不同pH 值溶劑對(duì)昭通烏天麻多糖提取率及抗氧化能力研究

李俊杰，黃 艷，亢凱杰，張幫磊， 李 浪，2

（1.昭通學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南昭通 657000；2.云南省高校高原特色功能食品研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昭通 657000；3.昭通學(xué)院云南食品安全昭通研究院，云南昭通 657000）

天麻是一種具有藥用價(jià)值的蘭科非自養(yǎng)型生物，可入藥，也可作為食品食用，并且具有較高的食用價(jià)值[1]。天麻在2018 年被列入藥食同源的中藥材，主要藥用成分為天麻素、多糖、多酚、皂苷等活性成分。Wei L 等人[2]發(fā)現(xiàn)，天麻具有鎮(zhèn)定催眠、抗衰老、抗氧化等作用。陳小銀等人[3]發(fā)現(xiàn)天麻素可抑制海馬體興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)受體Glu 的表達(dá)的作用和活化海馬抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體GABA 的活性與表達(dá)，從而抑制癲癇的發(fā)生。Jie W等人[4]通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)了天麻具有降低高血壓及緩解高血壓引起的頭暈、頭痛、疲勞、腰膝乏力等癥狀。天麻如此廣泛的功能性，除了天麻素外離不開(kāi)天麻多糖的貢獻(xiàn)，張雙奇等人[5]對(duì)天麻多糖的抗氧化作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明天麻多糖具有較強(qiáng)的抗氧化的作用。另外，多糖還具有抗衰老的作用[6]，繆化春等人[7]發(fā)現(xiàn)天麻多糖具有降血壓、降血糖等功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，天麻多糖也是天麻中最主要的生物活性成分之一，且還具有增強(qiáng)免疫力[8]、抗腫瘤[9]、抗氧化[10]等功能。而抗氧化的關(guān)鍵在于清除自由基能力，自由基在人體生命的過(guò)程中是各類化學(xué)反應(yīng)的主要中間產(chǎn)物，一旦人體內(nèi)形成過(guò)量的自由基而未能有效清除，這些自由基就會(huì)威脅機(jī)體內(nèi)的生命大分子物質(zhì)及各類細(xì)胞器，最常見(jiàn)的原因便是由于過(guò)量的自由基產(chǎn)生加快機(jī)體的老化[10-11]。因此，想要降低過(guò)量的自由基產(chǎn)生所造成的損害，尋找有效低毒的抗氧化劑是至關(guān)重要的第一步，該研究重點(diǎn)對(duì)昭通烏天麻多糖的羥基自由基、DPPH 自由基等的清除能力進(jìn)行探究，為今后天麻多糖的抗氧化能力的研究提供了基礎(chǔ)，對(duì)昭通的經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著巨大的貢獻(xiàn)，也為帶動(dòng)昭通地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有一定的貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干烏天麻，產(chǎn)自昭通彝良小草壩；苯酚、濃硫酸、乙酸鉛、Tris-HCl 緩沖溶液、DPPH-乙醇溶液、鄰苯三酚、水楊酸納-乙醇溶液、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、冰乙酸、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、維C 標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%），天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司提供；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%），上海源葉生物科技有限公司提供。

UV-2700 型分光光度計(jì)，SHIMADZU 島津公司產(chǎn)品；YRE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；pHS-3E 型精密pH 計(jì)，上海虹益儀器儀表有限公司產(chǎn)品；PT-3502C 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀，北京普天新橋技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 天麻多糖的提取

參考文獻(xiàn)[12]中方法稍作修改。采用熱水浸提法提取天麻多糖，通過(guò)配制不同pH 值的緩沖溶液，在95 ℃熱水中提取天麻多糖。操作中采用水提法，按照料液比為1∶20，pH 值分別為2，4，6，8，10進(jìn)行提取，提取時(shí)間為30 min，重復(fù)提取1 次，合并濾液后濃縮，并用乙酸鉛除去蛋白成分，用85%乙醇進(jìn)行醇沉、過(guò)濾，經(jīng)冷凍、干燥得到天麻粗多糖。

1.2.2 多糖含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[13-14]中方法稍作修改。

1.2.3 乙醇分級(jí)沉淀

參考文獻(xiàn)[15-16]中方法進(jìn)行乙醇分級(jí)沉淀。向裝有已知體積的多糖濃縮液中加入乙醇使整個(gè)溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)55%，沉淀12 h，過(guò)濾，得到55%乙醇醇沉的天麻多糖；繼續(xù)向?yàn)V液中加入乙醇，直至乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，沉淀12 h，過(guò)濾，得到65%乙醇醇沉的天麻多糖。類推上述操作，得到75%，85%的乙醇醇沉的天麻多糖。

1.2.4 天麻多糖的分離

參考文獻(xiàn)[17-18]中方法稍作修改，采用DEAE-52 纖維素作為層析柱的填料，將上述天麻粗多糖離心后取上清液，用0.45 μm 的水系過(guò)濾器過(guò)濾。濾液沿著玻璃層析柱的內(nèi)壁緩慢加入DEAE-52 纖維素層析柱中，分別用濃度為0.1，0.2，0.4 mol/L 的NaCl溶液梯度洗脫，控制流速為1 mL/min，每支試管接5 mL 的洗脫液，采用苯酚-硫酸法進(jìn)行顯色跟蹤，當(dāng)加入長(zhǎng)時(shí)間收集液的顏色和加入蒸餾水的樣色一致時(shí)，即可判斷為無(wú)糖，換下一梯度的洗脫劑繼續(xù)進(jìn)行再次洗脫，當(dāng)最終的顏色變化不明顯時(shí)，可以停止洗脫。

1.2.5 天麻多糖抗氧化能力測(cè)定

羥自由基清除能力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]中方法進(jìn)行，DPPH 自由基抑制率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[20]中方法稍作修改進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH 值溶劑對(duì)天麻粗多糖提取率的影響

不同pH 值對(duì)天麻多糖提取率變化見(jiàn)圖1。

圖1 不同pH 值對(duì)天麻多糖提取率變化

由圖1 可知，在pH 值為4 時(shí)天麻多糖的提取率達(dá)到最高，為23.36%；當(dāng)pH 值為2 時(shí)多糖提取率則最低，說(shuō)明在適當(dāng)?shù)娜跛嵝詶l件下能夠增加天麻多糖的提取率；在pH 值為2 時(shí)提取率卻比pH 值為4 時(shí)大大降低，可能是強(qiáng)酸性條件下有可能會(huì)引起多糖中的糖苷鍵斷裂，從而引起多糖水解，使其提取率降低。同理，pH 值為10 時(shí)提取率比pH 值為6時(shí)的提取率降低，也可能是因?yàn)閺?qiáng)堿性條件下引起多糖中的糖苷鍵斷裂，多糖發(fā)生水解而導(dǎo)致提取率降低。

2.2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉對(duì)天麻粗多糖提取率的影響

pH 值為4 的不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉天麻多糖提取率見(jiàn)圖2。

圖2 pH 值為4 的不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉天麻多糖提取率

由圖2 可知，通過(guò)配制不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇醇沉得出的多糖提取率不同。其中，85%的乙醇醇沉得到的天麻多糖提取率最高，55 %乙醇醇沉得到的多糖提取率最低，可知乙醇醇沉多糖得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加。

2.3 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉的天麻粗多糖的抗氧化能力研究

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)醇沉多糖對(duì)羥基自由基的抑制率見(jiàn)圖3，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉多糖對(duì)DPPH 自由基的抑制率見(jiàn)圖4。

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)醇沉多糖對(duì)羥基自由基的抑制率

圖4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉多糖對(duì)DPPH 自由基的抑制率

由圖3 和圖4 可知，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉多糖對(duì)羥基自由基均有抑制率，多糖質(zhì)量濃度越高抑制效果越好，同一組多糖在不同體積分?jǐn)?shù)下羥基自由基抑制率差異性明顯。通過(guò)85%乙醇醇沉所得多糖對(duì)羥基自由基的抑制效果最好，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.20 mg/mL 時(shí)抑制率為69.56%，55%乙醇醇沉所得多糖對(duì)羥基自由基的抑制率最低，為61.73%。由圖4 可知，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉多糖對(duì)DPPH 自由基的抑制率隨著多糖質(zhì)量濃度升高而升高。醇沉液體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)多糖對(duì)DPPH 自由基的抑制率最高，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.20 mg/mL 時(shí)抑制率為42.16%。

2.4 天麻多糖的分離純化

天麻粗多糖的分離見(jiàn)圖5。

圖5 天麻粗多糖的分離

由圖5 可知，0.1 mol/L 的氯化鈉溶液在第92 管時(shí)顯色無(wú)糖，進(jìn)行下一濃度梯度的洗脫，0.2 mol/L 的氯化鈉溶液在第150 管時(shí)顯色無(wú)糖，可進(jìn)行下一濃度梯度的洗脫，0.4 mol/L 的氯化鈉在193 管時(shí)顯色無(wú)糖。從圖5 中的洗脫曲線中可看出，所測(cè)得的吸光度有2 個(gè)峰值，分別在第7 管和第76 管出現(xiàn)峰值，由于前面洗脫出的含有淀粉等雜質(zhì)，不能確定為純的多糖，所以棄去前一個(gè)峰值。收集第55～79 管的洗脫液，合并洗脫液，濃縮后測(cè)定多糖的抗氧化值，為多糖的功能特性研究奠定基礎(chǔ)。

2.5 不同pH 值條件提取的天麻多糖組分的抗氧化能力研究

不同pH 值條件提取的天麻多糖抗氧化能力見(jiàn)圖6。

圖6 不同pH 值條件提取的天麻多糖抗氧化能力

圖6（a）～圖6（d）分別代表pH 值為4，6，8，10 時(shí)提取的天麻粗多糖按照上述分離方法得出的多糖組分對(duì)羥基自由基和DPPH 自由基均有抑制率。由此可知，天麻多糖對(duì)羥基自由基和DPPH 自由基的抑制率隨著質(zhì)量濃度的升高而升高，且天麻多糖對(duì)羥基自由基的抑制率高于對(duì)DPPH 自由基。提取液pH 值為4 時(shí)提取的0.02 mg/mL 天麻多糖羥基自由基清除率最高，達(dá)75.61%；隨著提取液pH 值的升高，所提取的多糖羥基自由基抑制率越低，當(dāng)提取液值pH 值為10 時(shí)，羥基自由基清除率為9.95%。提取液pH 值為4 和6 時(shí)，0.02 mg/mL 天麻多糖對(duì)DPPH 自由基抑制率相當(dāng)；而提取液pH 值為8 和10時(shí)，0.02 mg/mL天麻多糖對(duì)DPPH 自由基抑制率分別為20.56%和7.22%，遠(yuǎn)低于酸性提取液所提取的多糖組。

3 結(jié)論

通過(guò)配制不同pH 值緩沖溶劑提取天麻多糖，對(duì)粗多糖進(jìn)行除蛋白處理，然后通過(guò)DEAE-52 纖維素為填料進(jìn)行初步分離，并以羥自由基的清除能力和DPPH 自由基抑制率為考查指標(biāo)探究各處理組天麻多糖的抗氧化能力。結(jié)果表明，pH 值為4 的緩沖液提取的天麻粗多糖的提取率最高，為23.6%；提取率隨著pH 值的升高呈現(xiàn)出一個(gè)先升高后降低的趨勢(shì)，此pH 值條件下通過(guò)85%乙醇醇沉所得多糖對(duì)羥基自由基的抑制效果最好，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.20 mg/mL時(shí)抑制率為69.56%，醇沉液體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)多糖對(duì)DPPH 自由基的抑制率最高，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.20 mg/mL 時(shí)抑制率為42.16%。將不同pH 值條件下提取的天麻粗多糖進(jìn)行分離純化，發(fā)現(xiàn)提取液pH 值為4時(shí)0.02 mg/mL 天麻多糖羥基自由基清除率最高達(dá)75.61%，酸性條件下無(wú)論是粗多糖還是分離出的多糖組分，其對(duì)羥基自由基抑制率和DPPH 自由基抑制率均高于堿性提取液所提取的多糖組。王慶等人[21]發(fā)現(xiàn)，超聲輔助和酶法提取的天麻多糖的抗氧化活性遠(yuǎn)高于其他提取方法。陳琛等人[22]對(duì)天麻多糖的分離純化后測(cè)定其活性，得出對(duì)DPPH 自由基的清除率為44.50%，對(duì)羥自由基清除率為39.50%，與研究結(jié)果相似。綜上所述，不同pH 值和不同醇沉液體積分?jǐn)?shù)不僅對(duì)天麻多糖提取率影響較大，且還影響其抗氧化能力，選擇合適pH 值的提取液更有利于高活性天麻多糖的制備，研究對(duì)高活性天麻多糖的提取及應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。