雙光子顯微成像系統(tǒng)的應(yīng)用及開放管理模式探索

馮婉倩

（溫州醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，浙江溫州 325035）

傳統(tǒng)的單光子顯微成像技術(shù)利用400～700nm的可見光進(jìn)行Z軸向激發(fā)，激光照射在標(biāo)本上，染料分子吸收單個(gè)光子發(fā)射出熒光。在此基礎(chǔ)上，激光共聚焦系統(tǒng)通過引入共軛小孔，在一定程度上去除了非焦平面的雜散光，提高了成像分辨率，但在成像深度方面仍有很大的限制。通常，我們利用共聚焦技術(shù)觀察的普通標(biāo)本厚度不超過200μm，透明化標(biāo)本的厚度不超過500μm。相比之下，多光子顯微成像技術(shù)通過點(diǎn)激發(fā)熒光顯著提高了成像深度，使得觀察活體標(biāo)本的深度可達(dá)800μm，透明化標(biāo)本厚度最大可達(dá)8mm。同時(shí)，該技術(shù)具有天然的切片效果，且空間分辨率幾乎沒有損失，其XY軸分辨率可達(dá)200nm，Z軸分辨率最大為500nm。因此，多光子顯微鏡在大小鼠、兔、斑馬魚、果蠅等模式動(dòng)物活體XYZT多序列成像方面具有顯著的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，已成為研究胚胎、不同組織和器官中各種類型細(xì)胞的形態(tài)與功能的有用工具。盡管多光子顯微鏡的光損傷小，但其熱毒性較高，相較于共聚焦技術(shù)的成熟穩(wěn)定，還需進(jìn)一步摸索條件?；铙w樣本通過轉(zhuǎn)基因、病毒標(biāo)記、免疫熒光標(biāo)記、小分子探針標(biāo)記、血管注射染料等方法進(jìn)行標(biāo)記，操作復(fù)雜，需手術(shù)暴露成像部位，成像效果在很大程度上依賴于實(shí)驗(yàn)技能水平。本文通過總結(jié)多光子顯微鏡的配置參數(shù)、成像特點(diǎn)、工作原理及在不同應(yīng)用中的操作特點(diǎn)，能夠更好地服務(wù)于教學(xué)和科研。

溫州醫(yī)科大學(xué)已建成國(guó)家級(jí)工程中心、省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及省部級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等多個(gè)重點(diǎn)研究平臺(tái)。學(xué)校現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、模式生物技術(shù)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、臨床檢驗(yàn)診斷、中醫(yī)藥研究院、基因組學(xué)研究院、分析測(cè)試中心等多個(gè)科研平臺(tái)在前期已建立較為完善的科研體系。近年來，科研實(shí)驗(yàn)中心大型儀器平臺(tái)的建立與運(yùn)行為學(xué)校和附屬醫(yī)院的科研發(fā)展、疾病防治和精準(zhǔn)治療提供了支持。目前，平臺(tái)配置了一臺(tái)OLYMPUS正置雙光子顯微鏡（FVMPERS），配備了兩臺(tái)光譜物理紅外飛秒脈沖激光器，型號(hào)分別為Insight X3和Mai Tai Deepsee，波長(zhǎng)分別在680～1 300nm和690～1 040nm可調(diào)，具備雙光子激發(fā)、同步雙掃、四軸校準(zhǔn)、三維拼接四大重要技術(shù)。該儀器自裝機(jī)以來，使用率高，總使用次數(shù)達(dá)1 600余次，服務(wù)時(shí)長(zhǎng)超過2 100小時(shí)，用戶主要分布在藥學(xué)院分析測(cè)試中心、眼視光醫(yī)院、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、第一和第二臨床醫(yī)學(xué)院、公共衛(wèi)生與管理學(xué)院等機(jī)構(gòu)，涵蓋了藥學(xué)/藥理學(xué)（神經(jīng)藥理學(xué)）、藥物分析、藥劑學(xué)、生物材料與再生醫(yī)學(xué)、光控視覺發(fā)育和腦功能的分子機(jī)制、急性肺損傷的炎癥消退機(jī)制等多個(gè)研究方向，滿足了校內(nèi)外眾多課題組在基礎(chǔ)研究方面的需求。

一、雙光子顯微鏡發(fā)展概況

20世紀(jì)90年代，Denk等人[1]發(fā)明了第一臺(tái)雙光子顯微鏡，并首次應(yīng)用于生物樣本。此后，雙光子技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用取得了爆炸性的增長(zhǎng)。雙光子顯微成像基于多光子吸收理論，即熒光基團(tuán)在同時(shí)吸收兩個(gè)光子的能量后被激發(fā)，當(dāng)受激電子回到基態(tài)時(shí)，大部分能量以熒光形式發(fā)射的過程。在這個(gè)過程中，紅外飛秒脈沖激光器提供了高強(qiáng)度、非線性、長(zhǎng)波長(zhǎng)（＞700nm）的近紅外激光，使得激發(fā)的發(fā)射光被高數(shù)值孔徑的物鏡限制在焦點(diǎn)周圍，激發(fā)體積通常小于毫微微升。此外，雙光子顯微鏡的瞬時(shí)能量更高，導(dǎo)致其吸收譜線更寬，單個(gè)激發(fā)光可激發(fā)出不同的熒光。因此，雙光子顯微鏡可以基于組織成分的內(nèi)源性屬性差異，進(jìn)行無標(biāo)記成像來觀察組織自發(fā)熒光。目前，商業(yè)化定制或半定制的可調(diào)諧鎖模鈦藍(lán)寶石近外飛秒激光器已替代可見激光源，在商品化的雙光子激光掃描顯微鏡中被大量引入，推動(dòng)多光子顯微鏡技術(shù)在更廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的擴(kuò)展[2]。

雙光子顯微鏡以其高信噪比和優(yōu)越的生物組織穿透深度，結(jié)合三維層掃描分辨率的優(yōu)點(diǎn)，成為重要的活體成像技術(shù)。許多活體神經(jīng)生理過程的觀察和體內(nèi)微環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化都需要毫秒級(jí)的掃描速度?，F(xiàn)代雙光子儀器利用聲光轉(zhuǎn)換器代替檢流計(jì)，能將掃描速度提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，對(duì)于活體觀察具有非常好的優(yōu)化特性。我們利用聲光轉(zhuǎn)換器代替檢流計(jì)能顯著提高掃描速度，為活體觀察提供了非常好的優(yōu)化特性。活體成像面臨的另一大難題是隨著深入活體組織樣本，不可避免地會(huì)出現(xiàn)熒光標(biāo)記減弱的問題。為了解決這一問題，研究和應(yīng)用各類專用于紅外校正的高數(shù)值孔徑、長(zhǎng)工作距離物鏡及高靈敏度檢測(cè)器已成為當(dāng)前的主要發(fā)展方向，更利于雙光子顯微鏡在活體觀察中的應(yīng)用。

近年來，雙光子顯微鏡還被廣泛結(jié)合多種儀器應(yīng)用于觀察多種生理狀態(tài)下不同疾病模型的變化及作用。例如，雙光子顯微鏡與二次諧波（second harmonic generation，SHG）顯微鏡結(jié)合，可以對(duì)膠原蛋白等具有特定序列排列的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行成像，在糖尿病、老化、癌癥等病理學(xué)和生理學(xué)研究上發(fā)揮重要作用。雙光子顯微鏡結(jié)合熒光壽命成像（FLIM）配件可以測(cè)量溶液離子濃度、折射率等參數(shù)[3]。雙光子顯微鏡結(jié)合膜片鉗技術(shù)可以改進(jìn)活體腦組織切片神經(jīng)元深層成像效果。此外，雙光子顯微鏡還能與等離子激光共振效應(yīng)結(jié)合[4]，提高非線性過程的信號(hào)強(qiáng)度。因此，其在材料科學(xué)方向也展現(xiàn)出深遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。

二、雙光子顯微技術(shù)的應(yīng)用

（一）雙光子顯微鏡獲取活體血流圖像操作

為了獲取活體血流圖像，建立一個(gè)穩(wěn)定的觀察窗口是進(jìn)行活體實(shí)驗(yàn)的前提，因此隔離活體動(dòng)物呼吸和心跳的影響是尤為重要的。真空負(fù)壓裝置能夠吸附器官和軟組織，有效地防止活體器官組織在顯微成像時(shí)發(fā)生抖動(dòng)。使用者需調(diào)整活體成像器官固定儀吸附探頭的角度和位置到樣本上方，再通過調(diào)節(jié)旋鈕讓吸盤與組織完全貼緊直至吸力穩(wěn)定，在調(diào)節(jié)過程中要避免壓力過大導(dǎo)致血流因人為因素停滯或減緩，否則可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。

雙光子專用FV31S-SW軟件的觀察方法如下：首先點(diǎn)擊IR Laser Immision打開激光，并在激光設(shè)置界面輸入擬使用的激發(fā)光波長(zhǎng)。兩臺(tái)激光器能夠發(fā)出不同波段的近紅外光，激發(fā)多種染料的熒光，有效避免各個(gè)染料之間發(fā)生串色現(xiàn)象。X3激光器適用于激發(fā)各類熒光蛋白成像，而Mai Tai激光器因其脈寬更窄，適用于深層成像和刺激，可用于激發(fā)組織自發(fā)熒光以顯示血管結(jié)構(gòu)。通道參數(shù)的設(shè)置需切換到檢測(cè)器控制面板，勾選所需的檢測(cè)通道，打開平均線性降噪和防串色功能，掃描分辨率選擇512X512（全畫幅）像素，將采集速度控制在2μs/pix左右，上述參數(shù)的應(yīng)用通常能夠獲得較高信噪比的圖像。熒光強(qiáng)度的調(diào)節(jié)可以通過改變激光強(qiáng)度和檢測(cè)器電壓實(shí)現(xiàn)，同時(shí)使目標(biāo)樣品到達(dá)最佳焦平面，激光功率越高，信號(hào)越強(qiáng)，但也更容易使染料發(fā)生淬滅。一般情況下，我們推薦活體實(shí)驗(yàn)的激光功率在不高于20%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，同等條件下，建議優(yōu)先調(diào)節(jié)檢測(cè)器電壓HV值。最后時(shí)間序列掃描功能在Time Lapse設(shè)置模塊進(jìn)行設(shè)置，需設(shè)置的參數(shù)包括拍攝的圖像數(shù)量Cycles，并點(diǎn)擊Acquire進(jìn)行獲取以及采集完成后，可再選擇一定數(shù)量的微血管（測(cè)量直徑≤10μm）進(jìn)行線掃描，從而完成對(duì)血流速度的量化分析[5]。

（二）雙光子顯微鏡腦成像技術(shù)要點(diǎn)

大多數(shù)腦科學(xué)研究樣品為腦組織切片或離體培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞，無法全面地反應(yīng)大腦在三維空間內(nèi)微環(huán)境的結(jié)構(gòu)與功能。因此，實(shí)現(xiàn)活體皮層的高分辨率成像對(duì)于理解大腦血管、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律以及情感、記憶之間的聯(lián)系具有重要意義。大腦皮層由大量的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞組成，其上方被顱骨組織包覆。顱骨的致密結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)烈的散射效應(yīng)，是觀察腦皮質(zhì)血管結(jié)構(gòu)和分析神經(jīng)元信號(hào)的主要障礙。為了克服這一障礙，傳統(tǒng)的顱骨清除方法，包括開窗法和磨骨法，雖然在一定程度上能滿足研究要求，但具有局限性。例如，開顱窗很難避免相關(guān)的炎癥反應(yīng)，由于骨的再生，實(shí)驗(yàn)人員需要反復(fù)將顱骨磨薄至25μm以下，對(duì)實(shí)驗(yàn)技能要求較高，且無法實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)的腦光學(xué)成像。相對(duì)而言，活體顱骨透明化方法允許進(jìn)行大面積重復(fù)成像，幾乎不引起皮層損傷和炎癥，代表了一種新型的、安全有效且易于處理的顱窗技術(shù)[5]（如表1）。近年來，活體光透明化試劑的進(jìn)一步發(fā)展為雙光子顯微技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像領(lǐng)域的應(yīng)用提供了重要手段。透明化試劑的作用包括軟化顱骨和匹配折射率兩個(gè)方面，其成分通常包括陰離子表面活性劑、金屬離子螯合劑、膠原蛋白水解酶以及甘油等。構(gòu)建一個(gè)透明化顱窗大約只需15分鐘，結(jié)合雙光子顯微鏡，能夠反復(fù)成像皮層淺層的樹突棘、小膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管[11]。

表1 顱窗手術(shù)方法比較

在神經(jīng)科學(xué)研究中，鈣信號(hào)是神經(jīng)元—神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間主要的信息傳遞者。研究表明[12]，為了捕捉到鈣離子的快速變化，每幀圖像的掃描時(shí)間應(yīng)控制在200ms以內(nèi)。鈣閃爍的快速成像需在LSM Imaging面板切換到Resonant快掃模式，以Roundtrip方式進(jìn)行掃描，調(diào)節(jié)Roundtrip掃描孔徑使細(xì)胞胞體邊緣實(shí)體化，將拍攝頻率控制在33赫茲左右。由于最快掃描速度的限制，實(shí)驗(yàn)人員可以通過提高激光功率和檢測(cè)器電壓的比值的方法增強(qiáng)圖像信噪比，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)元內(nèi)的鈣信號(hào)進(jìn)行一段時(shí)間的記錄。圖像處理軟件Cellsense能夠?qū)Ρ挥涗泩D像中實(shí)時(shí)信號(hào)的變化進(jìn)行分析，具體做法為以監(jiān)測(cè)時(shí)間為橫坐標(biāo)，單個(gè)神經(jīng)元熒光信號(hào)強(qiáng)度變化為縱坐標(biāo)進(jìn)行作圖，形成的波形圖中一個(gè)波峰即代表一個(gè)動(dòng)作電位。

（三）雙光子顯微鏡原位觀察方法

眾多腦部疾病在發(fā)展進(jìn)程中，以腦組織局灶性缺血為核心，誘導(dǎo)生成一系列炎癥因子，最終對(duì)神經(jīng)元造成不可逆的損傷。因此，活體腦血管形態(tài)觀察、血液流速分析是判斷腦組織損傷程度的重要指標(biāo)。實(shí)際研究過程通常要求測(cè)量同一視野下的數(shù)據(jù)進(jìn)行術(shù)前與術(shù)后的比較，定位需精確到同一根血管或同一個(gè)神經(jīng)元。然而，腦小血管是體內(nèi)最復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，包含直徑介于40～200μm的微小動(dòng)脈、小動(dòng)脈和小靜脈，實(shí)驗(yàn)人員很難對(duì)活體對(duì)象的同一根微小血管進(jìn)行原位觀察和反復(fù)對(duì)比。雙光子顯微鏡的高倍物鏡和Map拼接功能能夠拍攝全顱窗內(nèi)的微小血管，再通過前后比較可以較好找到初始視野，無需特異性染色標(biāo)記。這是一種簡(jiǎn)便的原位血管觀察方法。

原位血管觀察流程主要依據(jù)雙光子軟件的Map地圖拼接功能，小鼠全顱窗的定義方法是利用Point Register工具沿著顱窗邊緣劃出輪廓，再圈選整個(gè)顱窗，進(jìn)一步標(biāo)記Num of Areas。與常規(guī)觀察類似，檢測(cè)通道和每個(gè)區(qū)域的熒光強(qiáng)度和焦平面都需設(shè)置正確以確保圖像分辨率達(dá)到最佳。設(shè)置完成后，拍攝模式選擇Resonant，添加8-10次平均降噪處理，軟件完成所有操作后MATL中開始拍攝。拍攝完成得到的圖像需在大圖拼接模塊進(jìn)行Splicing拼接。小鼠經(jīng)手術(shù)處理后，實(shí)驗(yàn)人員通過比對(duì)Areas的血管走向和形態(tài)找到相同視野，拍攝同一根血管圖像。高分辨率的實(shí)驗(yàn)分析需要在Cellsense軟件中進(jìn)行消卷積處理，此操作可顯著提高圖像質(zhì)量。

三、雙光子顯微鏡管理思路

（一）雙光子儀器校準(zhǔn)與維護(hù)

溫濕度是影響儀器系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要因素。儀器室的環(huán)境溫度應(yīng)恒定在18～22℃，濕度應(yīng)維持在40%～60%。此外，外置NDD檢測(cè)器具有極高的感光靈敏度，環(huán)境光會(huì)使其性能下降。因此，實(shí)驗(yàn)人員啟動(dòng)軟件之前，需關(guān)閉室內(nèi)燈，使顯微鏡主機(jī)周圍區(qū)域保持在黑暗狀態(tài)。為了確保輸出穩(wěn)定的激光束，IR脈沖激光器需要在每次實(shí)驗(yàn)之間預(yù)熱至少30分鐘，并由專業(yè)人員定期進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)內(nèi)容包括以下：主激光器Insight X3和副激光器Mai Tai DeepSee的電流應(yīng)分別穩(wěn)定在10.3mA和6.51mA左右，濕度顯示在10%以下，移動(dòng)波長(zhǎng)功率曲線。其中，X3激光器應(yīng)在900nm達(dá)到最大功率，呈現(xiàn)為中間高，兩邊下降的平寬型正態(tài)分布樣。當(dāng)實(shí)際功率大于指標(biāo)功率時(shí)，這說明激光器正?？捎?。Mai Tai激光器在800nm時(shí)功率最大，功率曲線應(yīng)呈現(xiàn)為中間高，兩邊快速下降的陡窄型正態(tài)分布樣。當(dāng)DeepSee power/Mai Tai power＞85%時(shí)，這說明激光器正?？捎?。在激光器的日常維護(hù)中，我們要注意激光器電源及水冷系統(tǒng)需常年保持開啟，定期檢查除濕通氣管和冷卻液管是否暢通，及時(shí)更換冷凝液進(jìn)行循環(huán)冷卻，以維持飛秒激光器的恒定溫度在21℃下才能工作。另外，實(shí)驗(yàn)人員要根據(jù)樣本的觀察需求，選擇配備相應(yīng)的物鏡鏡頭，使用浸液系物鏡時(shí)，將物鏡頂端浸入有標(biāo)本的介質(zhì)中，避免超過電絕緣區(qū)，每次浸沒使用后，需用中性洗滌劑清洗前端鏡頭。

（二）雙光子儀器培訓(xùn)與開放使用

大型儀器設(shè)備是衡量各高校科研實(shí)力的重要指標(biāo)之一，而一個(gè)健康的共享機(jī)制則是儀器平臺(tái)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵條件之一。通過實(shí)施申請(qǐng)培訓(xùn)—考核—授權(quán)使用的流程，用戶能夠熟練掌握儀器的基礎(chǔ)知識(shí)，并根據(jù)他們所具備的相應(yīng)儀器操作能力的等級(jí)進(jìn)行分類，進(jìn)而開放不同的使用時(shí)段。這一做法不僅可以優(yōu)化儀器的使用效率，而且能培養(yǎng)用戶獨(dú)立操作科研設(shè)備和創(chuàng)新實(shí)踐的能力。目前，平臺(tái)培訓(xùn)主要以集中培訓(xùn)為主，輔以定制化培訓(xùn)。雙光子顯微鏡作為專人專管的儀器，其培訓(xùn)方案分為理論培訓(xùn)和上機(jī)培訓(xùn)兩部分，均由儀器管理員負(fù)責(zé)開展。理論培訓(xùn)的內(nèi)容涵蓋了儀器的工作原理、結(jié)構(gòu)、應(yīng)用及預(yù)約使用流程。以FVMPE-RS型號(hào)為例，其重要部件包括SpectraPhysics雙飛秒激光器系統(tǒng)、多光子掃描系統(tǒng)、無針孔反射熒光4通道NDD檢測(cè)器和全電動(dòng)物鏡聚焦式顯微鏡主機(jī)。其特點(diǎn)表現(xiàn)在使用共振式掃描振鏡可以實(shí)現(xiàn)高速觀察，而使用Galvanometer掃描振鏡則能實(shí)現(xiàn)高分辨成像，同時(shí)，根據(jù)物鏡和激光波長(zhǎng)的不同，可以自動(dòng)進(jìn)行擴(kuò)束，以實(shí)現(xiàn)高效率的成像。配備的負(fù)色散補(bǔ)償系統(tǒng)可以最大程度地降低對(duì)標(biāo)本的損壞，從而在較低激光功率下觀察樣本。理論培訓(xùn)結(jié)束后進(jìn)行上機(jī)培訓(xùn)，內(nèi)容包括開關(guān)機(jī)、軟件使用流程及實(shí)操訓(xùn)練。我們給用戶培訓(xùn)時(shí)要演示正確的開關(guān)機(jī)順序，強(qiáng)調(diào)按照標(biāo)準(zhǔn)流程開機(jī)，分為9步：1.打開電動(dòng)顯微鏡BX63部件控制器；2.打開電動(dòng)載物臺(tái)控制器電源；3.打開汞燈電源；4.打開掃描系統(tǒng)控制部件FV30-PSU；5.打開同步光刺激組件FV30-SIMMP；6.打開雙激光器引入裝置；7.打開操控屏TPC；8.待TPC顯示Start Operation后才能開啟SW軟件；9.在軟件中打開激光。上述兩部分培訓(xùn)經(jīng)考核，成績(jī)均合格后由儀器管理員在大儀預(yù)約系統(tǒng)上授權(quán)使用。

四、結(jié)束語

在體監(jiān)測(cè)細(xì)胞功能、生物物質(zhì)分泌過程和血管形態(tài)對(duì)于我們理解體內(nèi)臟器病變的發(fā)展進(jìn)程、揭示相關(guān)的病理機(jī)制并開展相應(yīng)的治療手段起著關(guān)鍵作用。活體光學(xué)成像是研究臟器組織結(jié)構(gòu)和功能的一種重要方法。雙光子顯微技術(shù)常用于血管、淋巴、神經(jīng)的精細(xì)結(jié)構(gòu)成像，并在活體動(dòng)物研究中具有特殊優(yōu)勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)過程中，為了獲得高分辨率的圖像，我們需要注意以下幾點(diǎn)：1.手術(shù)過程中，實(shí)驗(yàn)人員的動(dòng)作要細(xì)致，時(shí)刻關(guān)注出血情況，避免污染觀察窗口；2.透明化效果決定成像深度和圖像信噪比。因此，在透明化試劑配制過程中，實(shí)驗(yàn)人員要確保澄清透明無沉淀，且應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，透明時(shí)間需要充足，上機(jī)前要防止窗口產(chǎn)生氣泡干擾。

雙光子顯微鏡價(jià)格昂貴，維護(hù)復(fù)雜。因此，在日常使用的基礎(chǔ)上，強(qiáng)化平臺(tái)管理制度、制定系統(tǒng)化培訓(xùn)方案、建設(shè)多樣化信息交流平臺(tái)是維持儀器穩(wěn)定狀態(tài)、發(fā)揮大型科研儀器設(shè)備使用效益、加快科研成果產(chǎn)出的有利策略。本文介紹了超快速雙光子在體顯微成像系統(tǒng)的基本原理和組成，探討了雙光子顯微鏡在活體研究中檢測(cè)方法的建立和觀察要點(diǎn)，以及其創(chuàng)新管理模式，旨在為廣大高校實(shí)驗(yàn)技術(shù)員提供借鑒思路。