基于SCF/C-kit通路探討三焦針法對腹瀉型腸易激綜合征大鼠的影響

尚雪梅 朱洲 潘莉 唐徐韻 宋光仙 石麗杉 程敏 楊孝芳

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)作為一種慢性胃腸道疾病,臨床特征主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉及糞便性狀改變[1-2]。在我國IBS發(fā)病率約占7%～11%,其中臨床以腹瀉型腸易激綜合征(irritable bowel syndrome with diarrhea,IBS-D)最為常見,約占整個(gè)IBS患者數(shù)的74%[3-5]。近來研究發(fā)現(xiàn),胃腸動(dòng)力異常是引起IBS-D發(fā)病一大病理特征[6],研究認(rèn)為,Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal, ICC)作為胃腸活動(dòng)“起搏器”,其異?？蓪?dǎo)致胃腸動(dòng)力障礙,而干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)和酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor, C-kit)則可直接調(diào)控ICC功能的發(fā)揮[7]從而影響胃腸動(dòng)力。因而,對SCF/C-kit通路在胃腸動(dòng)力異常過程中的作用機(jī)理進(jìn)行探討具有一定意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為IBS-D病位在腸,與肝、脾、腎、肺等臟腑功能密切相關(guān),其發(fā)病主要與情志失調(diào)、飲食不節(jié)、感受外邪等密切相關(guān)[8],但其根源于臟腑氣機(jī)失調(diào),從而誘發(fā)IBS-D。因而,調(diào)暢全身臟腑氣機(jī)成為IBS-D重要治則?！峨y經(jīng)·六十六難》云:“三焦者,原氣之別使也,主通行三氣?！盵9]中醫(yī)古籍認(rèn)為三焦在一身氣機(jī)運(yùn)行中占有重要地位,是一身氣機(jī)的通道,因而,通過調(diào)暢三焦可調(diào)控全身臟腑氣機(jī)的運(yùn)行?；诖?本研究通過采用韓景獻(xiàn)教授基于“三焦氣化失司”理論提出的三焦針法調(diào)節(jié)IBS-D脾胃運(yùn)化、改善臟腑氣機(jī)、益氣調(diào)血、扶本培元[10]。同時(shí)基于IBS-D大鼠模型,探究三焦針法對IBS-D大鼠SCF/C-kit通路的調(diào)控作用,闡述三焦針法治療IBS-D改善胃腸動(dòng)力的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級健康wistar雄性大鼠24只,體質(zhì)量(300±50)g,購自:長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2019-0013]。飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,飼養(yǎng)溫度(20±2)℃,濕度(60±5),光明/黑暗周期為12小時(shí),定期更換墊料,保持環(huán)境干燥通風(fēng),自由飲水和攝食。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天,按隨機(jī)數(shù)字表抽取6只大鼠為空白組,其余18只大鼠為模型組進(jìn)行造模。造模完成后,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為模型組、西藥組和三焦組,每組6只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程均通過貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理審查(論理審批號:20220068),同時(shí)符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利指南。

1.2 主要試劑與儀器

冰醋酸(20220402,成都金山化學(xué)試劑有限公司),匹維溴安片(法國蘇威公司,進(jìn)口藥品注冊證號:H20160396),蘇木素—伊紅(hemotoxylin-eosin,HE)染色試劑(武漢賽維爾生物科技有限公司),PCR引物(生工生物工程(上海)股份有限公司),Trizol試劑(合肥博美生物技術(shù)有限公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),兔抗大鼠SCF、C-kit抗體(abclonal)。

針刺針(0.25 mm×0.25 mm,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司),曠場實(shí)驗(yàn)箱(XR-XZ301,上海欣軟信息科技有限公司),電子天平(PPT-A+100,美國康州HZ電子科技有限公司),數(shù)字切片掃描儀[Pannoramic250,3DHISTECH(Hungary)],酶標(biāo)儀(型號:SpectraMAX Plus384,美谷分子儀器有限公司),實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)儀(型號:QuantStudio TM3,美國Thermofisher儀器有限公司),電泳儀JY200C(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司),水平脫色搖床TY-80A(江蘇科析儀器有限公司),化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀5200(上海天能科技有限公司)。

1.3 造模方法

IBS-D模型動(dòng)物制備參照章海鳳等[11]的方法,采用冰醋酸+束縛應(yīng)激方式進(jìn)行造模:4%的冰醋酸溶液按0.2 mL進(jìn)行灌腸,每隔兩日增加0.1 mL,直至劑量為0.5 mL。灌腸后,進(jìn)行束縛刺激,1次/d,每次2小時(shí),持續(xù)給藥14天。以大鼠出現(xiàn)靜臥少動(dòng)、肛周污穢等一般癥狀及體質(zhì)量較空白組降低,曠場實(shí)驗(yàn)中橫向運(yùn)動(dòng)、縱向距離較空白組減少、稀便率和AWR3分時(shí)注水量增加為造模成功標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.4 干預(yù)方法

空白組、模型組:予固定但不進(jìn)行其余干預(yù)。

西藥組:進(jìn)行匹維溴銨灌胃,濃度為1.5 mg/mL的匹維溴銨混懸液按大鼠體質(zhì)量以15 mg/kg的劑量給藥,1次/d,連續(xù)治療14天。

三焦組:參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行三焦針法干預(yù):將大鼠固定,選取“膻中”“中脘”“氣?！奔半p側(cè)“血?！薄白闳铩?穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用穴位名稱與定位第2部分:大鼠》[13]進(jìn)行定位),“血?！毕蛏掀酱?～5 mm,行捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法(>120次/min)30秒,其他穴位均直刺2～3 mm,行捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法30秒,1次/d,連續(xù)治療14天。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 一般狀態(tài) 每日觀察大鼠的食量、飲水、精神狀態(tài)、皮毛色澤、活動(dòng)度、糞便、肛周污穢程度及有無其它異常癥狀等情況,同時(shí)記錄大鼠體質(zhì)量。

1.5.2 曠場實(shí)驗(yàn) 分別于造模前、造模后及干預(yù)后進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開始前將大鼠放置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)30分鐘后開始實(shí)驗(yàn)。每次將一只大鼠放置于50 cm×50 cm×50 cm的曠場實(shí)驗(yàn)箱中心位置,利用攝像機(jī)記錄大鼠5分鐘內(nèi)行為,運(yùn)用ANY-MAZE軟件分析大鼠橫向運(yùn)動(dòng)(行走距離)、縱向運(yùn)動(dòng)(直立次數(shù))及糞便粒數(shù)。每只大鼠實(shí)驗(yàn)后,用75%乙醇溶液擦拭曠場實(shí)驗(yàn)箱,避免大鼠殘留氣味影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5.3 稀便率 參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行干預(yù),在造模后、治療后,將每組大鼠分開放置于鐵籠中,將墊有濾紙的托盤放置于鐵籠下方,4小時(shí)后統(tǒng)計(jì)各組大鼠總排便粒數(shù)和稀便數(shù),計(jì)算 稀便率。稀便率(%)=(稀便數(shù)÷總排便粒數(shù))×100%。

1.5.4 AWR評分 參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行干預(yù),分別于造模后、治療后采用結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectal dilatation,CRD)法對各組大鼠進(jìn)行AWR評分,以評估大鼠內(nèi)臟敏感性。測定前12小時(shí)大鼠禁食不禁水。大鼠吸入七氟烷輕度麻醉后,將甘油潤滑的6F導(dǎo)尿管緩慢插入肛門7 cm后用膠帶將導(dǎo)尿管固定于大鼠尾根部,將大鼠置于單籠中,待大鼠蘇醒且狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)經(jīng)球囊注入(27±1)℃的0.9%氯化鈉溶液,觀察引起大鼠AWR達(dá)3分時(shí)的注水量,重復(fù)檢測3次,取3次平均值作為大鼠引起 AWR 達(dá)3分時(shí)最小容量閾值,AWR評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 AWR評分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.5 HE染色法觀察大鼠結(jié)腸組織 干預(yù)結(jié)束后第二天,將大鼠麻醉,迅速分離結(jié)腸,使用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定,將固定后組織經(jīng)乙醇梯度脫水,二甲苯透明,包埋,石蠟切片(5 μm);采用HE染色,切片脫蠟至水,蘇木精染色,鹽酸乙醇分化,流水沖洗,中性樹膠封固,使用Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀(3DHISTECH)進(jìn)行圖片觀察并采集。

1.5.6 RT-PCR法檢測大鼠結(jié)腸組織中SCF、C-kit mRNA表達(dá) 將上述各組大鼠結(jié)腸組織用Trizol試劑提取總RNA,RT反應(yīng)后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,將cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng):95℃30秒,95℃5秒,55℃30秒,72℃30秒,共45個(gè)循環(huán),得到檢測樣本相應(yīng)CT值,通過2-ΔΔCT計(jì)算樣本mRNA表達(dá)量。引物序列詳見表2。

表2 引物序列

1.5.7 Western blot法檢測大鼠結(jié)腸組織中SCF、C-kit蛋白表達(dá) 提取結(jié)腸組織蛋白,使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,具體操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。后進(jìn)行蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育(C-kit 1∶2000;SCF 1∶1000;β-actin 1∶50000)、二抗孵育(1∶5000稀釋)。使用ECL發(fā)光液按1∶1混合后,滴加到PVDF膜上反應(yīng)1分鐘,將膜置于化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀暗室中,使用天能GIS機(jī)箱控制軟件V2.0進(jìn)行曝光掃描,用Image J軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以目的蛋白相對表達(dá)量表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)比較

造模后,空白組大鼠毛色光滑,抓取時(shí)動(dòng)作敏捷,精神充足,肛周干凈,糞便呈顆粒狀。其余三組大鼠毛色暗淡,精神萎靡,反應(yīng)遲鈍,肛周污跡且伴糞便稀薄。干預(yù)后,西藥組和三焦組大鼠精神狀態(tài),毛色、活動(dòng)、肛周污跡及糞便性狀得到改善。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量比較

造模前,各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異;造模后,與空白組比較,各組大鼠體質(zhì)量降低(P<0.01);干預(yù)后,與模型組比較,西藥組、三焦組體質(zhì)量顯著升高(P<0.05,P<0.01),且西藥組與三焦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠體質(zhì)量比較

2.3 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)比較

造模前,各組大鼠無差異;造模后,與空白組比較各組大鼠橫向運(yùn)動(dòng)距離及縱向運(yùn)動(dòng)次數(shù)均顯著減少(P<0.01)。干預(yù)后,與模型組比較,西藥組及三焦組大鼠橫向運(yùn)動(dòng)距離及縱向運(yùn)動(dòng)次數(shù)均顯著增加(P<0.01),且西藥組與三焦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠橫向運(yùn)動(dòng)與縱向運(yùn)動(dòng)結(jié)果比較

2.4 各組大鼠稀便率情況

造模后,與空白組比較各組大鼠稀便率顯著增加(P<0.01)。干預(yù)后,與模型組比較,西藥組及三焦組大鼠稀便率均顯著降低(P<0.01),且西藥組與三焦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠稀便率情況比較

2.5 各組大鼠AWR3分時(shí)注水量情況

造模后,與空白組比較各組大鼠AWR3分時(shí)注水量顯著降低(P<0.01)。干預(yù)后,與模型組比較,西藥組及三焦組大鼠AWR3分時(shí)注水量均顯著增加(P<0.01),且西藥組與三焦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

表6 各組大鼠AWR3分時(shí)注水量情況比較

2.6 各組大鼠結(jié)腸病理情況

模型組大鼠結(jié)腸固有層有少量炎癥細(xì)胞浸潤,以淋巴細(xì)胞為主;其余大鼠結(jié)腸粘膜結(jié)構(gòu)清晰完整,分層明顯,上皮細(xì)胞排列整齊,固有層腺體排列較規(guī)則,固有層和粘膜下有不同程度的中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞聚集,無明顯病理變化。見圖1。

注:A 空白組;B 模型組;C 西藥組;D 三焦組。

2.7 各組大鼠結(jié)腸組織中SCF、C-kit mRNA表達(dá)水平比較

與空白組相比,IBS-D模型組大鼠結(jié)腸組織SCF、C-kit mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,三焦組大鼠結(jié)腸組織中SCF mRNA、C-kit mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.01),西藥組大鼠結(jié)腸組織中SCF mRNA、C-kit mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表7。

表7 各組大鼠SCF、C-kit mRNA表達(dá)水平比較

2.8 各組大鼠結(jié)腸組織中SCF、C-kit蛋白表達(dá)水平比較

與空白組相比,模型組大鼠結(jié)腸組織中SCF、C-kit蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,三焦組大鼠結(jié)腸組織中SCF、C-kit蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),西藥組結(jié)腸組織SCF、C-kit蛋白表達(dá)水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表8。

圖2 各組大鼠SCF、C-kit蛋白表達(dá)水平的影響

表8 各組大鼠SCF、C-kit蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

IBS-D是一種功能性胃腸道疾病,其發(fā)病機(jī)制尚未明確。大量研究顯示,胃腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂是導(dǎo)致IBS-D發(fā)病的一大重要病理機(jī)制。目前臨床多采用對癥治療,但存在一定不良反應(yīng)且復(fù)發(fā)率高等副作用[14],因而探索其替代療法、潛在機(jī)制及治療靶點(diǎn)尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)采用“冰醋酸灌腸+束縛應(yīng)激”建立IBS-D模型,針對大鼠體質(zhì)量、橫向運(yùn)動(dòng)、縱向運(yùn)動(dòng)、稀便率及AWR3分時(shí)閾值進(jìn)行觀察檢測。結(jié)果顯示,與空白組相比,IBS-D模型大鼠體質(zhì)量明顯下降,橫向運(yùn)動(dòng)和縱向運(yùn)動(dòng)次數(shù)明顯減少,稀便率明顯增加,AWR3分時(shí)注水量明顯降低,提示模型復(fù)制成功。經(jīng)針刺干預(yù)后,三焦組大鼠體質(zhì)量、橫向運(yùn)動(dòng)、縱向運(yùn)動(dòng)次數(shù)明顯升高,稀便率明顯減少,AWR3分時(shí)注水量明顯增高,提示三焦針法具有改善IBS-D大鼠腹痛、腹瀉癥狀作用。

匹維溴銨作為臨床常用治療IBS-D的解痙藥,主要用于改善由胃腸道功能紊亂導(dǎo)致的排便異常、疼痛等癥狀,可緩解腸道痙攣,改善胃腸道功能,故本實(shí)驗(yàn)選其為陽性對照藥物[15]。本研究顯示,匹維溴銨干預(yù)后,SCF、C-kit基因及蛋白表達(dá)具有下調(diào)趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示匹維溴銨能夠在一定程度上緩解IBS-D癥狀,改善胃腸道紊亂情況,這可能與匹維溴銨作為腸道解痙藥,通過抑制Ca2+離子通道,降低腸道平滑肌興奮性,緩解痙攣[15]的作用機(jī)制有關(guān)。

中醫(yī)學(xué)根據(jù)臨床特征將IBS-D歸屬于“腹痛”、“泄瀉”等范疇?！毒霸廊珪ば篂a》曰:“泄瀉之本,無不由于脾胃”?！吨T病源候論》認(rèn)為“脾胃虛弱則運(yùn)化不利,水谷不化,致脾胃升降失司,清濁不分則生泄瀉”[16]。因而通過調(diào)節(jié)脾胃功能,促使脾胃氣機(jī)調(diào)暢達(dá)到腐熟水谷、宣統(tǒng)氣血津液可治療IBS-D。研究發(fā)現(xiàn),韓景獻(xiàn)教授根據(jù)“三焦氣化失司”理論提出的三焦針法可通調(diào)三焦、助力中焦脾胃運(yùn)化,以達(dá)到“中焦如漚”的狀態(tài)[10]。因而本研究以三焦針法作為干預(yù)措施,其方所選穴位包括膻中、中脘、氣海、血海(雙側(cè))及足三里(雙側(cè))。膻中為心包募穴,位屬上焦,刺激膻中可宣通上焦心肺之氣,達(dá)到“上焦如霧”的狀態(tài);中脘屬任脈,為胃之募穴,脾胃表里,二者合用,可改善脾胃功能,促進(jìn)中焦氣機(jī)運(yùn)化。氣海為腎之原穴,可生發(fā)元?dú)?為人體提供動(dòng)力。足三里為胃經(jīng)合穴,胃下合穴,針刺足三里可促進(jìn)后天脾胃之氣,調(diào)節(jié)氣血生化。血海屬足太陰脾經(jīng),為血液匯聚之處,血為氣之母,刺激該穴可促進(jìn)氣血輸布[10, 17]。五穴合用,可調(diào)暢三焦氣機(jī)、改善中焦脾胃運(yùn)化功能、滋養(yǎng)臟腑、促進(jìn)脾胃氣血生化功能的發(fā)揮、固本培元,以改善IBS-D的病情。

ICC被稱為腸道平滑肌起搏細(xì)胞,研究顯示,ICC通過產(chǎn)生慢波電位控制腸道平滑肌收縮頻次、方向及節(jié)點(diǎn),介導(dǎo)腸道平滑肌收縮,調(diào)控腸道神經(jīng)元釋放相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)及胃腸激素[7, 18]。ICC的結(jié)果和數(shù)量異常會(huì)直接影響胃腸道運(yùn)動(dòng)從而導(dǎo)致出現(xiàn)胃腸動(dòng)力異常性疾病。C-kit受體是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白,在ICC細(xì)胞膜上特異性表達(dá),因而可間接作為ICC細(xì)胞特異性標(biāo)記物,調(diào)控ICC的生理過程與表達(dá)。同時(shí),SCF作為一種高度糖化的跨膜蛋白,是C-kit的配體,兩者特異性結(jié)合在維持ICC的數(shù)量、活化及功能的發(fā)揮方面具有關(guān)鍵作用[19-21]。本研究通過檢測SCF、C-kit基因及蛋白水平表達(dá),發(fā)現(xiàn)IBS-D模型大鼠SCF、C-kit基因和蛋白水平均顯著升高。針刺干預(yù)后,SCF、C-kit基因及蛋白水平顯著降低,提示三焦針法可顯著調(diào)控SCF/C-kit通路改善IBS-D胃腸道動(dòng)力障礙,這可能與SCF、C-kit基因及蛋白下調(diào),SCF/C-kit通路受到抑制,腸道平滑肌細(xì)胞興奮性下降有關(guān)。

綜上所述,本研究初步證明三焦針法可通過調(diào)節(jié)SCF、C-kit基因和蛋白表達(dá),改善IBS-D胃腸動(dòng)力異常,緩解IBS-D癥狀。但本研究也存在一些不足之處,針刺對SCF/C-kit的影響是多方面的,接下來研究當(dāng)中會(huì)加入阻斷劑阻斷SCF/C-kit通路傳導(dǎo),進(jìn)一步證實(shí)三焦針法對SCF/C-kit的影響。