基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與細胞實驗探討加味黃芪桂枝五物湯治療類風濕關(guān)節(jié)炎的作用機制*

徐俊,張彥紅,陳姣姣,張雨澤,莊麗華

湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430065

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征的慢性自身免疫性疾病。據(jù)統(tǒng)計,RA的全球發(fā)病率約為1%[1],其病情反復(fù)發(fā)作,纏綿難愈,易導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形。研究表明,RA確診后的首個5年致殘率達30%,平均壽命縮短5～7年[2],對人類健康造成極大危害。目前,RA的臨床治療主要包括抗風濕藥、非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素和生物制劑[3],但這些藥物存在不良反應(yīng)多、價格昂貴等問題[4-6]。因此,尋找新型抗RA藥物已成為風濕病學(xué)界長期關(guān)注的焦點。

中醫(yī)藥從整體出發(fā),通過辨病與辨證相結(jié)合,對改善RA患者的臨床癥狀、延緩疾病進展以及提高生活質(zhì)量具有確切優(yōu)勢。RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”“尪痹”等范疇,常因陽氣虧虛,復(fù)感外邪,導(dǎo)致氣血運行不暢,經(jīng)絡(luò)痹阻,從而產(chǎn)生肢體關(guān)節(jié)疼痛、麻木及活動不利等癥狀,陽虛血痹是其重要病機。黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略》,具有補益氣血、溫通衛(wèi)陽、散寒除痹的功效,是治療痹證的經(jīng)典方劑。湖北省中醫(yī)骨傷科學(xué)科帶頭人彭銳教授基于“陽虛血痹”的基本病機,提出治療本病應(yīng)以溫陽養(yǎng)血為主、活血通絡(luò)為輔[7],并在黃芪桂枝五物湯基礎(chǔ)上加雞血藤、淫羊藿、全蝎、蜈蚣和甘草,以增強溫陽養(yǎng)血逐痹之功,為其臨床治療RA的經(jīng)驗方。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)結(jié)合細胞實驗,初步探索加味黃芪桂枝五物湯干預(yù)RA的作用機制。

1 材料

1.1 動物SPF級SD大鼠20只,雄性,7周齡,體質(zhì)量(200±20) g,購自遼寧長生生物公司,實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2017-0067。動物飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,環(huán)境溫度21～25 ℃,濕度40%～60%,自由進食和飲水。本研究經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審核批準,倫理編號:HLK-20200330-001。

1.2 細胞人類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞株MH7A,購自中國Biovector NTCC公司,編號:E0326,按12傳代培養(yǎng)。

1.3 藥物與試劑加味黃芪桂枝五物湯(組成包括:黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗、雞血藤、淫羊藿、甘草、全蝎、蜈蚣,購自湖北中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部,批號:20220106);CCK-8試劑盒(美侖生物科技公司,貨號:65162-13-2);Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒(美國BD公司,貨號:556547);胎牛血清(四季青公司,貨號:11011-8611);DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(北京索萊寶科技有限公司,貨號:12100、P1020、L8880);磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase,PI3K)抗體、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)抗體(Affinity生物科技公司,貨號:AF6243、AF0016);HRP標記羊抗兔二抗、白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)ELISA試劑盒、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,貨號:BA1054、EK0431、EK0412、EK0527);BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢碧云天生物科技公司,貨號:P0010);蛋白marker(金斯瑞科技生物公司,貨號:M00521);GAPDH抗體(杭州賢至生物有限公司,貨號:AB-P-R 001)。

1.4 儀器流式細胞分析儀(美國BD公司,批號:G20190053);酶標儀(Thermo公司,型號:mμlISKANMK3);PCR儀(Bio-rad公司,型號:580BR10905);電泳儀、凝膠成像儀(Tanon公司,型號:HE-120、2500);倒置生物顯微鏡(Olympus公司,型號:CKX53);微量移液器(Eppendorf公司,編號:2015001);HH1型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州天瑞儀器有限公司);50A型壓力蒸汽滅菌器(上海三申醫(yī)療器械有限公司);梯度凍存盒(Biosharp公司,型號:BS-02-CFC)。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)(http://tcmspw.com)、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索加味黃芪桂枝五物湯的活性成分和作用靶點,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、藥物相似性(drug likeness,DL)≥0.18為條件進行篩選。

以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞,在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org/)檢索RA的作用靶點,將加味黃芪桂枝五物湯與RA的作用靶點取交集。通過Bioconductor平臺(http://bioconductor.org)和R軟件對交集基因進行基因本體(Gene Ontology,GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,其中,GO分析結(jié)果以FDR<0.01、最小計數(shù)為3且富集因子>1.5為標準進行篩選,KEGG分析結(jié)果以P<0.01、最小計數(shù)為3且富集因子>1.5為標準進行篩選。

2.2 細胞實驗

2.2.1 藥物制備加味黃芪桂枝五物湯由黃芪 9 g,桂枝9 g,白芍9 g,生姜18 g,大棗6 g,雞血藤18 g,淫羊藿18 g,甘草6 g,全蝎3 g,蜈蚣3 g組成。將各藥物按照相應(yīng)比例混合后,加10倍量水浸泡30 min,加熱回流煎煮,過濾藥液;濾液減壓濃縮至質(zhì)量濃度為1.6 g·mL-1的藥液,冷卻后4 ℃冰箱保存;正式實驗時,使用蒸餾水配置成所需濃度,室溫靜置后使用。

2.2.2 含藥血清制備20只SD大鼠隨機分為加味黃芪桂枝五物湯組(10只)、正常組(10只),前者以加味黃芪桂枝五物湯(1.8 g·kg-1)灌胃,后者以等劑量生理鹽水灌胃,每日1次,持續(xù)7 d。末次給藥后1 h,乙醚麻醉大鼠,腹主動脈取血,室溫靜置 1 h,3 000 r·min-1離心10 min,收集上清。將同組大鼠血清混勻,56 ℃水浴條件下滅活30 min;采用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌,分裝入2 mL EP管;將血清與DMEM培養(yǎng)基混合,配制成體積分數(shù)為5%、10%、20%的含藥血清,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 CCK-8法檢測MH7A細胞增殖情況取對數(shù)生長期的MH7A細胞,接種于96孔板,每孔100 μL,分為空白組(只含培養(yǎng)基)、對照組(MH7A+正常組血清)、加味黃芪桂枝五物湯低劑量組(MH7A+5%含藥血清)、加味黃芪桂枝五物湯中劑量組(MH7A+10%含藥血清)、加味黃芪桂枝五物湯高劑量組(MH7A+20%含藥血清)。各藥物組加入不同體積分數(shù)的含藥血清(100 μL),對照組加入等體積培養(yǎng)基,以同體積培養(yǎng)基為空白組,每組設(shè)置3個復(fù)孔;同時采用PBS緩沖液封閉外周,以緩解液體蒸發(fā)。細胞培養(yǎng)12 h后,每孔加入CCK-8溶液(10 μL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,酶標儀在450 nm波長處檢測光密度(optical density,OD)值;細胞培養(yǎng)24 h、48 h 時,按照此方法進行檢測。

細胞增殖抑制率=1-(藥物組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%

2.2.4 Annexin V-PI雙染色法檢測MH7A細胞凋亡情況取對數(shù)生長期的MH7A細胞,接種于6孔板,每孔細胞數(shù)為2×105個,分為對照組(MH7A+正常組血清)、加味黃芪桂枝五物湯低劑量組(MH7A+5%含藥血清)、加味黃芪桂枝五物湯中劑量組(MH7A+10%含藥血清)、加味黃芪桂枝五物湯高劑量組(MH7A+20%含藥血清),培養(yǎng)箱中孵育24 h。收集每孔細胞,室溫800 r·min-1離心 3 min,棄上清液,留取細胞沉淀。PBS洗滌細胞2次,室溫800 r·min-1離心3 min,棄上清,加入 100 μL binding buffer重懸細胞;加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻細胞,再加入5 μL PI染色,室溫避光孵育15 min;最后加入400 μL binding buffer,并轉(zhuǎn)移至流式管中,上機檢測并采用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

2.2.5 Western Blot檢測MH7A細胞PI3K、p-AKT蛋白表達水平取對數(shù)生長期的MH7A細胞,接種于6孔板,每孔細胞數(shù)為2×105個,分為對照組(MH7A+正常組血清)、模型組(MH7A+LPS)、加味黃芪桂枝五物湯低劑量組(MH7A+LPS+5%含藥血清)、加味黃芪桂枝五物湯中劑量組(MH7A+LPS+10%含藥血清)、加味黃芪桂枝五物湯高劑量組(MH7A+LPS+20%含藥血清)。模型組加入LPS(1 μg·L-1,100 μL)誘導(dǎo)2 h;藥物組加入不同體積分數(shù)的含藥血清(100 μL)干預(yù)24 h,最后2 h加入LPS進行刺激。收集各組細胞,提取總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度;配置12% SDS-PAGE凝膠,電泳,轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h;一抗(PI3K濃度1400,p-AKT濃度 11 000)4 ℃孵育過夜;二抗(11 000)室溫孵育1 h;ECL化學(xué)發(fā)光液顯影并掃描。采用Quantity One軟件分析蛋白條帶的灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

2.2.6 ELISA檢測MH7A細胞IL-17、TNF-α、IL-6含量細胞培養(yǎng)與分組方法同“2.2.5”項,收集各組細胞,3 000 r·min-1離心5 min,取上清。按照ELISA試劑盒說明書進行操作,檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-17、TNF-α、IL-6含量。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果加味黃芪桂枝五物湯的活性成分141個,作用靶點303個。RA的作用靶點 4 937 個,加味黃芪桂枝五物湯與RA的交集靶點127個。

針對交集靶點進行GO和KEGG分析,GO分析結(jié)果中生物過程(biological process,BP)、細胞組成(cell component,CC)、分子功能(molecular function,MF)主要涉及對脂多糖的反應(yīng)、對細胞增殖的負反饋調(diào)節(jié)、對細胞因子的反應(yīng)、細胞活化調(diào)節(jié)、細胞凋亡過程的正調(diào)節(jié)等。KEGG通路主要包括PI3K/AKT信號通路、TNF信號通路、鈣信號通路等,見圖1、圖2。

圖1 GO分析氣泡圖

圖2 KEGG通路氣泡圖

3.2 加味黃芪桂枝五物湯對MH7A細胞增殖的影響細胞培養(yǎng)12 h、24 h、48 h時,與對照組比較,加味黃芪桂枝五物湯高劑量組、中劑量組與低劑量組細胞的增殖抑制率升高(P<0.05),見表1。在相同培養(yǎng)時間內(nèi),隨著含藥血清濃度增加,對細胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)增強趨勢;當含藥血清濃度相同時,隨著作用時間增加,對細胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)增強趨勢。由于培養(yǎng)12 h時,加味黃芪桂枝五物湯對MH7A細胞的增殖抑制作用較弱,培養(yǎng)48 h時作用較強,因此,選擇細胞培養(yǎng)24 h進行后續(xù)實驗。

表1 各組細胞增殖抑制率比較

3.3 加味黃芪桂枝五物湯對MH7A細胞凋亡的影響細胞培養(yǎng)24 h時,與對照組比較,加味黃芪桂枝五物湯低劑量組、中劑量組、高劑量組細胞凋亡率增加(P<0.05),見圖3、圖4。

圖3 各組細胞凋亡流式圖

注:A:對照組;B:加味黃芪桂枝五物湯低劑量組;C:加味黃芪桂枝五物湯中劑量組;D:加味黃芪桂枝五物湯高劑量組;與對照組比較,* P<0.05。

3.4 加味黃芪桂枝五物湯對MH7A細胞PI3K、p-AKT蛋白表達水平的影響與對照組比較,模型組細胞PI3K、p-AKT表達水平升高(P<0.05);與模型組比較,加味黃芪桂枝五物湯低劑量組、中劑量組、高劑量組細胞PI3K、p-AKT表達水平降低(P<0.05),見圖5。

注:A:對照組;B:模型組;C:加味黃芪桂枝五物湯低劑量組;D:加味黃芪桂枝五物湯中劑量組;E:加味黃芪桂枝五物湯高劑量組;與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

3.5 加味黃芪桂枝五物湯對MH7A細胞IL-17、TNF-α、IL-6含量的影響與對照組比較,模型組細胞IL-17、TNF-α、IL-6含量升高(P<0.05);與模型組比較,加味黃芪桂枝五物湯低劑量組、中劑量組、高劑量組細胞IL-17、TNF-α、IL-6含量下降(P<0.05),見圖6。

注:A:對照組;B:模型組;C:加味黃芪桂枝五物湯低劑量組;D:加味黃芪桂枝五物湯中劑量組;E:加味黃芪桂枝五物湯高劑量組;與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

4 討論

目前,RA的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn),關(guān)節(jié)外的滑膜組織可分為滑膜內(nèi)膜襯里層和襯里下層,其中以成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)為主要組成細胞的滑膜內(nèi)層直接與關(guān)節(jié)腔接觸。在健康關(guān)節(jié)中,FLS產(chǎn)生長鏈多聚透明質(zhì)酸、糖蛋白潤滑素和纖溶酶原活化因子,這些物質(zhì)能夠潤滑關(guān)節(jié)腔并阻止關(guān)節(jié)內(nèi)纖維粘連,對維持關(guān)節(jié)腔的環(huán)境穩(wěn)態(tài)起到重要作用[8-9]。RA的FLS數(shù)量顯著增加,導(dǎo)致滑膜襯里層從薄而易碎的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榻櫺栽錾匝荇铇咏Y(jié)構(gòu)[10-11]。FLS表達的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是破壞軟骨的重要因素,分泌的細胞因子(如IL-6、TNF-α)和趨化因子加劇滑膜組織炎性反應(yīng)的持續(xù)性[12]。此外,FLS產(chǎn)生的誘導(dǎo)增殖細胞因子和抗凋亡細胞因子影響細胞分裂周期,從而導(dǎo)致細胞異常增殖[13-14]。FLS的異常表達可能誘導(dǎo)腫瘤樣改變,從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔狹窄甚至關(guān)節(jié)破壞[15]。因此,滑膜組織FLS的異常增殖是RA的標志性病理特征之一。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),對細胞增殖的負調(diào)控是加味黃芪桂枝五物湯干預(yù)RA的重要機制之一。實驗研究發(fā)現(xiàn),加味黃芪桂枝五物湯干預(yù)MH7A細胞12 h、24 h、48 h后,均能有效抑制滑膜成纖維細胞增殖,且在相同干預(yù)時間內(nèi),含藥血清濃度的增加與細胞增殖抑制作用呈正相關(guān)。同時,加味黃芪桂枝五物湯含藥血清干預(yù)MH7A細胞24 h后,細胞凋亡水平明顯上升,且與含藥血清濃度呈正相關(guān)。因此,加味黃芪桂枝五物湯通過抑制細胞增殖和促進細胞凋亡兩個方面實現(xiàn)對滑膜成纖維細胞的調(diào)控。

PI3K/AKT信號通路是重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PI3K受上游分子刺激活化后,通過改變AKT的蛋白結(jié)構(gòu),使其磷酸化激活,進而抑制下游一系列底物,如凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、FLICE樣抑制蛋白(Flice-like inhibitory protein,FLIP)、肌球蛋白調(diào)節(jié)性輕鏈(regulatory myosin light chain,Mcl2)等,從而調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡和遷移等表型[16-17]。研究顯示,RA 患者滑膜細胞中PI3K/AKT信號通路處于異常激活狀態(tài)[18],活化的PI3K/AKT信號通路可通過介導(dǎo)下游多種效應(yīng)分子,如Bcl-2、半胱氨酸蛋白酶9等,導(dǎo)致滑膜細胞凋亡失衡,這是RA滑膜細胞病理性增生的機制之一[19-20]。細胞實驗發(fā)現(xiàn),加味黃芪桂枝五物湯干預(yù)MH7A細胞24 h后,PI3K、p-AKT蛋白表達水平降低,IL-17、TNF-α、IL-6含量下調(diào),初步證實PI3K/AKT信號通路可能是加味黃芪桂枝五物湯干預(yù)RA的機制之一,且該方可能抑制滑膜組織炎癥反應(yīng)的持續(xù)性和滑膜成纖維細胞的異常增殖。

綜上所述,加味黃芪桂枝五物湯可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路等相關(guān)途徑,抑制MH7A細胞增殖、促進細胞凋亡,降低炎癥因子水平,從而發(fā)揮抗RA的作用。后續(xù)研究將繼續(xù)探討加味黃芪桂枝五物湯如何通過PI3K/AKT信號通路影響RA的炎癥和細胞增殖,并尋找上游靶點,利用生物信息學(xué)和基因編輯技術(shù)深入挖掘其作用機制。