離子色譜法測(cè)定人凝血因子Ⅷ中鈣離子含量

馮建杰,周長(zhǎng)明,郜昭慧（北京市藥品檢驗(yàn)研究院,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206）

離子色譜法是采用高壓輸液泵將洗脫液泵入色譜柱中，對(duì)可解離物質(zhì)進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法，廣泛用于測(cè)定無(wú)機(jī)陰離子、無(wú)機(jī)陽(yáng)離子、有機(jī)酸、糖等成分的含量，在藥品質(zhì)量分析領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[1-6]。

凝血因子Ⅷ的生理作用是在血管出血時(shí)被激活，和血小板粘連在一起并且補(bǔ)塞血管上的漏口，這個(gè)過(guò)程被稱為凝血[7]。在血友病中，80%的病人患有血友病A，該類病人主要缺少正常人所擁有的凝血因子Ⅷ[8-9]。我國(guó)市場(chǎng)上除了德國(guó)拜耳公司的重組凝血因子Ⅷ，其他均為國(guó)內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)，均從血液中提取。鈣離子在凝血中扮演著非常重要的角色，鈣離子能夠促進(jìn)凝血因子的激活，在凝血過(guò)程中，凝血因子需要被激活才能發(fā)揮作用[10-14]。而鈣離子能夠與凝血因子相互作用，促進(jìn)其激活，從而加速凝血過(guò)程。此外，鈣離子還能夠促進(jìn)血小板的聚集，增強(qiáng)血小板與血管壁的黏附力，從而形成血栓，防止血液過(guò)度流失。本論文中建立了測(cè)定人凝血因子Ⅷ中鈣離子含量的離子色譜方法，該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，比傳統(tǒng)鈣離子測(cè)定所用的試劑盒及原子吸收法提高了準(zhǔn)確率和工作效率，可準(zhǔn)確測(cè)定樣品中鈣離子含量，為更好地把控該品種質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Thermo ICS-3000型離子色譜儀，AERS 500型抑制器（規(guī)格為4mm），均購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；Arium Pro型超純水機(jī)購(gòu)自德國(guó)賽多利斯公司；XA205型電子分析天平購(gòu)自梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為十萬(wàn)分之一。

1.2試藥 鈣離子標(biāo)準(zhǔn)溶液購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)為17083，質(zhì)量濃度為1000μg/mL；人凝血因子Ⅷ來(lái)自于兩個(gè)廠家（A廠家：批號(hào)分別為202211080，202211082，202 301005；B廠家：批號(hào)為B20221004）。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備 精密量取0.5、1.0、1.5、2.0，2.5mL質(zhì)量濃度為25mmol/L的鈣離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于25mL容量瓶中，用純化水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；取供試品一支，用10ml注射用水復(fù)溶，搖勻作為供試品溶液；取注射用水作為空白溶劑。

2.2色譜條件 色譜柱：CS12A陽(yáng)離子交換柱（250mm×4mm）或效能相當(dāng)?shù)纳V柱；流動(dòng)相：0.025mol/L甲烷磺酸溶液；使用電導(dǎo)檢測(cè)器，使用CSRS ULTRAⅡ4mm抑制器，抑制電流為90mA；流速1.0mL/min；檢測(cè)器溫度為35℃；進(jìn)樣量25μL。

2.3方法學(xué)考察 參照2020版《中國(guó)藥典》第四部9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)考察。

2.3.1專屬性 取2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶劑各25μL，照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，空白溶劑色譜圖中在主成分峰位置處無(wú)峰檢測(cè)到，對(duì)測(cè)定結(jié)果不產(chǎn)生干擾。供試品溶液色譜圖中色譜峰與對(duì)照品溶液色譜圖中色譜峰保留時(shí)間一致。

2.3.2線性關(guān)系與定量限檢測(cè)限 取質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L的系列對(duì)照品溶液，照2.2項(xiàng)下色譜條件分別注入離子色譜進(jìn)行分析，以鈣離子質(zhì)量濃度（X，mmol/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=12.618X-0.467，r=0.9998（n=5）。取質(zhì)量濃度為1.5mmol/L鈣離子對(duì)照品溶液，用純化水逐級(jí)稀釋，并進(jìn)行離子色譜檢測(cè)，記錄峰面積及S/N值，以S/N=3時(shí)測(cè)得量為檢測(cè)限，S/N=10時(shí)測(cè)得量為定量限。測(cè)得檢測(cè)限為0.0003mmol/L，定量限為0.0006mmol/L。線性關(guān)系表明，鈣離子在0.5-2.5mmol/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為1.5mmol/L對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果鈣離子峰面積的RSD為1.00%（n=6），證明此儀器精密度良好。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)為202211080）適量，照2.1項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，并照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品定量測(cè)定。鈣離子含量的RSD為1.14%（n=6），證明此方法重復(fù)性良好。

2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)為202211080）適量，照2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、12、24小時(shí)，照2.2項(xiàng)下色譜條件分別于規(guī)定時(shí)間進(jìn)樣測(cè)定。鈣離子峰面積的RSD為0.91%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的樣品1支，用10mL注射用水復(fù)溶，搖勻?yàn)楣┰嚻啡芤?。精密量取質(zhì)量濃度為25mmol/L對(duì)照品溶液0.12、0.15、0.18mL，分別置于2.5mL容量瓶中，各質(zhì)量濃度平行制備3份，用供試品溶液稀釋至刻度。取上述溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算加樣回收率。鈣離子回收率平均值為99.70%，RSD為0.76%（n=9），證明此方法準(zhǔn)確度良好。

2.4樣品中鈣離子含量測(cè)定 隨機(jī)取樣品4批（批號(hào)分別為202211080，202211082，202301005，B20221004）樣品，照2.1項(xiàng)下制備供試品溶液。分別采用離子色譜法以及現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中試劑盒法、原子吸收法測(cè)定鈣離子的含量，結(jié)果見表1。

表1 離子色譜法與其他方法測(cè)定鈣離子含量結(jié)果比較(mmol/L)

3 討論

現(xiàn)行版中國(guó)藥典中并未對(duì)人凝血因子Ⅷ中鈣離子進(jìn)行控制，國(guó)內(nèi)廠家執(zhí)行的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBS0126201中以試劑盒法測(cè)定鈣離子的含量，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBS00172020中以原子吸收法測(cè)定鈣離子的含量。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，原子吸收法測(cè)定鈣離子含量前處理復(fù)雜，耗費(fèi)檢驗(yàn)時(shí)間，測(cè)定過(guò)程中乙炔氣體的燃燒有潛在危險(xiǎn)性，且有可能造成結(jié)果誤差大。而試劑盒法所采用的試劑盒價(jià)格較貴且效期短，對(duì)于不能集中時(shí)間進(jìn)行測(cè)定的樣品實(shí)驗(yàn)材料損耗較大。有研究[15-16]表明，離子色譜法不僅操作簡(jiǎn)便、快捷高效，還能同時(shí)測(cè)定鎂、鈣、鈉、鉀等多種金屬離子。本文建立的離子色譜法測(cè)定人凝血因子Ⅷ中鈣離子含量，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、樣品消耗量少，可在線自動(dòng)連續(xù)檢測(cè)，極大地縮短了檢驗(yàn)時(shí)限。此方法可進(jìn)一步提高對(duì)本產(chǎn)品的質(zhì)量控制，為該品種全面質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。