施氮對(duì)紫花苜蓿干旱復(fù)水后生長(zhǎng)恢復(fù)能力的影響

臧軍蕊，張鈺婷，張英豪，劉洋銘，鄧文慧，劉世鵬，孫孌姿

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院, 陜西 楊凌 712100；2.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 延安 716000）

氣候變化正在改變?nèi)虻慕邓窬郑珊蛋l(fā)生的頻率不斷增加，干旱已成為限制植物生長(zhǎng)的主要脅迫之一[1]。植物對(duì)干旱的適應(yīng)表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是抗旱性，即干旱下保持正常生理功能和生長(zhǎng)水平的能力；二是恢復(fù)能力，即復(fù)水后恢復(fù)到正常生長(zhǎng)水平的能力[2]。紫花苜蓿(Medicago sativa)因營(yíng)養(yǎng)價(jià)值好、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為“牧草之王”。然而，紫花苜蓿耗水量大，栽培過(guò)程中常受到干旱脅迫[3]，降水和灌溉使“干旱－復(fù)水”成為紫花苜蓿生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常面對(duì)的環(huán)境變化。因此，干旱的適應(yīng)性是決定紫花苜蓿高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的關(guān)鍵。

干旱抑制植物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收，從而影響植物的生長(zhǎng)。然而，植物在復(fù)水后卻表現(xiàn)出不同的恢復(fù)能力。研究表明，同未受干旱的植物相比，經(jīng)歷干旱復(fù)水的植物，其抗逆性和水分利用效率會(huì)有所提高[4-5]，生長(zhǎng)速度加快，發(fā)生“補(bǔ)償性生長(zhǎng)”。也有研究表明，由于干旱時(shí)造成的損傷，植物復(fù)水后則無(wú)法恢復(fù)至正常水平。植物復(fù)水后的恢復(fù)能力與一系列因素有關(guān)，如干旱程度和持續(xù)時(shí)間等[6]。施氮是生產(chǎn)實(shí)踐中常見(jiàn)的栽培措施。增施氮肥不但能有效提高作物產(chǎn)量[7-8]，也可以增強(qiáng)作物的抗旱性[9]。干旱脅迫下，合理增施氮肥能夠促進(jìn)根系的生長(zhǎng)，提高對(duì)各層土壤水分的吸收利用[10-11]。但是，不同施氮水平對(duì)紫花苜蓿復(fù)水后生長(zhǎng)恢復(fù)能力的作用尚未闡明。

碳代謝是決定植物復(fù)水后生長(zhǎng)恢復(fù)能力的重要因素。Guo 等[12]研究表明，干旱下，為了獲取更多的土壤水分和養(yǎng)分，植物會(huì)促進(jìn)根系的生長(zhǎng)并增加根中糖類(lèi)的積累；復(fù)水后，由于“干旱記憶”，植物依舊將光合產(chǎn)物和營(yíng)養(yǎng)優(yōu)先向根部分配，提高了根冠比(root shoot ratio，R/S)以及根中糖類(lèi)和養(yǎng)分的儲(chǔ)備，從而加快了植物的生長(zhǎng)速度，發(fā)生“補(bǔ)償性生長(zhǎng)”。蔗糖作為光合產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)闹饕螒B(tài)，葉片中蔗糖的合成和根中蔗糖的分解決定著干物質(zhì)以及糖類(lèi)的分配[12]。葉片中，蔗糖可由己糖通過(guò)蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)生成，或由果糖和葡萄糖通過(guò)蔗糖合成酶(sucrose synthetase，SS)轉(zhuǎn)化生成。蔗糖運(yùn)輸?shù)礁岛?，可在酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase，AI)的作用下水解，被植物所利用[13-14]。

基于此，本試驗(yàn)在不同氮水平上通過(guò)添加聚乙二醇-6000 (PEG)模擬干旱－復(fù)水，測(cè)定紫花苜蓿R/S、地上和地下部可溶性糖和淀粉含量，以及參與蔗糖代謝主要酶的活性，研究施氮對(duì)紫花苜蓿復(fù)水后糖代謝的影響，揭示施氮對(duì)紫花苜蓿復(fù)水后生長(zhǎng)恢復(fù)能力的作用機(jī)理，為干旱背景下紫花苜蓿栽培管理措施的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物培養(yǎng)與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試材料為紫花苜蓿‘WL168HQ’ (北京正道)。挑選籽粒飽滿且大小均一的種子，在75%乙醇浸種消毒8 min 后，用蒸餾水沖洗4～5 次，置于鋪有兩層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中。待紫花苜蓿長(zhǎng)出真葉后，采用水培法培養(yǎng)。每個(gè)水培盒(長(zhǎng)12 cm，寬8 cm，高11 cm)中培養(yǎng)6 株植物。植物于培養(yǎng)箱中控制條件下培養(yǎng)，溫度(晝/夜)為25 ℃/20 ℃，光周期(晝/夜)為16 h/8 h，光照強(qiáng)度為20 000 lx，相對(duì)濕度為35%～40%。

研究設(shè)置兩個(gè)水分處理(未受干旱、干旱)、兩個(gè)氮素水平(低氮：3 mmol·L-1；高氮：7 mmol·L-1)以及3 個(gè)復(fù)水時(shí)間(干旱結(jié)束時(shí)、復(fù)水初期和復(fù)水后期)處理。植物長(zhǎng)出3～4 片真葉時(shí)置于不同氮素水平下進(jìn)行培養(yǎng)。待植物長(zhǎng)至10 cm 高時(shí)進(jìn)行水分處理。研究通過(guò)培養(yǎng)液中加入10% PEG (滲透壓-0.14 MPa)模擬為期7 d 的干旱，然后替換為不含PEG 的營(yíng)養(yǎng)液，模擬復(fù)水。在替換營(yíng)養(yǎng)液時(shí)，為防止根上PEG 的殘留，用不含PEG 的營(yíng)養(yǎng)液沖洗根系數(shù)次。在干旱結(jié)束時(shí)(0 d)、復(fù)水初期(復(fù)水7 d)以及復(fù)水后期(復(fù)水24 d)進(jìn)行采樣。干旱下，植物的葉片會(huì)有所損傷，而不同氮水平下植物的抗旱性不同，葉片的損傷程度也有所不同。為了減少光合能力損傷對(duì)復(fù)水后生長(zhǎng)恢復(fù)的影響，在復(fù)水7 d 的采樣后，對(duì)余下的紫花苜蓿刈割至3 cm。采樣后，3 株樣品置于烘箱內(nèi)烘干，用于干重以及糖分等指標(biāo)的測(cè)定；另外3 株采樣后立即放入液氮中，隨后保存于-80℃，用于酶活性的測(cè)定。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

采用常規(guī)烘干法，將樣品于105 ℃殺青30 min,于65 ℃烘干至恒重，用萬(wàn)分之一天平測(cè)定其地上和地下部干重，計(jì)算總生物量和根冠比。葉片含水量 = (鮮重 - 干重)/鮮重 × 100%。使用蒽酮比色法[15]測(cè)定可溶性糖和淀粉。植物經(jīng)H2SO4-H2O2消煮后，利用流動(dòng)分析儀測(cè)定植物地上部分總氮。SS、SPS 和AI 活性采用索萊寶試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，采用三因素方差分析(three-way ANOVAs)檢驗(yàn)施氮水平、干旱處理和復(fù)水時(shí)間對(duì)植物生物量、相對(duì)含水量、含氮量、含糖量以及酶活性的作用及交互作用。使用Duncan法對(duì)不同復(fù)水時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析(P＜ 0.05)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用Origin 2021 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物量

干旱、氮素水平和復(fù)水時(shí)間顯著影響植物的總干重，并存在交互作用(表1)。干旱脅迫下，低氮處理的地上與地下部的生長(zhǎng)均有所抑制；高氮處理的總生物量沒(méi)有明顯變化，而地下部生物量有所提高。復(fù)水7 d 時(shí)，低氮處理的地上和地下部生物量分別低于對(duì)照組37.0%和31.0%。盡管高氮處理的地上部生物量也顯著低于其對(duì)照組(P＜ 0.05)，但地下部生物量與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。復(fù)水24 d 時(shí)，低氮處理的生長(zhǎng)仍未恢復(fù)，但是高氮處理已恢復(fù)至正常生長(zhǎng)水平，總生物量高于對(duì)照組11.1%，其中，地下生物量高出對(duì)照組39.0% (圖1)。

圖1 不同氮處理下紫花苜蓿在干旱－復(fù)水中的生物量和根冠比Figure 1 Variation of dry weight and root shoot ratio in alfalfa with different nitrogen treatments under drought and subsequent rewatering

表1 干旱處理、復(fù)水時(shí)間和氮素水平對(duì)紫花苜蓿各指標(biāo)影響的方差分析Table 1 Three-way ANOVA analysis of the parameters between water treatment, rewatering time, and N levels

干旱脅迫顯著改變了植物的R/S，但對(duì)不同氮水平下植物的作用有所不同(表1)。干旱下，低氮和高氮處理的R/S 較其對(duì)照均顯著提高(P＜ 0.05)，其中低氮處理的R/S 提高了27.2%，高氮處理的R/S 提高了65.7%。復(fù)水7 d 時(shí)，低氮和高氮處理的R/S 依舊高于對(duì)照組。但在復(fù)水24 d 時(shí)，低氮處理的R/S 低于其對(duì)照組7.8%，高氮處理的R/S 依舊顯著高于其對(duì)照組(P＜ 0.05) (圖1)。

2.2 葉片含水量和地上部氮含量

干旱結(jié)束時(shí)，低氮處理的葉片含水量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)，而高氮處理的含水量顯著低于對(duì)照組(P＜ 0.05)。復(fù)水后7 d 以及24 d，兩個(gè)氮水平下植物的含水量與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(圖2)。

圖2 不同氮處理下紫花苜蓿在干旱－復(fù)水中的葉片含水量和地上氮含量Figure 2 Variation of leaf water content and shoot nitrogen content in alfalfa with different nitrogen treatments under drought and subsequent rewatering

干旱顯著影響植物的地上含氮量，并與復(fù)水時(shí)間以及氮素水平存在顯著的交互作用(表1)。干旱下，低氮和高氮處理的地上含氮量均較其對(duì)照顯著降低(P＜ 0.05)。復(fù)水7 d 時(shí)，低氮處理的地上含氮量與其對(duì)照組無(wú)顯著差異，而高氮處理顯著低于其對(duì)照組(P＜ 0.05)。復(fù)水24 d 時(shí)，兩個(gè)氮素水平下植物的地上含氮量均有所提高，分別提高18.3%和8.6% (P＞ 0.05) (圖2)。

2.3 可溶性糖和淀粉含量

干旱與氮素水平對(duì)植物地上和地下的可溶性糖含量具有顯著的交互作用(表1)。從干旱結(jié)束到復(fù)水24 d，低氮處理的地上可溶性糖含量均高于其對(duì)照組，而高氮處理的地上可溶性糖含量從未顯著高于其對(duì)照組(圖3)。地下部可溶性糖含量則有著相反的變化趨勢(shì)，低氮處理的地下可溶性糖含量從未顯著高于其對(duì)照組，而高氮處理的地下可溶性糖含量在干旱結(jié)束以及復(fù)水24 d 時(shí)顯著高于其對(duì)照組(P＜ 0.05)。

圖3 不同氮處理下紫花苜蓿在干旱－復(fù)水中的可溶性糖和淀粉含量Figure 3 Variation of soluble carbohydrate and starch content of shoot and root in alfalfa with different nitrogen treatments under drought and subsequent rewatering

干旱和氮素水平顯著影響紫花苜蓿的淀粉含量，并存在交互作用(表1)。在干旱－復(fù)水過(guò)程中，除干旱時(shí)期，低氮和高氮處理的地上淀粉含量一直高于其對(duì)照組(圖3)。與地上部變化趨勢(shì)不同，低氮處理的地下淀粉含量從未顯著升高，而高氮處理的地下淀粉含量始終顯著高于其對(duì)照組(P＜ 0.05)。

2.4 蔗糖代謝相關(guān)酶活性

干旱、復(fù)水時(shí)間以及氮素處理均對(duì)葉片SS 活性有顯著影響(表1)。干旱對(duì)兩個(gè)氮素水平下的SS活性均無(wú)顯著影響(圖4)。復(fù)水7 d，兩個(gè)氮素水平下植物的SS 酶活性均顯著高于其對(duì)照組。復(fù)水24 d時(shí)，低氮處理的SS 活性與其對(duì)照組無(wú)顯著差異，而高氮處理的SS 活性依舊顯著高于其對(duì)照組(P＜0.05)。

圖4 不同氮處理下紫花苜蓿在干旱－復(fù)水中的葉片蔗糖合成酶，磷酸蔗糖合成酶和根部酸性轉(zhuǎn)化酶活性Figure 4 Variation of activity of leaf sucrose synthetase, sucrose phosphate synthase,and root acid invertase in alfalfa with different nitrogen treatments under drought and subsequent rewatering

植物的SPS 活性受到干旱、氮素水平以及復(fù)水時(shí)間及其交互作用的影響(表1)。干旱下，兩個(gè)氮素水平植物的SPS 活性均顯著升高(圖4)。復(fù)水7 d，低氮處理的SPS 活性依舊高于其對(duì)照組，但高氮處理的SPS 活性則顯著低于其對(duì)照組(P＜ 0.05)。復(fù)水24 d，兩個(gè)氮素水平植物的SPS 酶活性均顯著低于其對(duì)照組(P＜ 0.05)。

干旱、氮素水平、復(fù)水時(shí)間對(duì)植物AI 活性均有顯著影響，并存在交互作用(表1)。干旱對(duì)兩個(gè)氮素下植物的AI 活性均無(wú)顯著影響(圖4)。復(fù)水7 d 時(shí)，兩個(gè)氮素水平下植物的AI 活性均顯著上升(P＜ 0.05)。復(fù)水24 d 時(shí)，低氮處理依舊保持著較高的AI 酶活性，而高氮處理的AI 活性顯著下降(P＜0.05)。

3 討論

3.1 施氮對(duì)紫花苜蓿復(fù)水后生長(zhǎng)恢復(fù)能力的影響

干旱使植物氣孔關(guān)閉，因此兩個(gè)氮水平下植物的生長(zhǎng)均受到抑制。復(fù)水7 d 時(shí)，由于葉片光化學(xué)和葉肉導(dǎo)度在干旱時(shí)受到了損傷[16]，兩個(gè)氮水平下紫花苜蓿的生長(zhǎng)依舊均低于正常水平(圖1)。復(fù)水24 d 時(shí)，低氮水平下紫花苜蓿的干重仍然低于其對(duì)照組，而高氮水平下紫花苜蓿的干重則超過(guò)其對(duì)照組，說(shuō)明施氮有利于植物復(fù)水后的生長(zhǎng)恢復(fù)。植物復(fù)水后的生長(zhǎng)恢復(fù)情況與兩方面有關(guān)，一是植物的抗旱性，與低氮處理相比，高氮處理具有更強(qiáng)的抗旱性，在干旱中受到的影響較小，因而更易從干旱中恢復(fù)；二是植物復(fù)水后的生理功能，復(fù)水后，高氮處理植物的分蘗再生能力顯著增大[17-18]，水分利用效率提高[8]，內(nèi)源保護(hù)酶活性增強(qiáng)[19]，因而生長(zhǎng)速度加快[20]，使植物快速恢復(fù)至正常生長(zhǎng)水平。

3.2 施氮對(duì)紫花苜蓿干旱復(fù)水后根冠比、非結(jié)構(gòu)性碳水化合物、含氮量的影響

R/S 決定著植物對(duì)水分的吸收能力。干旱下，與低氮處理相比，高氮處理的植物更為明顯地提高了R/S，這與Wang 等[21]研究結(jié)果一致。源匯關(guān)系假說(shuō)認(rèn)為，植物器官通過(guò)相互競(jìng)爭(zhēng)獲得光合產(chǎn)物。與低氮處理相比，干旱下高氮處理的植物葉片受到的損傷較小，可將更多比例的碳用于根系的生長(zhǎng)。由于“干旱記憶”，復(fù)水后高氮處理的根冠比的升高程度依舊大于低氮處理。

復(fù)水后7 以及24 d，低氮處理主要提高了地上部的淀粉和可溶性糖含量，而高氮處理主要提高了地下部的淀粉和可溶性糖含量。植物在干旱時(shí)也有相似的變化，說(shuō)明復(fù)水后糖類(lèi)的分配規(guī)律也是“干旱記憶”導(dǎo)致的。干旱下，高氮處理趨于將非結(jié)構(gòu)性碳水化合物儲(chǔ)存于根系中[22]，而低氮處理主要將糖用于維持葉片的光合功能。

復(fù)水后，低氮處理的地下生物量降低，而高氮處理下增加，表明高氮處理提高了氮素吸收能力。然而，與低氮處理一樣，高氮處理并未顯著提高其地上部的氮素含量，說(shuō)明高氮處理可能將氮素主要儲(chǔ)存在地下根系中。這種現(xiàn)象可能也與干旱時(shí)的響應(yīng)有關(guān)。低氮處理植物的抗旱能力較低，干旱時(shí)可能將更多的氮素用來(lái)提高葉片的光合吸收，而高氮處理則可將更多的氮儲(chǔ)存于根系中。由于本研究并未測(cè)定植物地下部的含氮量，施氮對(duì)植物復(fù)水后氮分配的作用機(jī)理需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 施氮對(duì)紫花苜蓿復(fù)水后酶活性的影響

干旱時(shí)，兩個(gè)氮水平下植物的SS 活性沒(méi)有顯著變化。復(fù)水7、24 d，兩個(gè)氮水平下的SS 活性均高于對(duì)照組，說(shuō)明干旱時(shí)與復(fù)水后參與蔗糖代謝的主要酶是有所不同，而SS 酶是植物復(fù)水后參與蔗糖合成的主要酶。但是，復(fù)水7 d 時(shí)，與低氮處理相比，高氮處理的SS 活性升高程度較小。這可能是因?yàn)檎崽堑暮铣膳c分解是由一系列酶共同決定的，不同處理下植物碳分配的差異不是由單一酶所決定[23-24]。復(fù)水24 d 時(shí)，低氮處理的SS 活性與其對(duì)照組無(wú)顯著差異，而高氮處理的SS 活性依舊高于其對(duì)照組，說(shuō)明SS 是高氮處理復(fù)水后蔗糖合成的主要酶。

干旱條件下，兩個(gè)氮水平下植物葉片的SPS 活性均顯著升高，說(shuō)明干旱下SPS 是參與蔗糖合成的主要酶。Xu 等[5]的研究也表明，干旱顯著升高了水稻(Oryza sativa)葉片SPS 活性。但是復(fù)水7 d，低氮處理的SPS 活性顯著高于其對(duì)照組。復(fù)水24 d，兩個(gè)氮水平下植物的SPS 活性均顯著低于其對(duì)照組，說(shuō)明SPS 不是決定植物復(fù)水后光合產(chǎn)物分配的主要酶，這與Guo 等[12]的研究一致。

干旱下，兩個(gè)氮水平下植物根系的AI 活性均有所下降，復(fù)水后根系A(chǔ)I 活性則顯著提高，說(shuō)明AI酶是復(fù)水后調(diào)節(jié)蔗糖分解的關(guān)鍵酶。但是，由于酶的活性也會(huì)隨著時(shí)間而發(fā)生變化[25]。在復(fù)水過(guò)程中，高氮處理AI 活性的增高程度始終低于低氮處理，說(shuō)明施氮并未通過(guò)提高AI 活性而促使根系生長(zhǎng)及其碳水化合物的積累。

4 結(jié)論

施氮有利于紫花苜蓿復(fù)水后根部干物質(zhì)、淀粉、可溶性糖以及氮素的積累，從而增強(qiáng)紫花苜蓿復(fù)水后的生長(zhǎng)恢復(fù)能力。在AI、SPS 和SS 酶中，施氮主要通過(guò)提高SS 酶活性，促進(jìn)復(fù)水后紫花苜蓿碳水化合物在根系中的積累。