基于ERIC-PCR技術(shù)分析黃連解毒湯對2型糖尿病大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及DNA同源性的影響*

陳呂,張庚鑫,韓雪,2,唐秋梅,蘇鋼,楊光勇,陳瑞,何光志

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽 550025; 2.德江縣人民醫(yī)院,貴州 德江 565200

我國糖尿病的發(fā)病率逐年增高,2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)是其中的主要類型[1]。糖尿病會引發(fā)多器官病變,如糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變等。T2DM患者還常伴有心血管疾病的重要危險因素,如高血壓、血脂紊亂等[2]。不良的生活習(xí)慣(如吸煙)也會增加糖尿病并發(fā)大血管病變的風(fēng)險。T2DM是一種終身性疾病,以胰島素缺乏、胰島素抵抗、高血糖等為特征,對人體健康的危害極大。中醫(yī)藥可通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善2型糖尿病T2DM,在腸道菌群的作用下,中醫(yī)藥被分解為具有生物活性的多酚、生物堿、皂苷等成分。這些成分能夠維持腸道菌群的生態(tài)平衡,調(diào)節(jié)腸道菌群組成,并改善腸道菌群失調(diào)[3]。

黃連解毒湯出自《肘后備急方》,是清熱解毒的代表方劑,主要用于治療胃腸實熱證,其組成成分包括黃芩、黃連、黃柏、梔子。研究發(fā)現(xiàn),黃連解毒湯能通過多種途徑調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),如短鏈脂肪酸代謝途徑、膽汁酸代謝途徑、支鏈氨基酸代謝途徑、脂多糖分泌途徑以及功能蛋白質(zhì)分泌途徑等,最終減弱胰島素抵抗,預(yù)防并延緩糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)腸黏膜完整性、減少有害菌群進(jìn)入血液循環(huán)、降低炎癥水平及改善糖脂代謝等相關(guān)[4-5]。

為了探討不同劑量黃連解毒湯對腸道菌群調(diào)節(jié)的差異性,本研究建立T2DM大鼠模型,采用基于細(xì)菌基因間重復(fù)序列的ERIC-PCR技術(shù)分析黃連解毒湯對腸道菌群多樣性的影響,為該方劑的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物SPF級SD大鼠36只,雌雄各半,體質(zhì)量180～220 g,購自重慶騰鑫華阜實驗動物銷售有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0008。動物飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,溫度25 ℃,相對濕度50%,晝夜明暗交替12 h/12 h,自由進(jìn)食和飲水。動物實驗經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會審核批準(zhǔn),倫理審批號:SYXK(黔)2021-0005。

1.2 藥物與試劑黃連、黃芩、黃柏、梔子(北京同仁堂貴陽藥店,批號:200301、200701、200602、200702);鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司,批號:國藥準(zhǔn)字H20023370);鏈脲佐菌素、糞便DNA提取試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司,批號:S8050、20220704);Green Taq Mix(諾唯贊生物,批號:B2242DAA);50× TAE緩沖液、無酶無菌水(北京索萊寶生物科技有限公司,批號:20220415、20211118);G-Red核酸染料(北京百泰克生物技術(shù)有限公司,批號:756773AH);BM2000 DNA Marker(博邁德生物,批號:766583AH)。

1.3 儀器TC-96/G/H(b)型基因擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司);紫外分析儀(美國SPECTRONICS公司,型號:CM-10A);恒溫水浴鍋(科忻儀器,型號:XMTD203);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠,型號:101-2-S);渦旋儀(IKA VORTEX,型號:GENIUS3);低速離心機(jī)(SCIKOGEX,型號:S1010E);電子天平(METTLER TOLEDO,型號:EL104);高速冷凍離心機(jī)、核酸蛋白分析儀(Thermo Fisher Scientific,型號:LEGEND MICRO 21R、6VDC-18W);電泳儀(北京市六一儀器廠,型號:DYCP-31DN);垂直流潔凈工作臺(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司,型號:HCB-1300V);血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司,型號:2J01B210415)。

2 方法

2.1 藥物制備黃連解毒湯:取黃連54 g,黃芩 36 g,黃柏36 g,梔子54 g,加10倍量的超純水浸泡1 h,加熱煮沸后,武火煎煮40 min,倒出藥液;藥渣加4倍量的超純水,武火煎煮30 min,倒出藥液;將兩次所得藥液合并,分別濃縮至質(zhì)量濃度為0.63 g·mL-1、0.31 g·mL-1、0.16 g·mL-1的藥液,冷卻后分裝,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。二甲雙胍溶液:將二甲雙胍片研磨成粉后,用生理鹽水配制質(zhì)量濃度為10 g·L-1的溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 分組、造模及給藥適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,將36只大鼠隨機(jī)分為對照組6只、造模組30只,對照組給予普通飼料,造模組給予高脂飼料(10.0%豬油、15.0%蔗糖、10.0%蛋黃粉、2.5%膽固醇、0.5%膽酸鹽、62.0%基礎(chǔ)飼料)。喂養(yǎng)6周后,造模組大鼠腹腔注射1%鏈脲佐菌素(30 mg·kg-1),24 h后尾尖點(diǎn)刺采血并測血糖,48 h后再次尾尖點(diǎn)刺采血測血糖,若2次血糖濃度均>16.7 mmol·L-1表示糖尿病模型復(fù)制成功[6]。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、黃連解毒湯高劑量組(6.25 g·kg-1)、黃連解毒湯中劑量組(3.13 g·kg-1)、黃連解毒湯低劑量組(1.56 g·kg-1)[7]及二甲雙胍組(100 mg·kg-1),每組各6只。各藥物組按照相應(yīng)劑量灌胃給藥,對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水,連續(xù)21 d。

2.3 大鼠腸道菌群DNA提取灌胃第7天、第14天、第21天,收集大鼠糞便于1.5 mL EP管中,放入-80 ℃冰箱保存。采用糞便基因組DNA提取試劑盒,按照說明書進(jìn)行操作,提取大鼠糞便樣本細(xì)菌總DNA;通過核酸蛋白分析儀檢測DNA濃度與純度,經(jīng)檢測,OD260/OD280比值為1.6～1.9,說明提取的DNA純度較高;將DNA樣本保存在-80 ℃冰箱備用。

2.4 ERIC-PCR檢測腸道菌群DNA結(jié)構(gòu)參照文獻(xiàn)[8-9]設(shè)計引物,委托上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列為:ERIC-1- F 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′,ERIC-2-R 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。根據(jù)引物說明書,將其稀釋成工作液,分裝備用,避免污染。在PCR試劑盒說明書的基礎(chǔ)上,建立適用于本實驗且PCR電泳后具有較多條帶的ERIC-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。反應(yīng)體系:DNA模板2 μL,上下游引物各0.5 μL,Green Taq Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,總體積25 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性 5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸90 s,共35個循環(huán);65 ℃再延伸16 min。

2.5 Sanger測序檢測腸道菌群DNA同源性根據(jù)電泳圖選擇相應(yīng)組分的PCR試劑,采用Sanger法進(jìn)行測序,由上海生工生物工程股份有限公司完成。具體方法為:首先,采用SK1201-UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取細(xì)菌基因組;然后,采用毛細(xì)血管電泳技術(shù)進(jìn)行電泳,并基于電泳結(jié)果切割所需的DNA目的條帶進(jìn)行瓊脂糖純化;最后,采用3730XL型基因分析儀進(jìn)行DNA測序。將DNA測序結(jié)果用Blast軟件進(jìn)行對比分析。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠造模后血糖濃度比較藥物干預(yù)前,與對照組比較,造模組大鼠血糖濃度升高(P<0.05),且>16.7 mmol·L-1[6],提示糖尿病模型復(fù)制成功,見表1。

表1 各組大鼠造模后 血糖濃度比較

3.2 各組大鼠不同時間腸道菌群結(jié)構(gòu)比較灌胃第7天,對照組條帶亮度適中且較多集中在100～750 bp,表明腸道微生物處于相對平衡的狀態(tài);與對照組比較,模型組條帶在1 000～2 000 bp的亮度增強(qiáng)(菌群豐度增加),在300～750 bp的亮度減弱(菌群豐度減少);與模型組比較,黃連解毒湯高劑量組、中劑量組、低劑量組及二甲雙胍組條帶在750 bp的亮度增強(qiáng)(菌群豐度增加),見圖1。

注:M:2 000 DNA Marker;1～4:對照組;5～8:模型組;9～12:二甲雙胍組;13～16:黃連解毒湯高劑量組;17～20:黃連解毒湯中劑量組;21～24:黃連解毒湯低劑量組。

灌胃第14天,與模型組比較,黃連解毒湯高劑量組、中劑量組、低劑量組及二甲雙胍組條帶在1 000 bp 以上的亮度減弱(菌群豐度減少),見圖2。

注:M:2 000 DNA Marker;25～28:對照組;29～32:模型組;33～36:二甲雙胍組;37～40:黃連解毒湯高劑量組;41～44:黃連解毒湯中劑量組;45～48:黃連解毒湯低劑量組。

灌胃第21天,與模型組比較,二甲雙胍組和黃連解毒湯高劑量組、中劑量組、低劑量組條帶在300～750 bp的亮度增強(qiáng)(菌群豐度增加);與模型組比較,黃連解毒湯高劑量組、中劑量組條帶在 300～500 bp的亮度增加(菌群豐度增加),見圖3。

注:M:2 000 DNA Marker;49～52:對照組;53～56:模型組;57～60:二甲雙胍組;61～64:黃連解毒湯高劑量組;65～68:黃連解毒湯中劑量組;69～72:黃連解毒湯低劑量組。

3.3 各組大鼠腸道菌群DNA同源性分析灌胃第21天,對照組500 bp條帶、模型組400 bp和 1 000 bp 條帶的DNA測序結(jié)果顯示,對照組為擬桿菌門,優(yōu)勢菌群為擬桿菌屬(Bacteroidessp.)、杜氏鄧氏菌(Duncanielladubosii)和金黃桿菌屬(Chryseobacteriumsp.);模型組為厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門,厚壁菌門的優(yōu)勢菌群為梭菌目細(xì)菌(ClostridialesbacteriumCCNA10)和普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii),變形菌門的優(yōu)勢菌群為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa),擬桿菌門的優(yōu)勢菌群為桿菌屬(Flavonifractorplautii),見表2。

表2 對照組和模型組大鼠灌胃第21天腸道菌群 DNA同源性分析

灌胃第7天,黃連解毒湯高劑量組750 bp條帶、中劑量組200 bp條帶、低劑量組1 200 bp條帶以及二甲雙胍組1 000 bp條帶的DNA測序結(jié)果顯示,黃連解毒湯高劑量組為厚壁菌門和擬桿菌門,厚壁菌門的優(yōu)勢菌群為布勞特菌,擬桿菌門的優(yōu)勢菌群為擬桿菌屬;黃連解毒湯中劑量組為擬桿菌門,優(yōu)勢菌群為脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)和擬桿菌屬;黃連解毒湯低劑量組為厚壁菌門,優(yōu)勢菌群為雙發(fā)酵副梭菌(Paraclostridiumbifermentans);二甲雙胍組為變形菌門,優(yōu)勢菌群為大腸埃希桿菌(Escherichiacoil),見表3。

表3 各藥物組大鼠灌胃第7天腸道菌群DNA同源性分析

灌胃第14天,黃連解毒湯高劑量組700 bp條帶、中劑量組550 bp條帶、低劑量組350 bp條帶以及二甲雙胍組290 bp條帶的DNA測序結(jié)果顯示,黃連解毒湯高劑量組為擬桿菌門和變形菌門,擬桿菌門的優(yōu)勢菌群為擬桿菌目細(xì)菌(Bacteroidalesbacterium),變形菌門的優(yōu)勢菌群為假單胞菌(Pseudomonassp.);黃連解毒湯中劑量組為放線菌門,優(yōu)勢菌群為假鎖桿菌屬(Pseudoclavibactersp.)和鏈霉菌屬(Streptomycessp.);黃連解毒湯低劑量組為擬桿菌門,優(yōu)勢菌群為Muribaculumgordoncarteri、腸桿菌(Muribaculumintestinale)、杜氏鄧氏菌和桿菌科細(xì)菌(Muribaculaceaebacterium);二甲雙胍組為變形菌門,優(yōu)勢菌群為弗格森埃希菌(Escherichiafergusonii)和大腸埃希桿菌,見表4。

表4 各藥物組大鼠灌胃第14天腸道菌群DNA同源性分析

灌胃第21天,黃連解毒湯高劑量組1 000 bp條帶、中劑量組600 bp條帶以及二甲雙胍組400 bp條帶的DNA測序結(jié)果顯示,黃連解毒湯高劑量組為擬桿菌門,優(yōu)勢菌群為普雷沃氏菌屬;黃連解毒湯中劑量組為擬桿菌門,優(yōu)勢菌群為Muribaculumgordoncarteri、杜氏鄧氏菌和擬桿菌屬;二甲雙胍組為擬桿菌門,優(yōu)勢菌群為Muribaculumgordoncarteri、腸桿菌、普雷沃氏菌、桿菌科細(xì)菌和桿菌屬,部分菌種無中文名稱,故未給出,見表5。

表5 各藥物組大鼠灌胃第21天腸道菌群DNA同源性分析

4 討論

目前,臨床治療T2DM的藥物種類較多,且效果良好,但存在諸多不良反應(yīng)。長期服用二甲雙胍可引起維生素B12水平下降[10]。老年患者和肝、腎功能不全者服用磺脲類藥物時,若使用不當(dāng)容易引起低血糖反應(yīng),并且磺脲類藥物可能導(dǎo)致肥胖[11]。噻唑烷二酮類藥物可能導(dǎo)致患者體質(zhì)量增加和水腫,與胰島素聯(lián)合使用時不良反應(yīng)尤為顯著。此外,噻唑烷二酮類藥物的使用與骨折、心力衰竭的風(fēng)險增加有關(guān)[12]。服用α-糖苷酶抑制劑的常見不良反應(yīng)為胃腸道反應(yīng)[13]。因此,尋找療效穩(wěn)定、安全性高、耐受性好及不良反應(yīng)少的新型降血糖藥物成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

中藥含有多種有效成分和活性成分,在治療T2DM時具有安全性高、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢,同時中藥的多靶點(diǎn)特性能夠有效提高其生物利用度[14]。中醫(yī)藥能夠為T2DM患者提供個體化的治療方案,旨在達(dá)到最佳治療效果并減輕藥物不良反應(yīng)[13]。中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)“天人合一”的整體觀念,認(rèn)為人的生理、病理與自然環(huán)境息息相關(guān),治療時應(yīng)從整體出發(fā),調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境,以達(dá)到治療和預(yù)防疾病的目的[15]。腸道菌群平衡對人體健康至關(guān)重要,能夠分解食物中的多種成分,促進(jìn)消化和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,保護(hù)腸道黏膜的屏障功能,防止有害物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán),同時刺激腸道中的免疫細(xì)胞,調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng),并影響大腦中的神經(jīng)遞質(zhì)和激素水平,從而調(diào)節(jié)人的心理狀態(tài)等[16]。

黃連解毒湯中的黃連含有生物堿,其中小檗堿的含量較高。研究發(fā)現(xiàn),小檗堿能夠調(diào)節(jié)糖尿病大鼠腸道內(nèi)的菌群平衡,使雙歧桿菌豐度增加,同時降低大腸桿菌豐度,從而達(dá)到降血糖的效果。雙歧桿菌與T2DM呈負(fù)相關(guān),并且雙歧桿菌能夠產(chǎn)生乙酸,調(diào)節(jié)腸道pH值,預(yù)防病原體感染[17]。此外,黃連解毒湯還能通過抑制T2DM的炎癥反應(yīng),從而降低血糖水平和減輕胰島素抵抗[16]。臨床研究表明,黃連解毒湯加減治療T2DM,可顯著增加患者的乳桿菌、擬桿菌和雙歧桿菌等益生菌數(shù)量,調(diào)節(jié)糖脂代謝[19]。黃連解毒湯的活性成分包括小檗堿、黃芩素、黃芩苷、梔子苷等,共同發(fā)揮抗炎作用,還能通過調(diào)節(jié)胰腺β細(xì)胞和腸道L細(xì)胞增殖從而降低血糖水平[20]。

研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群與T2DM的發(fā)生存在一定關(guān)聯(lián)。T2DM患者腸道的厚壁菌門、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinomycetes)豐度增加,擬桿菌門(Bacteroidates)和疣微菌門(Verrucomicrobia)豐度降低[21]。T2DM大鼠腸道的厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門豐度增加,其中機(jī)會致病菌銅綠假單胞菌的豐度增加[22],產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)的梭菌目細(xì)菌增加[23]。黃連解毒湯能夠增加普雷沃氏菌屬、擬桿菌門、變形菌門和布勞特菌的豐度[24-25]。布勞特菌屬于厚壁菌門Lachnospiraceae科,可以發(fā)酵碳水化合物,從而為機(jī)體提供能量。

本研究發(fā)現(xiàn),黃連解毒湯高劑量灌胃第7天時,SCFAs產(chǎn)生菌和抗炎菌的豐度增加,如布勞特菌和擬桿菌屬;灌胃第14天時,擬桿菌目細(xì)菌和假單胞菌的豐度增加;灌胃第21天時,普雷沃氏菌屬的豐度增加。黃連解毒湯中劑量灌胃第7天時,有益菌脆弱擬桿菌和擬桿菌屬的豐度增加。黃連解毒湯低劑量灌胃第21天時,SCFAs產(chǎn)生菌普雷沃氏菌和各種腸桿菌的豐度增加。因此,Muribaculumgordoncarteri和杜氏鄧氏菌可能是黃連解毒湯治療T2DM的重要菌群。

綜上所述,黃連解毒湯對T2DM大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)具有調(diào)節(jié)作用,菌群調(diào)節(jié)效果受藥物劑量和治療時間的影響。本研究通過ERIC-PCR和Sanger測序技術(shù)觀察黃連解毒湯對T2DM大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,為該方劑的開發(fā)與利用提供研究基礎(chǔ)。但菌群種類較多,回收時難以得到條帶單一、濃度和純度較高的DNA,導(dǎo)致測序存在一定的困難,且未對菌群進(jìn)行定量分析,這些內(nèi)容將在未來的研究中加以完善。