低強(qiáng)度超聲對Rhodotorula mucilaginosa Z1降解硝基苯的強(qiáng)化作用

金 若 菲， 柳 廣 飛， 王 競， 滕 麗 曼， 周 集 體

（1.大連理工大學(xué) 工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116024；2.大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116024）

0 引 言

生物學(xué)研究表明，低頻率（20～50kHz）低強(qiáng)度（聲強(qiáng)小于10W／cm2）的超聲具有獨(dú)特的生物效應(yīng)，它不會(huì)破壞細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)，能提高酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞生長，提高細(xì)胞膜的通透性［1－2］，同時(shí)還可提高基因轉(zhuǎn)化和表達(dá)等［3－5］.Lin等發(fā)現(xiàn)利用低功率的超聲（功率密度＜113.9mW／cm2，照射周期1～8min）輻照紫草細(xì)胞可以顯著增加紫草素合成量并增加細(xì)胞膜的通透性［6］.Pitt等發(fā)現(xiàn)低頻率低強(qiáng)度的超聲（70kHz，2W／cm2）可以增加表皮葡萄球菌細(xì)胞的增殖速度［7］.一般認(rèn)為這些生物效應(yīng)主要是由超聲空化作用和機(jī)械傳質(zhì)作用引起的，同時(shí)這些效應(yīng)的表現(xiàn)在不同種群的微生物中差異很大［8］.

近年來，研究者將低強(qiáng)度超聲引入活性污泥這種復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)中對生物處理過程進(jìn)行強(qiáng)化，利用其生物效應(yīng)，提高生物活性和處理效果，增加容積負(fù)荷.Zhang等利用低強(qiáng)度超聲強(qiáng)化SBR反應(yīng)器考察不同碳氮比條件下的脫氮效果，在碳氮比為5∶1時(shí)，經(jīng)過超聲處理后污泥的負(fù)荷分別提高44.6%和50%，同時(shí)超聲對其微生物群落結(jié)構(gòu)也有很大的影響，超聲強(qiáng)化組的群落結(jié)構(gòu)簡單且穩(wěn)定［9］.Xie等研究表明0.1～1.2W／cm2的超聲對生物硝化作用影響不顯著而對反硝化的強(qiáng)化作用明顯，反硝化速率提高16%［10］.以上研究證明了低強(qiáng)度超聲對生物降解作用的強(qiáng)化，但對其強(qiáng)化機(jī)理的分析，一般只是簡單引用醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究結(jié)論.超聲對活性污泥中微生物活性和新陳代謝的影響規(guī)律及超聲作用參數(shù)的選取原則還需深入研究.

本文以一株對硝基苯具有高效降解能力的黏性紅圓酵母（RhodotorulamucilaginosaZ1，R.mucilaginosaZ1）為研究對象，在其對硝基苯降解過程中，考察超聲強(qiáng)化作用對菌種的增殖、細(xì)胞膜的通透性及關(guān)鍵酶活性的影響，以期對超聲強(qiáng)化的效果及作用機(jī)理有深入的了解.

1 材料與方法

1.1 菌株及廢水

R.mucilaginosaZ1由本研究室分離純化，該菌可以以硝基苯為唯一碳、氮源生長，目前保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，編號為CGMCC No1758［11］.

實(shí)驗(yàn)用硝基苯廢水為模擬廢水，其組成為不同濃度的硝基苯、0.002g／L檸檬酸鐵、0.01g／L CaCl2·2H2O、0.02g／L MgSO4·7H2O、1.0g／L KH2PO4、7.0g／L Na2HPO4·12H2O.

1.2 超聲強(qiáng)化降解實(shí)驗(yàn)

超聲強(qiáng)化降解實(shí)驗(yàn)在500mL無菌三角燒瓶中進(jìn)行，將活化后的R.mucilaginosaZ1投加到模擬硝基苯廢水中，使反應(yīng)體積為300mL，用棉花塞密封.首先在超聲清洗機(jī)上進(jìn)行超聲輻照處理，處理?xiàng)l件為25kHz，180W，25℃，15min.處理后體系移到30℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，定時(shí)取樣測定硝基苯的降解及R.mucilaginosaZ1的生長情況，同時(shí)以不進(jìn)行超聲處理的體系作為對照.

1.3 硝基苯及菌體濃度的測定方法

硝基苯濃度的測定采用紫外可見分光光度法，即在268nm處測其吸光度，然后根據(jù)質(zhì)量濃度與吸光度的回歸方程計(jì)算其濃度.

R.mucilaginosaZ1的生長量用降解體系660nm處的吸光度表示.

1.4 R.mucilaginosa Z1中粗酶含量及酶活的測定

收集不同降解時(shí)間的菌體，用Na3PO4緩沖溶液（pH＝7.2，20mmol／L）洗滌后離心（4 ℃，12 000g，10min）.4 ℃下破碎后離心（4 ℃，12 000g，20min），上清液即為粗酶，用考馬斯亮藍(lán)G－250染色法測定粗酶濃度.

酶活的測定體系為0.3～1.0mg粗酶，0.3 μmol鄰苯二酚或2－氨基苯酚，用Tris－HCl緩沖溶液（50mmol／L，pH＝8.0）定容至3mL.檢測260nm處順，順－己二烯二酸的吸光度（鄰苯二酚－1，2－雙加氧酶的酶活）、375nm 處2－羥基粘康酸半縮醛的吸光度（鄰苯二酚－2，3－雙加氧酶的酶活）及380nm處2－氨基粘康酸半縮醛的吸光度（2－氨基苯酚－1，6－雙加氧酶的酶活）［12－13］.

1.5 硝基苯在R.mucilaginosa Z1細(xì)胞內(nèi)外的分布及降解率計(jì)算

硝基苯在R.mucilaginosaZ1細(xì)胞外、內(nèi)及細(xì)胞膜上的濃度分布測定方法見文獻(xiàn)［14－15］.計(jì)算表觀降解率和真實(shí)降解率為

式中：ρ1為初始硝基苯濃度，ρ2、ρ3、ρ4分別為R.mucilaginosaZ1細(xì)胞外、內(nèi)及細(xì)胞膜上的硝基苯濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲對硝基苯降解及R.mucilaginosa Z1生長的影響

配制濃度分別為105.0、304.5、589.5mg／L硝基苯模擬廢水，考察低強(qiáng)度超聲的輻照作用對不同濃度硝基苯的降解影響，同時(shí)測定濃度為589.5mg／L的硝基苯廢水降解過程中菌體的生長量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.

由圖1可知，對于初始濃度為105.0mg／L硝基苯的降解，低強(qiáng)度超聲的強(qiáng)化作用不明顯，超聲組和對照組在10h左右去除率都達(dá)到了90%以上.對于初始濃度為304.5mg／L硝基苯，低強(qiáng)度超聲具有一定的強(qiáng)化效果，超聲組在15h時(shí)降解率達(dá)到了90%，而對照組在20h的時(shí)候才達(dá)到，說明超聲提高了降解速率，但兩者的最終去除率類似，都可以達(dá)到92%.對于初始濃度為589.5 mg／L硝基苯，低強(qiáng)度超聲的強(qiáng)化作用更加明顯，尤其是在降解的前8h中，超聲組和對照組的降解率分別為44.2%和25.4%，超聲組可以顯著提高R.mucilaginosaZ1對高濃度硝基苯的適應(yīng)性，而對照組的降解存在著很大的抑制，但與中濃度硝基苯的降解類似，超聲只是提高了降解速率，并沒有提高最終的去除率，兩者最終的去除率均可以達(dá)到89%.

圖1 R.mucilaginosa Z1對不同初始濃度硝基苯的降解情況Fig.1 Degradation of different concentrations of nitrobenzene by R.mucilaginosa Z1

測定初始濃度為589.5mg／L硝基苯降解體系中菌體的生長情況，與降解效果一致，超聲組由于降解速率較高，其生長速率也較快，但菌體的最終OD660均可達(dá)到0.56左右，說明R.mucilaginosaZ1可以很好地利用硝基苯作為唯一碳、氮源生長，但超聲作用并沒有提高菌體的生長量.

2.2 超聲對R.mucilaginosa Z1粗酶含量的影響

將降解結(jié)束的超聲組及對照組中的R.mucilaginosaZ1收集，測定其粗酶含量.經(jīng)測定，對照組和超聲組R.mucilaginosaZ1的粗酶含量分別為20.97mg／L和23.12mg／L，超聲組釋放的粗酶較對照組增加了10%.可能是超聲對菌體產(chǎn)生刺激，菌體為了應(yīng)對這種來自外界的刺激，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，改變體內(nèi)某些蛋白的合成過程，使蛋白合成量增加.

2.3 超聲對R.mucilaginosa Z1酶活的影響

考察不同降解時(shí)間，R.mucilaginosaZ1的鄰苯二酚－1，2－雙加氧酶、鄰苯二酚－2，3－雙加氧酶和2－氨基苯酚－1，6－雙加氧酶酶活的變化，硝基苯初始濃度為589.5mg／L，結(jié)果如圖2所示.

由圖2可知，無論是超聲組還是對照組，都是以2－氨基苯酚－1，6－雙加氧酶的活性為主，酶活在0.13～0.42U·mg－1變化，而鄰苯二酚－1，2－雙加氧酶和鄰苯二酚－2，3－雙加氧酶的酶活在0.003～0.012U·mg－1變化，說明R.mucilaginosaZ1對硝基苯的降解遵循的是部分還原氧化途徑，超聲強(qiáng)化作用并沒有改變其降解途徑.同時(shí)在整個(gè)降解過程中超聲組的2－氨基苯酚－1，6－雙加氧酶的活性均比對照組高，最高可以達(dá)到0.42U·mg－1，平均比對照組高出8.8%，說明菌體為了抵御超聲這種外界刺激提高了降解酶的活性.

2.4 R.mucilaginosa Z1細(xì)胞內(nèi)外硝基苯濃度的分布情況

配制不同的硝基苯模擬廢水，其濃度分別為105.0、183.0、304.5、523.8、589.5mg／L，在降解10h時(shí)分別測定R.mucilaginosaZ1細(xì)胞內(nèi)、外及細(xì)胞膜上硝基苯濃度的分布情況，如表1所示.

由表1可知，對于不同初始濃度，硝基苯在細(xì)胞內(nèi)、外及細(xì)胞膜上的分布規(guī)律類似，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外超聲組的濃度均低于對照組，而在細(xì)胞膜上兩者類似.以初始濃度為523.8mg／L為例，細(xì)胞外對照組的濃度為239.5mg／L，而超聲組為218.0mg／L，比對照組低8.9%，這可能是因?yàn)榈蛷?qiáng)度超聲的干預(yù)使得細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了改變，使得從細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的傳質(zhì)阻力減小，硝基苯更容易穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部在相應(yīng)酶的作用下被降解；對照組與超聲組細(xì)胞內(nèi)的濃度分別為27.3mg／L和24.4mg／L，這說明超聲增加了細(xì)胞內(nèi)酶的活性，提高了細(xì)胞內(nèi)硝基苯的降解速率.

圖2 R.mucilaginosaZ1降解硝基苯過程中酶活的變化Fig.2 Changes of enzyme activities of R.mucilaginosa Z1during biodegradation of nitrobenzene

表1 不同初始硝基苯濃度下R.mucilaginosa Z1細(xì)胞內(nèi)、外及細(xì)胞膜上硝基苯的分布Tab.1 Cellular nitrobenzene distribution of R.mucilaginosa Z1in the presence of different initial concentrations of nitrobenzene

2.5 超聲對硝基苯的表觀降解率及真實(shí)降解率的影響

根據(jù)2.4中不同初始硝基苯濃度下，硝基苯在細(xì)胞外、細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)的分布情況計(jì)算其表觀和真實(shí)降解率D，結(jié)果如圖3所示.

圖3 R.mucilaginosa Z1對不同初始濃度硝基苯的降解率Fig.3 Degradation efficiencies of R.mucilaginosa Z1 for different initial concentrations of nitrobenzene

由圖3可見，對于R.mucilaginosaZ1，無論是否有超聲作用，其表觀降解率均高于真實(shí)降解率.另外超聲組的降解率均高于對照組，結(jié)合上面實(shí)驗(yàn)的分析證明，主要是超聲作用改變了細(xì)胞膜的通透性和促進(jìn)了酶活.

3 結(jié) 論

（1）對于低濃度硝基苯的降解，低強(qiáng)度超聲的強(qiáng)化作用不明顯，而對于中高濃度硝基苯的降解，低強(qiáng)度超聲具有一定的強(qiáng)化效果，但只是提高了降解速率，并沒有提高最終的去除率.同時(shí)超聲作用沒有提高生物的生長量.

（2）超聲強(qiáng)化作用可以提高R.mucilaginosaZ1粗酶的含量，超聲組粗酶較對照組增加了10%.

（3）R.mucilaginosaZ1對硝基苯的降解中以2－氨基苯酚－1，6－雙加氧酶的活性為主，說明降解遵循的是部分還原氧化途徑.同時(shí)超聲提高了2－氨基苯酚－1，6－雙加氧酶的活性，超聲組平均比對照組高出8.8%.

（4）通過對R.mucilaginosaZ1細(xì)胞內(nèi)、外及細(xì)胞膜上的硝基苯分布規(guī)律的測定，說明超聲改變了細(xì)胞膜的通透性，減小了硝基苯從細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的傳質(zhì)阻力.

［1］Schl fer O，Sievers M，Klotzbücher H，etal.Improvement of biological activity by low energy ultrasound assisted bioreactors ［J］.Ultrasonics，2000，38（1－8）：711－716.

［2］呂霞付，楊海麟，王 武.超聲波在生物發(fā)酵工程中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通訊，2001，12（4）：310－313.LYU Xia－fu，YANG Hai－lin，WANG Wu.The application of ultrasonic in fermentation engineering［J］.Letters in Biotechnology，2001，12（4）：310－313.（in Chinese）

［3］Aoyama T，Hosseinkhani H，Yamamoto S，etal.Enhanced expression of plasmid DNA－cationized gelatin complex by ultrasound in murine muscle［J］.Journal of Controlled Release，2002，80（1－3）：345－356.

［4］Anwer K，Kao G，Proctor B，etal.Ultrasound enhancement of cationic lipid－mediated gene transfer to primary tumors following systemic administration［J］.Gene Therapy，2000，7（21）：1833－1839.

［5］Barton S，Bullock C， Weir D.The effects of ultrasound on the activities of some glycosidase enzymes of industrial importance ［J］.Enzyme and Microbial Technology，1996，18（3）：190－194.

［6］LIN Li－dong， WU Jian－yong.Enhancement of shikonin production in single－ and two－phase suspension cultures ofLithospermumerythrorhizoncells using low－energy ultrasound［J］.Biotechnology and Bioengineering，2002，78（1）：81－88.

［7］Pitt W G，Ross S A.Ultrasound increases the rate of bacterial cell growth［J］.Biotechnology Progress，2003，19（3）：1038－1044.

［8］Koch S，Pohl P，Cobet U，etal.Ultrasound enhancement of liposome－mediated cell transfection is caused by cavitation effects ［J］.Ultrasound in Medicine and Biology，2000，26（5）：897－903.

［9］ZHANG Rui－na，JIN Ruo－fei，LIU Guang－fei，etal.Study on nitrogen removal performance of sequencing batch reactor enhanced by low intensity ultrasound ［J］.Bioresource Technology，2011，102（10）：5717－5721.

［10］XIE Bei－zhen， LIU Hong.Enhancement of biological nitrogen removal from wastewater by lowintensity ultrasound ［J］.Water Air and Soil Pollution，2010，211（1－4）：157－163.

［11］鄭春莉.R.mucilaginosa，S.albidoflavus和M.luteus對硝基苯的好氧生物降解［D］.大連：大連理工大學(xué)，2007.ZHENG Chun－li.Aerobic biodegradation of nitrobenzene byR.mucilaginosa，S.albidoflavusandM.luteus［D］.Dalian：Dalian University of Technology，2007.（in Chinese）

［12］Nishino S F， Spain J C.Degradation of nitrobenzene by aPseudomonaspseudoalcaligenes［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59（8）：2520－2525.

［13］Schraa G，Boone M L，Jetten M S，etal.Degradation of 1，4－dichlorobenzene byAlcaligenes sp.Strain A175 ［J］.Applied and Environmental Microbiology，1986，52（6）：1374－1381.

［14］王紅旗，姚治華，劉敬奇，等.苯在一株黃桿菌細(xì)胞內(nèi)外的分布與降解率的關(guān)系［J］.中國環(huán)境科學(xué)，2006，26（5）：583－586.WANG Hong－qi， YAO Zhi－h(huán)ua，LIU Jing－qi，etal.The relation between the distribution and the degradation rate inside and outside a bacteria strain，F(xiàn)lavobacterium［J］.China Environmental Science，2006，26（5）：583－586.（in Chinese）

［15］艾海新.耐鹽硝基苯降解菌特性分析及其部分基因克?。跠］.大連：大連理工大學(xué)，2008.AI Hai－xin.The characteristic analysis and partial gene clone of novel salt－tolerant bacteria capable of degrading nitrobenzene ［D］.Dalian： Dalian University of Technology，2008.（in Chinese）