不同標(biāo)本類型在非小細(xì)胞肺癌基因檢測中的應(yīng)用及意義*

朱啟淦 孟加榕 魁國菊 張小紅 黃江賓 禹樂

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇九醫(yī)院·廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科,福建 漳州 363000 )

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,全世界每年因肺癌死亡人數(shù)約160萬人[1-2]。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的75%～85%,初診并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者5年生存期約為5%,生存率較低[3-4]。隨著基因檢測技術(shù)及分子病理學(xué)的發(fā)展,NSCLC驅(qū)動(dòng)基因異常被相繼發(fā)現(xiàn),肺癌的診斷從組織學(xué)分型轉(zhuǎn)向分子分型,促使肺癌的診療進(jìn)入到個(gè)體化分子靶向藥物治療時(shí)代[5]。明確驅(qū)動(dòng)基因狀態(tài)是分子靶向藥物治療的基礎(chǔ),中國NSCLC診療指南[6]推薦,在NSCLC患者治療前需檢測表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)基因,條件允許時(shí)可同時(shí)進(jìn)行EGFR、間變性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)、C-ros原癌基因1-受體酪氨酸激酶(C-ros oncogene 1-receptor tyrosine kinase,ROS1)等多基因聯(lián)合檢測,以協(xié)助臨床診療。因我國肺癌一經(jīng)發(fā)現(xiàn)大多處于晚期或伴有轉(zhuǎn)移而無法手術(shù)切除,且標(biāo)本的來源及質(zhì)量常影響到基因檢測結(jié)果。本研究采用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(Amplification refractory mutation system,ARMS)法對180例不同標(biāo)本類型NSCLC患者行驅(qū)動(dòng)基因聯(lián)合檢測,分析不同標(biāo)本類型基因突變的檢出率及驅(qū)動(dòng)基因狀態(tài)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系,分析驅(qū)動(dòng)基因聯(lián)合檢測的意義,進(jìn)而為NSCLC患者個(gè)體化靶向藥物治療提供取樣途徑參考及分子病理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2021年1月—2021年12月聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇九醫(yī)院病理科明確診斷為NSCLC患者,并有足夠的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)驅(qū)動(dòng)基因聯(lián)合檢測的樣本180例。其中女性56例,男性124例;年齡33～87歲,中位年齡(57±5)歲;腺癌154例,非腺癌26例(包括鱗癌、腺鱗癌及未分化癌);手術(shù)切除標(biāo)本25例,肺活檢標(biāo)本80例(包括肺細(xì)針穿刺和支氣管鏡活檢),胸腔積液細(xì)胞蠟塊標(biāo)本29例,轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本46例(包括骨、淋巴結(jié)、肝、腦等轉(zhuǎn)移)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 試劑與儀器 德國LEICA RM2245切片機(jī),廈門愷碩HF24全自動(dòng)核酸純化儀,石蠟包埋組織切片組織樣品基因組DNA/RNA一步式提取試劑盒均購于廈門凱碩生物科技有限公司,人類5種突變基因檢測試劑盒購于廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司,UPT-100超微量核酸蛋白測定儀,美國ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3 FFPE DNA和RNA的提取 石蠟包埋組織按5～10 μm的厚度進(jìn)行切片,取5～10片于1.5 mL離心管中(視標(biāo)本組織量增減切片數(shù)量),每個(gè)組織樣本取2管,分別用于DNA和RNA提取。樣本DNA和RNA提取操作方法及步驟嚴(yán)格按FFPE組織樣品基因組DNA和RNA一步式提取試劑盒說明書進(jìn)行。所提DNA和RNA需立即檢測,或-20 ℃保存。

1.4 FFPE DNA和RNA濃度測定 使用微型紫外分光光度計(jì)測定樣本RNA和DNA濃度,所提RNA濃度應(yīng)介于10～500 ng/μL,DNA濃度應(yīng)大于2 ng/μL,DNA和RNA的OD260/280應(yīng)在1.8～2.1之間。樣本DNA上機(jī)濃度稀釋至1.5～3 ng/μL。

1.5 ARMS PCR檢測驅(qū)動(dòng)基因突變 向體積均為45 μL的待檢樣品RNA、LMG陽性質(zhì)控品、純化水中各加入5 μL LMG混合酶A;向體積均為42.3 μL的待檢樣品DNA、LMG陽性質(zhì)控品、純化水中各加入2.7 μL LMG混合酶B;混勻后短暫離心,將混好的RNA樣品依次取10 μL加入LMG 12聯(lián)PCR反應(yīng)條的①-④號管中,將混好的同一份DNA樣品依次取5 μL加入LMG 12聯(lián)PCR反應(yīng)條的⑤-號管中,蓋上LMG 12聯(lián)PCR反應(yīng)條管蓋,短暫離心,放入ABI7500實(shí)時(shí)PCR儀中。反應(yīng)程序嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)置。

1.6 結(jié)果判斷 5種突變基因檢測試劑盒常見基因異常包括ALK基因融合、ROS1基因融合、BRAF 15號外顯子基因突變、KRAS 2號外顯子基因突變及EGFR 18、19、20及21號外顯子基因突變?；蛲蛔兘Y(jié)果的判讀嚴(yán)格按照試劑盒說明書陽性判斷值及檢驗(yàn)結(jié)果的解釋進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,基因突變率以(%)表示,臨床病理參數(shù)組間比較用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5種驅(qū)動(dòng)基因突變在NSCLC中的分布 5種驅(qū)動(dòng)基因的總突變率為53.33 %(96/180),未發(fā)現(xiàn)不同驅(qū)動(dòng)基因之間的共存突變。EGFR基因突變率40.56%(73/180),包括19Del突變29例、L858R突變36例、L861Q突變2例、20-Ins突變1例、19Del和T790M雙突變2例、L858R和T790M雙突變2例、G719X和L861Q雙突變1例,在5種驅(qū)動(dòng)基因中突變頻率最高。KRAS基因突變率6.11%(11/180),ALK融合基因突變率4.44%(8/180),ROS1融合基因突變率1.11%(2/180),BRAF基因突變率1.11%(2/180),見圖1、表1。

表1 EGFR、KRAS、BRAF基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 NSCLC 標(biāo)本驅(qū)動(dòng)基因擴(kuò)增曲線

2.2 NSCLC中EGFR、KRAS和BRAF基因突變與臨床病理特征關(guān)系 EGFR基因突變率在女性患者53.57%(30/56)及腺癌患者44.81%(69/154)中較高,性別及組織類型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。KRAS基因突變更容易發(fā)生于男性患者8.87%(11/124),性別差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與年齡、組織類型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。BRAF基因突變率1.11%(2/180),與臨床病理特征無明顯相關(guān)(P>0.05)。見表1。

2.3 NSCLC中ALK和ROS1融合基因與臨床病理特征關(guān)系 融合基因陽性率為5.56%(10/180),其中ALK陽性率在年齡小于60歲患者6.58%(5/76),男性患者4.84%(6/124),腺癌患者5.19%(8/154)中較高,但與年齡、性別、組織類型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ROS1融合基因突變率1.11%(2/180),與臨床病理特征無明顯相關(guān)。見表2。

表2 ALK、ROS1基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 5種驅(qū)動(dòng)基因在不同標(biāo)本類型中的檢測情況EGFR基因在手術(shù)標(biāo)本突變率為36.00%(9/25),活檢標(biāo)本突變率為41.25%(33/80),轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本突變率為43.48%(20/46),細(xì)胞塊標(biāo)本突變率為37.93%(11/29),轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本突變率較高,但不同標(biāo)本類型突變率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。KRAS基因在手術(shù)標(biāo)本突變率為8.00%(2/25),活檢標(biāo)本突變率為6.25%(5/80),轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本突變率為6.52%(3/46),細(xì)胞塊標(biāo)本突變率為3.45%(1/29),不同標(biāo)本類型突變率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ALK基因在手術(shù)標(biāo)本突變率為8.00%(2/25),活檢標(biāo)本突變率為5.00%(4/80),轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本突變率為4.35%(2/46),細(xì)胞塊標(biāo)本突變率為0.00%(0/29),不同標(biāo)本類型突變率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。BRAF基因突變手術(shù)標(biāo)本及轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本各1例。ROS1基因活檢標(biāo)本及轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本各1例。見表1、2。

3 討論

根據(jù)國家癌癥中心2019年公布的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,我國肺癌的發(fā)病率和死亡率居所有惡性腫瘤之首[7]。近年來,隨著新的檢測技術(shù)和針對NSCLC不同驅(qū)動(dòng)基因的發(fā)現(xiàn),以及靶向治療藥物的不斷研發(fā)上市,靶向藥物治療在腫瘤治療中愈發(fā)重要,更加促進(jìn)了NSCLC驅(qū)動(dòng)基因的檢測。標(biāo)本來源及腫瘤細(xì)胞DNA的質(zhì)量是檢測的前提,DNA質(zhì)量及低腫瘤細(xì)胞比例會影響驅(qū)動(dòng)基因的檢出率,李玉勤[8]報(bào)道標(biāo)本質(zhì)量不佳會引起假陰性。本研究采用的ARMS法是針對驅(qū)動(dòng)基因突變設(shè)計(jì)特異的突變引物,確保了高度特異性,是一種高靈敏度的檢測方法,靈敏度可低至1%,適合于活檢及細(xì)胞蠟塊等各種不同樣本類型的檢測。該檢測方法還有操作簡易,結(jié)果易于判讀,報(bào)告周期短等優(yōu)勢,目前在各級醫(yī)院驅(qū)動(dòng)基因檢測中廣泛使用。

EGFR基因其酪氨酸激酶區(qū)域的激活即磷酸化對腫瘤細(xì)胞生長、腫瘤侵襲及細(xì)胞凋亡等相關(guān)信號傳遞具有重要意義[9-11],突變患者可從酪氨酸激酶抑制劑靶向治療中獲益。既往研究表明亞洲NSCLC人群EGFR突變率為30%～50%[12],主要以19DEL和L858R突變?yōu)橹?約占EGFR突變的90%[13]。本實(shí)驗(yàn)中EGFR突變率為40.56%,其中19Del突變及L858R突變占89.04%,稀有突變占10.96%,與上述文獻(xiàn)報(bào)道相近。本研究發(fā)現(xiàn)女性、腺癌患者的EGFR突變率明顯高于男性、非腺癌患者,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而與患者年齡和標(biāo)本類型無關(guān)(P>0.05),與既往報(bào)道一致[9,14]。KRAS基因是EGFR信號通路的下游調(diào)控基因,在EGFR信號傳導(dǎo)通路中起著分子開關(guān)作用,KRAS基因突變是EGFR-TKIs耐藥的重要原因之一[15]。本研究中KRAS基因突變率為6.11%,以2號外顯子的12密碼子為主;男性患者KRAS突變率高于女性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),研究發(fā)現(xiàn)老年、肺腺癌患者陽性率較高,但突變與患者年齡、組織類型無關(guān),與李潔等[16]報(bào)道基本一致。BRAF基因突變導(dǎo)致信號通路的改變和激酶活性的增加,從而促使腫瘤的產(chǎn)生及轉(zhuǎn)移[17],BRAF基因突變患者可在RAF抑制劑威羅菲尼和達(dá)拉菲尼治療中獲益。有研究表明BRAF在NSCLC患者中突變率為1%～8%,與患者性別、年齡及組織學(xué)類型等無關(guān)[18]。本研究中BRAF基因突變率1.11%,與上述文獻(xiàn)報(bào)道相近。

ALK基因常與棘皮動(dòng)物微管蛋白4(Echinoderm microtubuleassociated protein like 4,EML4)形成EML4-ALK融合基因,從而激活A(yù)LK酪氨酸激酶區(qū)、下游PIK3/AKT及MAPK等信號通路導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[19]。ROS1基因與ALK在氨基酸序列上有49%的相似,在酪氨酸激酶催化區(qū)的ATP結(jié)合位點(diǎn)同源性也高達(dá)77%[20]。ALK及ROS1基因融合患者在ALK/ROS抑制劑中明顯受益。有研究表明EML4-ALK融合基因在NSCLC患者中的陽性率為3%～7%[21],ROS1融合基因在NSCLC患者中的陽性率為1.0%～3.4%[22]。本研究中ALK融合基因突變率4.44%,ROS1融合基因突變率1.11%,與上述文獻(xiàn)報(bào)道相近。研究發(fā)現(xiàn)ALK基因融合更好發(fā)于年齡小于60,男性,腺癌患者,但與年齡、性別、組織類型及標(biāo)本類型突變率差均異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ROS1融合基因突變患者因例數(shù)過少無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,后續(xù)將繼續(xù)積累數(shù)據(jù)進(jìn)行探討。

本研究組前期報(bào)道活檢小標(biāo)本、轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本及細(xì)胞蠟塊等不同標(biāo)本類型可用于EGFR基因檢測[9,23],結(jié)果發(fā)現(xiàn)其他驅(qū)動(dòng)基因突變也可在此類不同標(biāo)本類型中檢出,且突變率與標(biāo)本類型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,從而為臨床根據(jù)患者實(shí)際情況選擇合適的標(biāo)本類型提供了依據(jù),增加了基因檢測的取材途徑。本研究4種不同標(biāo)本類型,雖均可檢出驅(qū)動(dòng)基因突變,但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血性胸水細(xì)胞蠟塊標(biāo)本因含大量紅細(xì)胞及炎細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞比例往往較低,在制作細(xì)胞蠟塊前可用免疫磁珠陰性富集法富集腫瘤細(xì)胞能有效提高腫瘤細(xì)胞比例[24];對于活檢標(biāo)本因腫瘤大小、活檢部位及腫瘤異質(zhì)性存在取樣誤差,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞數(shù)量往往有限,故對基因檢測切片前及切片后的HE切片進(jìn)行細(xì)胞分析,可大致評估出樣本中的腫瘤細(xì)胞數(shù)和比例,對于腫瘤細(xì)胞數(shù)及比例過低的樣本,可采取顯微切割的方法對切片中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集,以提高腫瘤細(xì)胞的比例,從而達(dá)到ARMS法檢測閾值[25];轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本,特別是骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本切片時(shí)常因骨組織而難以切片,取材前需置于酸性條件下進(jìn)行脫鈣處理,引起DNA的降解及片段化,從而導(dǎo)致PCR的擴(kuò)增效率下降,對于骨轉(zhuǎn)移組織樣本可采用表面脫鈣法,脫鈣后流水沖洗,可有效降低浸泡法對細(xì)胞DNA的降解,并在上機(jī)時(shí)適當(dāng)增加上樣濃度,可增加此類樣本實(shí)驗(yàn)的檢出率。綜上可知,手術(shù)標(biāo)本為首選樣本,在患者無法手術(shù)的情況下活檢標(biāo)本、轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本及細(xì)胞蠟塊標(biāo)本也可作為有效檢測樣本,對于少數(shù)無法獲得組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的晚期患者,可用血液替代檢測[6]。

早期研究認(rèn)為NSCLC的基因突變是相互獨(dú)立、相互排斥的,近年來有文獻(xiàn)報(bào)道雙驅(qū)動(dòng)基因共突變在NSCLC中可以共存[26]。本研究未發(fā)現(xiàn)不同驅(qū)動(dòng)基因之間的共存突變,可能與腫瘤異質(zhì)性、樣本量不夠大有關(guān),在后續(xù)的檢測中繼續(xù)積累數(shù)據(jù)探討。本實(shí)驗(yàn)EGFR基因手術(shù)標(biāo)本突變率低于其他標(biāo)本類型,可能與手術(shù)標(biāo)本量較少有關(guān),也證實(shí)我國NSCLC患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)大多失去最佳的手術(shù)機(jī)會,后續(xù)的檢測中將繼續(xù)積累數(shù)據(jù)探討;轉(zhuǎn)移病灶樣本EGFR突變率最高,可能與突變導(dǎo)致腫瘤高負(fù)荷,更易導(dǎo)致腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)[27]。實(shí)驗(yàn)中活檢標(biāo)本及細(xì)胞蠟塊標(biāo)本經(jīng)過HE及免疫組化的連續(xù)切片,導(dǎo)致樣本的損耗,以往單基因多次檢測造成樣本的不足,且提供的基因信息有限,多基因聯(lián)合檢測相比單基因檢測能一次測出多種基因狀態(tài),為臨床治療提供更多指導(dǎo)信息,同時(shí)解決樣本量不足的問題,也可縮短報(bào)告周期。

4 結(jié)論

不同類型標(biāo)本均可用于驅(qū)動(dòng)基因檢測,增加了患者基因檢測取樣途徑,并分析與臨床病理特征的關(guān)系,從而篩選出適合基因檢測的NSCLC患者,為患者靶向藥物治療提供更多基因信息參考和依據(jù)。