膜裝置，每一步都除去氣泡。接通電源進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。然后立即把蛋白膜放置到Western 洗滌液中漂洗5 min。加入5%脫脂奶粉，在搖床上緩慢搖動(dòng)1 h，進(jìn)行封閉。按照說(shuō)明書(shū)，用一抗稀釋液進(jìn)行稀釋；4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜。加入洗滌液，10 min每次，×3 次。參考二抗說(shuō)明書(shū)，按照1∶10 000 的比例用二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志的二抗，室溫封閉2 h，TBST 洗滌液進(jìn)行洗滌，10 min 每次，×3次。凝膠成像分析系統(tǒng)成像，檢測(cè)蛋白印記條帶。

1.4.4小鼠給予藥物后腦組織5-羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）及生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）表達(dá) 取1/3 腦組織，以腦組織∶PBS=1∶9的比例加入勻漿器內(nèi)，于冰上勻漿，然后2 000 r/min離心10 min，取上清，按照ELISA 操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)各組5-HT及GH表達(dá)情況。

1.4.5小鼠給藥后對(duì)腦組織5-HT 與5-羥色胺1A受體（5-hydroxyl tryptamine 1A receptor，5-HT1AR）結(jié)合活性及脛骨長(zhǎng)度的影響 取1/3 腦組織加入PBS 緩沖液，低溫12 000 r/min 離心30 min，棄上清，離心3 次，沉淀加入3 mL Tris-HCL 緩沖液，勻漿混合后放于37 ℃水浴鍋中孵育10 min 后，4 ℃12 000 r/min 離心30 min，棄上清，將沉淀用1.8 mL 的Tris-HCL反應(yīng)液勻漿混勻后加樣。孵育30 min，0 ℃冰冷的Tris 檸檬酸緩沖液負(fù)壓抽濾，將濾膜置于閃爍杯中，加入甲苯-TritonX-100 閃爍液5 mL，放置過(guò)夜，于閃爍計(jì)數(shù)儀上測(cè)定發(fā)生性（cpm 值）。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定突觸膜中的蛋白的濃度，計(jì)算3H-Muscimol 的結(jié)合量（以每毫克蛋白質(zhì)結(jié)合的3H-Muscimol 的克分子數(shù)表示）。特異性結(jié)合量=樣品總結(jié)合-非特異性結(jié)合。

然后剝離小鼠下肢，取脛骨，剔除附著的軟組織，用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組小鼠脛骨長(zhǎng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用 SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用LSD 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柴胡提取物中柴胡皂苷a與d含量的檢測(cè)根據(jù)高效液相圖譜結(jié)果，計(jì)算得到柴胡取物中柴胡皂苷a 含量為1.22 mg/g，柴胡皂苷d 含量為0.22 mg/g，見(jiàn)圖1。

圖1 柴胡皂苷提取物及對(duì)照品色譜圖：A為柴胡皂苷提取物；B為柴胡皂苷a；C為柴胡皂苷d

2.2 對(duì)小鼠腦組織中TPH2 蛋白含量的影響蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與健康對(duì)照組比較，提取物組和皂苷a 組小鼠腦組織TPH2 表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組；皂苷d組小鼠腦組織TPH2表達(dá)與健康對(duì)照組相當(dāng)。說(shuō)明提取物組和皂苷a組均可以引起TPH2蛋白表達(dá)增加。見(jiàn)圖2。

圖2 藥物對(duì)小鼠腦組織TPH2表達(dá)的影響

2.3 小鼠給藥后腦組織5-HT 及GH 含量變化與健康對(duì)照組比較，提取物組、皂苷a組和陽(yáng)性對(duì)照組GH 含量均明顯升高（P＜0.001，＜0.001，＜0.001）；提取物組、皂苷a 組5-HT 含量均明顯升高（P=0.021，0.037）；皂苷d 組5-HT 及GH 表達(dá)與健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.246，P=0.839）。與皂苷a 組比較，皂苷d 組GH 含量明顯減少（P＜0.001）；皂苷d組5-HT 含量減少（P=0.002）。與皂苷d 組比較，提取物組、皂苷a 組和陽(yáng)性對(duì)照組GH 含量明顯增加（P＜0.001，＜0.001，＜0.001）；提取物組和皂苷a 組5-HT含量增加（P=0.001，0.002）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠腦組織5-羥色胺（5-HT）、生長(zhǎng)激素（GH）含量比較/（μg/L， ± s）

表1 各組小鼠腦組織5-羥色胺（5-HT）、生長(zhǎng)激素（GH）含量比較/（μg/L， ± s）

注：①與正常對(duì)照比，P＜0.05。②與皂苷a 組比較，P＜0.05。③與皂苷d組比較，P＜0.05。

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2.4 ELISA 法檢測(cè)活體給藥后5-HT1AR 與5-HT結(jié)合活性及脛骨長(zhǎng)度與健康對(duì)照組比較，提取物組、皂苷a組和陽(yáng)性對(duì)照組5-HT1AR 與5-HT 結(jié)合活性均明顯升高（P=0.005，0.039，0.011）；與皂苷a 組比較，皂苷d 組5-HT1AR 與5-HT 結(jié)合活性下降（P=0.002）；與皂苷d 組比較，提取物組和皂苷a 組及陽(yáng)性對(duì)照組升高5-HT1AR 與5-HT 結(jié)合活性明顯升高（P＜0.001，P=0.002）；與健康對(duì)照組比較，提取物組和皂苷a 組小鼠脛骨長(zhǎng)度明顯增加（P=0.025，0.028）；陽(yáng)性對(duì)照組小鼠脛骨長(zhǎng)度與健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.195）。與皂苷a 組比較，健康對(duì)照組小鼠脛骨長(zhǎng)度明顯下降（P=0.028），皂苷d 組小鼠脛骨長(zhǎng)度下降（P=0.001）；與皂苷d 組比較，提取物組和皂苷a 組小鼠脛骨長(zhǎng)度增加明顯升高（P=0.001，0.001），陽(yáng)性對(duì)照組升高（P=0.011）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠腦組織5-羥色胺1A受體（5-HT1AR）與5-羥色胺（5-HT）結(jié)合活性及脛骨長(zhǎng)度/± s

表2 各組小鼠腦組織5-羥色胺1A受體（5-HT1AR）與5-羥色胺（5-HT）結(jié)合活性及脛骨長(zhǎng)度/± s

注：①與正常對(duì)照比，P＜0.05。②與皂苷a 組比較，P＜0.05。③與皂苷d組比較，P＜0.05。

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3 討論

孩子的身高是家長(zhǎng)關(guān)注的焦點(diǎn)之一。引起兒童身材矮小的關(guān)鍵因素除了遺傳及疾病因素外，還有營(yíng)養(yǎng)狀況、情緒、睡眠、運(yùn)動(dòng)等。中藥配合運(yùn)動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)綜合干預(yù)，可以使兒童身高明顯增加，改善病兒體質(zhì)，是促生長(zhǎng)的一種良好方法。在中醫(yī)理論里，營(yíng)養(yǎng)性矮小癥與五臟均有關(guān)，脾腎最為密切相關(guān)，唯有脾運(yùn)正常，而后肝血才能充足，其疏泄條達(dá)之用可正常；若肝氣郁結(jié)，橫克脾土，脾胃受損則生化乏源，可能造成部分性和暫時(shí)性的生長(zhǎng)激素缺乏，病兒會(huì)出現(xiàn)骨齡延遲，影響生長(zhǎng)發(fā)育［6］；現(xiàn)代研究表明，身高增長(zhǎng)依賴于生長(zhǎng)激素和甲狀腺激素［7］。生長(zhǎng)激素由腦垂體分泌，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)肝臟，并刺激肝臟分泌一種生長(zhǎng)素介質(zhì)—胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor ，IGF-1），可以作用于骺軟骨，使軟骨細(xì)胞分裂、鈣化后沉積，進(jìn)而促進(jìn)全身骨骼的發(fā)育，對(duì)身高的增長(zhǎng)非常重要［8］。

柴胡性微寒，味辛、苦，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有和解表里，疏肝解郁，升舉陽(yáng)氣的功效，《本草綱目》介紹柴胡：“肝氣不舒暢者此能舒之”，柴胡能疏通少陽(yáng)之木氣，而少陽(yáng)之氣能影響到肝臟的功能。臨床上柴胡可以治療肝郁不通、膽道疾病、月經(jīng)不調(diào)之癥。常見(jiàn)的中藥方劑逍遙散、柴胡疏肝散等，在中醫(yī)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛，而且價(jià)格便宜，原料易得，是一種很好的中藥材［9］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，柴胡提取物可以通過(guò)提高腦組織5-HT 含量促進(jìn)其與5-HT1AR 結(jié)合從而促進(jìn)慢波睡眠，提高生長(zhǎng)激素的分泌，進(jìn)而促進(jìn)骨骼增長(zhǎng)。但是柴胡提取物的發(fā)揮藥理作用的主要成分尚不明了?，F(xiàn)代研究表明柴胡皂苷為柴胡的主要化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理作用研究表明柴胡皂苷a 能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子及相關(guān)通路，增強(qiáng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，改善神經(jīng)遞質(zhì)水平及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，下調(diào)下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能發(fā)揮抗抑郁作用［10-11］。因此，柴胡提取物延長(zhǎng)慢波睡眠時(shí)長(zhǎng)起關(guān)鍵作用的成分可能為柴胡皂苷a。

研究結(jié)果顯示，柴胡提取物中皂苷a 的含量大于皂苷d 的含量，根據(jù)提取物中柴胡皂苷a 和皂苷d的含量，計(jì)算得出皂苷a組和皂苷d組的用藥劑量分別為柴胡皂苷a1.15 μg/g體質(zhì)量，柴胡皂苷d 0.2 μg/g體質(zhì)量。色氨酸羥化酶（TPH）是5-HT 合成的限速酶，它的主要作用是催化色氨酸（TP）轉(zhuǎn)化成5-羥色氨酸（5-HTP），從而控制了5-HT 的合成。TPH 分為兩種：TPH1和TPH2，TPH1主要表達(dá)在外周神經(jīng)，而TPH2主要表達(dá)在中樞神經(jīng)，研究發(fā)現(xiàn)，腦組織TPH2表達(dá)增加，可以使腦內(nèi)5-HT含量升高［12］。與健康對(duì)照組比較，提取物組和皂苷a組TPH2蛋白含量明顯增加，柴胡皂苷d 組與健康對(duì)照組相當(dāng)。表明柴胡皂苷a 可以引起TPH2 蛋白表達(dá)增加，柴胡皂苷d 對(duì)TPH2 蛋白表達(dá)無(wú)影響。生長(zhǎng)激素的分泌主要與睡眠有關(guān)，有研究表明慢波睡眠是釋放生長(zhǎng)激素的必要條件，而慢波睡眠的啟動(dòng)和5-羥色胺有關(guān)［13］。有研究表明通過(guò)藥物調(diào)控提高5-HT含量，可以增加慢波睡眠時(shí)間，促進(jìn)GH 的分泌，是臨床促進(jìn)骨骼增長(zhǎng)的有效途徑之一［14］。 有研究表明，5-HT 必需與其受體結(jié)合才可以發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［15］。5-HT1A 受體是5-HT受體中最大的一組受體亞型，5-HT1AR與情緒、焦慮、精神障礙、睡眠以及藥物代謝等有關(guān)，和5-HT2A受體功能相拮抗［13］。本研究結(jié)果顯示，提取物組和柴胡皂苷a 組的5-HT、GH 含量和腦組織5-HT1AR 與5-HT 結(jié)合活性及脛骨長(zhǎng)度均明顯高于健康對(duì)照組，柴胡皂苷d 組的5-HT、GH 含量和腦組織5-HT1AR 與5-HT 結(jié)合活性及脛骨長(zhǎng)度與健康對(duì)照組比較，增加不顯著。與皂苷a 組比較，皂苷d 組的5-HT 含量、5-HT1AR 與5-HT 結(jié)合活性及脛骨長(zhǎng)度減少，GH 含量明顯減少。因此，筆者認(rèn)為柴胡提取物延緩慢波睡眠時(shí)長(zhǎng)的主要成分為柴胡皂苷a，其可能機(jī)制為柴胡皂苷a通過(guò)提高腦組織色氨酸羥化酶蛋白高表達(dá)，從而促進(jìn)5-HT 的分泌，增強(qiáng)5-HT1AR 與5-HT 結(jié)合活性，延緩慢波睡眠時(shí)長(zhǎng)，提高生長(zhǎng)激素的分泌，促進(jìn)小鼠骨骼增長(zhǎng)。