葛根素口服給藥對(duì)急性酒精中毒解酒作用的研究

范志銘，張耿強(qiáng)，蔡舒冰，李曉霞，何宇

（廣州醫(yī)科大學(xué)第六臨床學(xué)院，廣東清遠(yuǎn) 511500）

急性酒精中毒（acute alcohol intoxication，AAI）是指短時(shí)間攝入大量酒精或含酒精飲料后而引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂狀態(tài)，臨床表現(xiàn)為行為和意識(shí)異常[1]。此外，持續(xù)大量飲酒還可誘發(fā)肝細(xì)胞廣泛壞死，進(jìn)而發(fā)展成急性酒精性肝炎（acute alcoholic hepatitis，AAH），嚴(yán)重者損傷臟器功能，危及生命[2]。調(diào)查指出，我國(guó)飲酒人群及人均飲酒量呈不斷攀升的趨勢(shì)，酒精濫用及依賴(lài)成為公共衛(wèi)生問(wèn)題[3]，急性酒精中毒已成為急診科最常見(jiàn)的中毒之一。無(wú)論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外，發(fā)病均呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人民健康。因此，尋找有效的解酒預(yù)防藥物受到人們的普遍重視。

葛根[Pueraria lobata（Willd）Ohwi]為豆科植物野葛的干燥根，葛根素（Puerarin）是從中分離得到的主要生物活性成分，化學(xué)名為8-β-D-葡萄叱喃糖-4，7-二羥基異黃酮（8-β-D-Glucopyranosy-7，4-hydroxyisoflavone）。葛根在解酒、治酒病方面的明確療效自古以來(lái)就有記載?！侗静菅芰x》中記載以葛根解酒護(hù)肝，曰：“病酒及渴者，行之甚良”。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，葛根素具有擴(kuò)張冠脈和腦血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收縮功能、降低血液黏稠度、改善循環(huán)等作用，可以降低小鼠酒精吸收量，加速酒精代謝，提高對(duì)酒精耐受量的作用[4]。葛根素制劑有注射液、凍干粉針劑、滴眼劑等，在臨床時(shí)一般選擇注射給藥，但未有口服給藥。近年來(lái)，不少關(guān)于葛根素注射液不良反應(yīng)的報(bào)道出現(xiàn)，輕者可表現(xiàn)為紅斑、瘙癢、皮疹、丘疹等皮膚黏膜改變，重者會(huì)導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)、藥物熱、溶血性貧血、過(guò)敏性休克等全身癥狀，其安全性引起了醫(yī)藥界的高度重視。這大大威脅著用藥者用藥安全，亟需改進(jìn)[5]。鑒于葛根素注射液的使用不便及高不良反應(yīng)率，本研究通過(guò)葛根素口服給藥，不但使用方便，而且可避免其注射給藥帶來(lái)的不良反應(yīng)。

因此，本研究通過(guò)觀察葛根素口服給藥后急性酒精中毒小鼠的肝系數(shù)和血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）濃度，對(duì)小鼠翻正反射消失時(shí)間和軀體麻痹癥狀持續(xù)時(shí)間的影響，以及小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化，探討葛根素口服給藥對(duì)急性酒精中毒的解酒保護(hù)作用，為葛根素解酒保肝制劑的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

一、材料和儀器

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康小鼠24只，雌雄不拘，體重為20～24g，由廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYXK（粵）2021-0168。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：普通級(jí)動(dòng)物室；室溫：（25±2）℃；相對(duì)溫度：（40±2）%；通風(fēng)、光照良好，采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水。

（二）藥品及試劑

生理鹽水；紅星二鍋頭（由北京紅星股份有限公司第一分公司生產(chǎn)，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為：GB/T10781.2）；葛根素溶液（用生理鹽水配備成濃度為0.3g·ml-1的溶液）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT/GPT）測(cè)定試劑盒（由中生北控生物科技股份有限公司提供，產(chǎn)品批號(hào)：182651）；其余均為分析純、生化試劑。

（三）實(shí)驗(yàn)儀器

HH-W420型數(shù)顯三用恒溫水箱（常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司）；722s可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；JJ300A型電子天平（美國(guó)雙杰兄弟〔集團(tuán)〕有限公司）；OLYMPUS CX23高清數(shù)碼拍攝顯微鏡（湖南亮晰光學(xué)儀器有限公司）。

二、方法

（一）動(dòng)物分組、造模及給藥

本研究隨機(jī)將小鼠分為正常對(duì)照組、模型組和葛根素組，每組8只。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠均按0.15ml·10g-1灌胃56°二鍋頭白酒進(jìn)行造模[6]。葛根素組按照0.3g·ml-1葛根素溶液0.2 ml·10g-1灌胃，正常對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水。

（二）指標(biāo)檢測(cè)

給藥2h后，研究人員觀察各組小鼠酒精灌胃前后有無(wú)死亡，外觀、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)等有無(wú)明顯異常，觀察藥物灌胃后各組小鼠有無(wú)出現(xiàn)死亡、興奮狂躁、共濟(jì)失調(diào)、活動(dòng)減少、嗜睡等表現(xiàn)，觀察并記錄小鼠翻正反射消失的時(shí)間（當(dāng)小鼠出現(xiàn)動(dòng)作不協(xié)調(diào)的癥狀時(shí)，輕柔地翻轉(zhuǎn)小鼠，使之處于側(cè)臥位，20s之內(nèi)不能自主翻正，則判斷翻正反射消失。當(dāng)小鼠恢復(fù)自行翻轉(zhuǎn)時(shí)，則認(rèn)為翻正反射恢復(fù)）和軀體麻痹癥狀持續(xù)時(shí)間（從翻正反射消失至恢復(fù)翻正反射的總時(shí)長(zhǎng)）。待小鼠軀體麻痹癥狀解除，麻醉后尾靜脈取血5mL，常溫下靜置血樣15min，4℃、400g離心10min，取血清按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)小鼠血清中的ALT濃度，之后處死小鼠，測(cè)量小鼠的體重，取肝組織，測(cè)量肝臟濕重，計(jì)算小鼠的肝系數(shù)（肝系數(shù)＝肝臟濕重/小鼠重量×100%）。

（三）組織病理形態(tài)學(xué)觀察

研究人員取肝實(shí)質(zhì)部位，于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟浸潤(rùn)包埋并制作成厚度為4μm的連續(xù)石蠟切片，置于電熱恒溫干燥箱中，60℃烘烤2h，烘烤完畢對(duì)干燥的石蠟切片進(jìn)行二甲苯透明和梯度乙醇脫蠟后，蒸餾水洗，蘇木素溶液染色5min、1%鹽酸乙醇分化30s、0.5%伊紅水溶液染色3min，進(jìn)行常規(guī)HE染色，水洗沖掉殘留染液，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。使用光學(xué)顯微鏡于10×40倍視野下隨機(jī)選擇一個(gè)視野觀察并拍照，觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用 SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料數(shù)據(jù)以表示，組間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.葛根素對(duì)急性酒精中毒小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響

酒精灌胃后，各組小鼠均無(wú)出現(xiàn)死亡，小鼠均出現(xiàn)明顯的醉酒狀態(tài)，先表現(xiàn)為躁動(dòng)不安，后表現(xiàn)為活動(dòng)減少和動(dòng)作不協(xié)調(diào)，緊接著隨后出現(xiàn)昏迷、昏睡、軀體麻痹，而葛根素組小鼠給藥后精神狀態(tài)、活動(dòng)能力均較模型組明顯改善。翻正反射時(shí)間反應(yīng)醉酒潛伏期。與模型組相比，葛根素組小鼠給藥后精神狀態(tài)、活動(dòng)能力明顯改善，葛根素組翻正反射消失時(shí)間為[（368.80±115.80）s]，軀體麻痹癥狀持續(xù)時(shí)間為[（13.77±2.76）s]。與模型組翻正反射消失時(shí)間[（173.30±90.50）s]和軀體麻痹癥狀持續(xù)時(shí)間[（25.22±7.93）s]相比，翻正反射消失時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05），軀體麻痹癥狀持續(xù)時(shí)間縮短（P＜0.05），說(shuō)明葛根素口服給藥可減輕急性酒精中毒小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。葛根素對(duì)急性酒精中毒小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響詳見(jiàn)表1。

表1 葛根素對(duì)急性酒精中毒小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響（± s，n=8）Table 1 Therapeutic effects of pueraria on central nervous system in acute alcohol intoxications mice（± s，n=8）

與模型組比較：*P＜0.05，*P＜0.05

組別 劑量/ml·10g-1小鼠體重/ g翻正反射消失時(shí)間*/ s軀體麻痹癥狀持續(xù)時(shí)間*/ min正常對(duì)照組 NS 21.42±0.74 ——模型組 NS 21.65±1.04 173.30±90.50 25.22±7.93葛根素組 0.20 21.76±0.98 368.80±115.80 13.77±2.76

2.葛根素對(duì)急性酒精中毒小鼠肝功能的影響

肝系數(shù)反映小鼠肝臟的腫脹程度，是肝臟炎癥嚴(yán)重程度的指標(biāo)。當(dāng)肝臟出現(xiàn)水腫、充血或炎癥時(shí)，肝系數(shù)會(huì)明顯增大。正常對(duì)照組肝系數(shù)為[（5.53±0.32）%]，葛根素組為[（5.72±0.36）%]，模型組為[（7.22±0.93）%]。與模型組相比，葛根素可降低肝系數(shù)（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（如圖1）。研究人員處死小鼠，取出肝臟，模型組小鼠的肝臟炎癥癥狀較其他組明顯，體積增大、質(zhì)地堅(jiān)實(shí)、邊緣圓鈍、包膜緊張、充血紅腫。HE染色鏡下顯示，正常對(duì)照組小鼠肝臟形態(tài)正常，模型組小鼠肝臟匯管區(qū)肝細(xì)胞出現(xiàn)大塊帶狀壞死，細(xì)胞腫脹，炎性浸潤(rùn)，胞質(zhì)疏松呈網(wǎng)狀，出現(xiàn)嗜酸性變，胞核固縮碎裂，壞死細(xì)胞約占82%，而葛根素組小鼠肝細(xì)胞散在壞死，約占69%，葛根素組壞死肝細(xì)胞百分占比低于模型組，肝細(xì)胞壞死情況明顯改善（如圖2）。另外，肝細(xì)胞內(nèi)含有大量的ALT，受損的肝細(xì)胞會(huì)釋放大量的ALT入血，導(dǎo)致血清中ALT濃度明顯上升。正常對(duì)照組血清ALT濃度[（28.04±1.70）μg·L-1]，葛根素組為[（107.88±1.88）μg·L-1]，模型組為[（252.90±9.72）μg·L-1]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，模型組小鼠血清中ALT濃度顯著升高，葛根素可抑制血清ALT濃度的升高（P＜0.05），有效防治急性酒精性肝炎（如圖3）。結(jié)果表明，葛根素口服給藥可保護(hù)急性酒精中毒小鼠的肝功能。

圖1 各組小鼠的肝系數(shù)

圖2 小鼠肝臟HE 染色結(jié)果

三、討論

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，葛根素口服給藥對(duì)急性酒精中毒小鼠具有一定的解酒作用，能縮短小鼠翻正反射消失時(shí)間和軀體麻痹癥狀持續(xù)時(shí)間，還可降低肝系數(shù)，減低血清ALT濃度，顯著減輕酒精對(duì)小鼠肝細(xì)胞的損害，對(duì)急性酒中毒小鼠肝功能有明顯保護(hù)作用，佐證了其臨床用藥的可行性和有效性。

葛根素是從葛根中提取出的主要活性物質(zhì)，其藥理作用廣泛，早在唐代就已經(jīng)有“解酒毒”作用的記載，食藥兼用歷史悠久，其作用機(jī)制可能為通過(guò)延緩胃排空，減慢酒精吸收速率，降低腸壁通透性，從而降低酒精對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟的損害[7]。同時(shí)，酒精大部分在肝臟中進(jìn)行代謝排出體外，其中主要的途徑為乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）將酒精氧化為乙醛，乙醛再通過(guò)乙醛脫氫酶氧化為乙酸。張偉等人的一項(xiàng)研究表明，葛根素預(yù)處理可以使酒精中毒小鼠肝臟的乙醇脫氫酶活性升高[8]，還可以滅活細(xì)胞色素CYP2E1，從而減少乙醇在分解代謝中產(chǎn)生的自由基，減輕酒精對(duì)肝細(xì)胞的損傷[9]。此外，葛根素還可以刺激腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）磷酸化，進(jìn)而阻斷哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）S6核糖體蛋白和4E結(jié)合蛋白-1表達(dá)，使乙醇培養(yǎng)的肝細(xì)胞恢復(fù)自噬，減輕急性酒精中毒對(duì)肝臟的損害[10]。

此外，葛根素還可以抑制內(nèi)毒素腸漏、庫(kù)普弗細(xì)胞活化和內(nèi)毒素受體表達(dá)減輕急性酒精中毒對(duì)肝臟的損害。彭靖華等人[11]發(fā)現(xiàn)口服葛根素可逆轉(zhuǎn)大鼠酒精攝入引起的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和甘油三酯水平升高，抑制酒精誘導(dǎo)的肝小葉和脂肪肝中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并阻斷酒精刺激下TNF-α、內(nèi)毒素、內(nèi)毒素受體活性、肝臟CD68、CD14、LPS結(jié)合蛋白和Toll樣受體2/4表達(dá)水平的上調(diào)，調(diào)整腸微絨毛的分布，下調(diào)腸閉鎖小帶-1蛋白（Intestinal zonula occludens-1）表達(dá)水平。

但是，由于葛根素具多苯環(huán)和多羥基的結(jié)構(gòu)，在水中微溶，且口服后難以被胃腸道等生物膜吸收，生物利用度較低，限制了其口服給藥的應(yīng)用[12]。因其水溶性差，所以廠家在生產(chǎn)葛根素注射劑時(shí)需要加入高濃度的丙二醇作助溶劑，通過(guò)增大藥物的黏稠度來(lái)提高利用度。這樣不僅在生產(chǎn)過(guò)程中增加成本，而且乙二醇有引起發(fā)熱、過(guò)敏性休克等過(guò)敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[13]。不少學(xué)者對(duì)葛根素的口服制劑方面進(jìn)行了廣泛研究，主要是改善葛根素溶解度和生物利用度，尚未取得較好的進(jìn)展[14]。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)在多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，開(kāi)發(fā)出葛根素磷脂復(fù)合物、葛根素緩釋復(fù)合骨架片、葛根素納米粒等制劑，使得葛根素均勻分散，更容易透過(guò)生物膜，增加了溶解度和生物利用度[15]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，納米化葛根素能顯著增加葛根素在水中的溶解度，提高口服葛根素的生物利用度，且納米化的葛根素平均滯留時(shí)間、消除半衰期比口服葛根素溶液和葛根素混懸液有明顯延長(zhǎng)，藥時(shí)曲線(xiàn)下面積（Area Under Curve，AUC）、峰濃度也有較大提高，達(dá)峰時(shí)間明顯提前，顯示了納米化葛根素能使葛根素的吸收增加，作用增強(qiáng)或延長(zhǎng)[16]。目前，納米化葛根素進(jìn)入藥效、毒理的全面評(píng)價(jià)研究階段。因此，這可成為葛根素口服給藥劑型開(kāi)發(fā)的一個(gè)研究方向[17]。