馬鈴薯WOX 基因家族的鑒定及在離體再生和非生物脅迫中的表達分析

張玉 石磊 鞏檑 聶峰杰 楊江偉 劉璇 楊文靜 張國輝頡瑞霞 張麗，2

（1.寧夏農(nóng)林科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心 寧夏農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，銀川 750002；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，蘭州 730070；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室，蘭州 730070；5.寧夏農(nóng)林科學院固原分院，固原 756000）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界上第四大糧菜兼用作物，分布范圍廣、適應(yīng)性強、種植面積大，在保障我國糧食安全、促進經(jīng)濟戰(zhàn)略性調(diào)整、全面推進鄉(xiāng)村振興等方面發(fā)揮重要支撐作用。馬鈴薯為同源四倍體無性繁殖作物，基因組高度雜合，且自交不親和，加快生物育種創(chuàng)制優(yōu)良種質(zhì)勢在必行。但馬鈴薯基因型依賴性嚴重，部分品種轉(zhuǎn)化效率較低。因此，提高馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化效率、克服基因型依賴性問題，對充分發(fā)揮生物技術(shù)在馬鈴薯遺傳育種中的作用意義重大。

WUSCHE? 相 關(guān) 同 源 盒（WUSCHEL?related homeobox, WOX）基因家族是一種植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族，其保守序列是由約60 個氨基酸以“螺旋-環(huán)-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix?loop?helix?turn?helix）”構(gòu)成的同源異型結(jié)構(gòu)域（homeo?domain, HD），WOX轉(zhuǎn)錄因子通過HD 與特定DNA 序列結(jié)合發(fā)揮生物學功能，廣泛參與植物生長發(fā)育、干細胞分裂分化調(diào)控、胚胎和器官形成等過程［1］。通過對不同植物中WOX 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析，WOX 基因家族被分為3 個分支：WUS 進化分支（WUS clade）、中間進化分支（intermediate clade）、古老進化分支（ancient clade）［2］。1996 年，Laux 等［3］從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中發(fā)現(xiàn)了WUS 基因，首次揭示了WOX 基因家族成員在植物發(fā)育中的重要作用。隨后，WOX基因家族在擬南芥、水稻、高粱、玉米等多種植物中進行了充分的研究［4］，其家族成員在植物發(fā)育和生長過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。在擬南芥中，WUS 基因主要在莖尖分生組織（shoot apical meris?tem, SAM）表達，對SAM 的形成和維持具有重要意義［3］，研究表明玉米WUS 基因與再生基因BBM 在植物組織培養(yǎng)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，二者共轉(zhuǎn)化可顯著提高玉米、高粱、甘蔗的轉(zhuǎn)化效率［5］。WOX1和WOX3 在擬南芥、黃瓜、柳枝稷等植物的器官側(cè)向生長中起重要作用［6-8］。WOX2 在早期胚胎細胞發(fā)育過程中發(fā)揮功能，云杉PaWOX2 可作為胚胎發(fā)生的潛力標記［9］，同樣地，WOX8 和WOX9 也是胚胎發(fā)育所必需的［10］。WOX4 能夠促進擬南芥和番茄維管形成層的分化和維持［11］。WOX5 在根尖分生組織（rootapical meristem, RAM）中表達，并維持RAM 中干細胞的穩(wěn)定性［12］，同時過表達TaWOX5 能夠顯著提高小麥轉(zhuǎn)化效率、再生能力［13］。研究證明WOX6主要調(diào)控胚珠和種子發(fā)育，在珠被和卵細胞形成的過程中防止細胞提前分化［14］。擬南芥WOX7 在側(cè)根發(fā)育的所有階段表達，并以糖依賴性的方式抑制側(cè)根發(fā)育，過表達AtWOX7 將顯著減少植株側(cè)根原基數(shù)量［15］。WOX11 和WOX12 在調(diào)控根系發(fā)育上功能冗余，過表達PagWOX11/12a 可促進銀腺楊根系伸長、生物量增加［16］。WOX13 和WOX14 與花器官的形成和發(fā)育相關(guān)，過表達OsWOX13 可使水稻開花期提早7-10 d［17］，AtWOX14 能夠促進擬南芥花序軸中維管細胞的分化和木質(zhì)化［18］。此外，WOX 基因家族成員還參與逆境脅迫應(yīng)答，其中，AtWOX6 在根尖的維持和根發(fā)育中起著重要作用，在冷脅迫應(yīng)答中扮演重要角色［19］，茶樹CsWOXs 在PEG 誘導的干旱脅迫、鹽脅迫處理下存在差異表達，響應(yīng)非生物脅迫［20］，過表達水稻OsWOX13 能夠提高水稻耐旱性［17］，敲除棉花GhWOX4 導致轉(zhuǎn)基因棉花耐旱性顯著降低［21］，過表達PagWOX11/12a 可顯著增強銀腺楊耐旱性與耐鹽性［16,22］。

WOX 基因家族成員參與調(diào)控植物生長發(fā)育、響應(yīng)逆境脅迫等重要過程，已在多種植物中得到鑒定，但目前對馬鈴薯WOX 基因家族的鑒定及基因功能的研究尚未見報道。

本研究利用馬鈴薯基因組信息，通過生物信息學方法對馬鈴薯WOX 基因家族成員進行鑒定，分析其基因結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、染色體分布、表達模式等。通過愈傷組織培養(yǎng)與RT?qPCR 試驗，證明StWOX5 在離體再生方面的功能，為進一步解析馬鈴薯StWOXs 功能及調(diào)控植物生長發(fā)育分子機制，以及利用目標基因在馬鈴薯育種研發(fā)與應(yīng)用方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為馬鈴薯品種（系）大西洋（DY）、84、85、Z291，由寧夏農(nóng)林科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心（寧夏農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室）提供。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯WOX 家族成員蛋白鑒定 使用HM?MER 3.0 軟件對擬南芥、番茄、煙草、水稻 WOX 蛋白序列構(gòu)建隱馬爾可夫模型，并以此模型搜尋馬鈴薯所有編碼蛋白序列，再從中找出潛在的WOX 家族序列。使用BLASTP［23］將馬鈴薯所有蛋白序列與獲取的WOX 家族參考序列進行比對（e?value 設(shè)為1e-20），保留比對成功的同源序列作為候選WOX家族蛋白序列。利用軟件pfamscan 和Pfam A［24］數(shù)據(jù)庫對獲得的候選序列進行結(jié)構(gòu)域注釋，將含有PF00046 結(jié)構(gòu)域的序列作為最終馬鈴薯WOX 序列。

1.2.2 馬鈴薯WOX 成員共線性分析 使用MCS?canX 軟件，采用默認參數(shù)（MATCH SCORE: 50;MATCH SIZE: 5; GAP PENALTY: ?1; OVERLAP WIN?DOW: 5; E VALUE: 1e-05; MAX GAPS: 25），在馬鈴薯WOX 家族種內(nèi)和種間進行基因共線性分析。

1.2.3 馬鈴薯WOX 基因家族成員理化性質(zhì)分析、亞細胞定位 利用在線軟件ExPASy 分析馬鈴薯WOX家族蛋白的氨基酸長度、分子量、等電點、不穩(wěn)定指數(shù)等理化性質(zhì)。通過ProtComp 9.0 對馬鈴薯WOX基因家族成員進行亞細胞定位預測。

1.2.4 馬鈴薯WOX 系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建及分析 使用mafft 軟件對馬鈴薯、擬南芥、番茄、煙草、水稻W(wǎng)OX 家族蛋白序列進行多序列比對，然后，將比對結(jié)果導入MEGA 軟件，采用鄰接法（neighbor?joining method, NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（參數(shù)設(shè)置：模型為p?distance，缺失數(shù)據(jù)方法為Partial deletion，cutoff 為50%，Bootstrap 設(shè) 置 為1 000）。 在 軟 件iTOL 中對進化樹進行注釋。

1.2.5 StWOXs 基因結(jié)構(gòu)、蛋白motif、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析 使用軟件GSDS 分析馬鈴薯WOX 基因家族成員的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)分布。利用MEME軟件分析家族成員的motif 結(jié)構(gòu)（motif 尋找數(shù)量為15）。截取基因結(jié)構(gòu)上游2 000 bp 區(qū)域作為啟動子調(diào)節(jié)序列，利用PlantTFDB 軟件預測啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點（transcription factor binding site,TFBS），在啟動子物理圖譜中標記和顯示數(shù)量排名前12 的結(jié)合位點，并統(tǒng)計分析StWOXs 啟動子上TFBS 的類型和數(shù)量。

1.2.6 StWOXs 表達模式分析及愈傷組織誘導分化培養(yǎng) 基于PGSC 下載的馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組（RNA?seq）數(shù)據(jù)，對StWOXs 表達量數(shù)據(jù)做層次聚類分析，將具有相同或相似表達行為的基因進行聚類。根據(jù)聚類圖，選擇與馬鈴薯離體再生相關(guān)的基因StWOX5進行功能分析。以馬鈴薯大西洋（DY）、84、85、Z291 四個具有不同再生能力品種（系）的無菌脫毒苗作為試驗材料，取莖段置于MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每皿初始放置25 個莖段，共3 皿。外植體接種10、20 和30 d 后，統(tǒng)計不同品種（系）愈傷組織個數(shù)，計算出愈率。待愈傷組織誘導成功后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，統(tǒng)計10、20 和30 d 后不同品種（系）的分化率，并通過實時熒光定量PCR（RT?qPCR）測定不同品種StWOX5 在分化階段的相對表達量。愈傷組織誘導率（%）=誘導出愈傷組織的莖段數(shù)/莖段總數(shù)×100%，分化率（%）=分化莖段數(shù)/莖段總數(shù)×100%。熒光定量PCR 試驗步驟為：使用試劑盒法提取不同馬鈴薯品種（系）分化外植體RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 測定StWOX5 的表達情況。以EF1α 為內(nèi)參，采用熒光染料法進行實時熒光定量PCR（引物見表1），應(yīng)用2-△△CT法計算StWOX5相對表達量［25］，每個檢測樣品進行3 次重復試驗。PCR 反應(yīng)程序設(shè)置為95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 15 s，40 個循環(huán)；72℃ 10 min。

表1 實時熒光定量PCR 引物Table 1 Primers used in real-time quantitative PCR

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 StWOX5 RT?qPCR 試驗數(shù)據(jù)均為3次生物學重復的平均值。使用Graphpad Prism 8.0 軟件作圖、SPSS 23.0 軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 馬鈴薯WOX基因家族成員

經(jīng)比對、分析，共獲得11 個馬鈴薯WOX 基因家族成員，它們隨機分布在第2、3、4、6、11 染色體上，其中，第2 和6 染色體上分別分布了3 個WOX 成員，數(shù)量最多，第4 染色體上WOX 成員分布最少（1 個）?；卩徑訕溥M化關(guān)系，對馬鈴薯WOX 基因家族成員按分支結(jié)果進行命名。理化性質(zhì)及亞細胞定位信息如表2 所示，11 個馬鈴薯WOX蛋白的氨基酸數(shù)量為157-391，相對分子質(zhì)量為18.5-44.1 kD；等電點處于5.53-9.97，其中5 個成員的理論等電點小于7.0，占比45%；預測所有馬鈴薯WOX 成員均定位于細胞核內(nèi)。

表2 馬鈴薯WOX 基因家族成員信息Table 2 Information of WOX gene family members in S.tuberosum

2.2 馬鈴薯WOX成員共線性分析

為探究馬鈴薯WOX 家族的基因重復事件，對馬鈴薯WOX 成員之間的種內(nèi)共線性，以及擬南芥、番茄、水稻、馬鈴薯WOX 的種間共線性進行分析。結(jié)果（圖1?A）表明，馬鈴薯StWOX3c和StWOX3b 發(fā)生了序列復制事件，二者具有共線性。馬鈴薯StWOXs 和擬南芥AtWOXs 中有7 個同源基因?qū)?，分別為StWUS/AtWUS、StWOX1/AtWOX1、StWOX2/AtWOX2、StWOX3a/AtWOX3、StWOX4/AtWOX4、StWOX5/AtWOX5 和StWOX13/AtWOX13；馬鈴薯StWOXs 和番茄SlWOXs 中有10 個同源基因?qū)?，?別 為StWUS/SlWUS、StWOX1/SlWOX1、StWOX2/SlWOX2、StWOX3b/SlWOX3b、StWOX3c/SlWOX3b、StWOX4/SlWOX4、StWOX5/SlWOX5、StWOX9/SlWOX9、StWOX11/SlWOX11 和StWOX13/SlWOX13；馬鈴薯StWOXs 和水稻OsWOXs 之間無同源基因?qū)Γ▓D1?B）。

圖1 馬鈴薯WOX 成員共線性分析Fig.1 Collinear analysis of potato WOX members

2.3 系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

為明確馬鈴薯WOX 基因家族的進化關(guān)系，對馬鈴薯、擬南芥、番茄、煙草、水稻5 個物種共58 個蛋白序列進行多重比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果（圖2）顯示，58 個蛋白序列分為3 個類群：WUS 進化分支、中間進化分支和古老進化分支，每個類群分別含有33、15 和10 個WOX 成員。11 個馬鈴薯WOX 成員分布在3 個不同的分支中，其中，WUS 進化分支中成員最多，包含StWUS、StWOX1、StWOX2、StWOX3a、StWOX3b、StWOX3c、StWOX4、StWOX5 共8 個 蛋 白， 與 其分在同一類群的還有8 個擬南芥WOX 成員（At?WUS、AtWOX1/2/3/4/5/6/7）、6 個 水 稻W(wǎng)OX 成 員（OsWOX1/2/3/4/5/9）、4 個煙草WOX 成員（NtabWUS、NtabWOX4a/4b/5）、7 個 番 茄WOX 成 員（SlWUS、SlWOX1/2/3a/3b/4/5）；中間進化分支中含有2 個馬鈴薯WOX 成員（StWOX9/11），與其分在同一類群的有4 個擬南芥WOX 成員（AtWOX8/9/11/12）、6個 水 稻W(wǎng)OX 成 員（OsWOX6/7/10/11/12/13）、1 個煙草WOX 成員（NtabWOX11）、2 個番茄WOX 成員（SlWOX9/11）；古老進化分支中僅含1 個馬鈴薯WOX 家族成員（StWOX13），與其分在同一類群的有 3 個擬南芥WOX 成員（AtWOX10/13/14）、1 個水稻W(wǎng)OX 成員（OsWOX8）、4 個煙草WOX 成員（NtabWOX13a/13b/13c/13d）、1 個 番 茄WOX 成 員（SlWOX13）。通過比對分析發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯WOX 基因家族成員與同為茄科的番茄同源關(guān)系最近，且所有亞家族中均含有馬鈴薯、擬南芥、番茄中的相應(yīng)成員，預示著WOX 基因家族成員分化的時間可能在馬鈴薯、擬南芥、番茄物種分化時間之前。

圖2 馬鈴薯、擬南芥、番茄、煙草、水稻W(wǎng)OX 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of WOX proteins among S.tuberosum, A.thaliana, S.lycopersicum, N.tabacum, and O.sativa

2.4 StWOXs基因結(jié)構(gòu)與蛋白motif分析

為了解StWOXs 基因結(jié)構(gòu)特征，對該家族成員基因的內(nèi)含子/外顯子分布進行了分析。由圖3 可知，StWOXs 基因結(jié)構(gòu)相對簡單，外顯子數(shù)目2-6個，內(nèi)含子數(shù)目1-5 個。其中5 個基因（StWOX2、StWOX3a、StWOX3b、StWOX3c、StWOX5） 外 顯子 最 少， 僅 有2 個。 另 外，4 個 基 因（StWUS、StWOX2、StWOX9、StWOX11）沒有UTR 結(jié)構(gòu)。利用MEME 在線軟件，分析確定了馬鈴薯StWOX 蛋白的15 個保守基序，命名為motif1-motif15。由圖4可知，motif1 和motif2 是除StWOX9 蛋白外其他10個StWOX 蛋白所共有的。不同進化分支中，StWOX蛋白的motif 組成差異較大。其中，motif3 僅存在于WUS 分支，motif5 和motif6 為中間進化分支成員所特有。

圖3 StWOXs 基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Structure of StWOX genes

圖4 StWOX 蛋白motif 分布及其序列標識Fig.4 Distribution and sequence logos of motifs in StWOX proteins

2.5 StWOXs啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析

為研究轉(zhuǎn)錄因子對StWOXs 表達的調(diào)控，提取StWOXs序列上游2 000 bp 區(qū)域作為啟動子調(diào)節(jié)序列，預測啟動子序列中的TFBS 及其數(shù)量（圖5），Dof、C2H2、MYB、ERF、MYB_related、MIKC_MADS、BBR?BPC、GATA、bZIP、M?type_MADS、WRKY、bHLH 是排名前12 的轉(zhuǎn)錄因子家族，它們與光響應(yīng)、植物激素響應(yīng)、逆境脅迫響應(yīng)以及生長發(fā)育相關(guān)。Dof、C2H2、MYB、ERF、MYB_related、bZIP 在所有馬鈴薯WOX 基因家族成員中均預測出現(xiàn)，Dof 轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)合位點數(shù)量最多（102 個，含“+、?”雙鏈），bHLH 的結(jié)合位點數(shù)量最少（24 個，含“+、?”雙鏈）。不同進化分支間、不同成員間TFBS 數(shù)量和類別存在差異，StWOX5 啟動子區(qū)域的TFBS 最多（103個），其中ERF 和GATA 數(shù)量均大于20；StWOX3a啟動子區(qū)域的TFBS 數(shù)量最少（17 個）。

圖5 StWOXs 啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測及數(shù)量統(tǒng)計Fig.5 Prediction and numerical statistics of TFBS in the promoter region of StWOXs

2.6 StWOXs表達模式分析

11 個StWOX 在馬鈴薯根、莖、葉、花、果實、愈傷組織等不同組織中表達差異顯著（圖6?A），StWUS 在葉柄組織中高表達；StWOX1、StWOX3a、StWOX3c 在莖中表達量最高；StWOX2、StWOX9 在果實中的表達量較高；StWOX3b 主要在花中表達；StWOX4、StWOX5、StWOX11、StWOX13 均在愈傷組織中得到大量積累，推測在植物離體再生過程中可能發(fā)揮一定作用。在干旱脅迫下（圖6?B），StWUS、StWOX1、StWOX3c、StWOX4、StWOX5、StWOX13表達量上調(diào)；在鹽脅迫下，StWOX3a、StWOX11上 調(diào) 表 達；在 高 溫 處 理 下（圖6?C），StWOX4、StWOX5、StWOX13 表達上調(diào)，初步說明StWOXs 在馬鈴薯響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮作用。

圖6 StWOXs 在不同組織部位（A）、干旱和鹽脅迫（B）、熱脅迫（C）中的表達模式Fig.6 Relative expression patterns of StWOXs in different tissues（A）, under drought and salt stresses（B）, and under heat stress（C）

2.7 愈傷組織誘導分化及StWOX5在分化過程中的RT?qPCR驗證

為驗證StWOX5 在馬鈴薯離體再生過程中的功能作用，將StWOX5 作為候選基因，分析其在不同馬鈴薯品種（系）愈傷組織分化過程中的表達模式。結(jié)果顯示，接種10 d 后，4 個品種（系）愈傷組織誘導率呈顯著差異（P＜0.05），其中84 號出愈率最高，其次為Z291 號，DY、85 號最低。在接種20 d后出愈率無明顯差異，除85 號外，其余出愈率均達到100%，且愈傷組織顏色較綠，結(jié)構(gòu)松散，呈紡錘狀生長（圖7?A-B）。分化培養(yǎng)30 d 后，4 個品種（系）愈傷組織分化效果呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），其中84號分化率最高，達55.1%，85 號愈傷組織無綠色芽點出現(xiàn)，分化率最低（圖7?C-D）。不同品種（系）愈傷組織分化階段StWOX5 的RT?qPCR 結(jié)果表明（圖7?E），在分化20 和30 d 后，84 號StWOX5 的相對表達量均最高，而85 號最低，這與愈傷組織分化率趨勢一致，說明分化過程中目標基因的相對表達量與愈傷組織分化率呈正相關(guān)，初步驗證了StWOX5參與馬鈴薯離體再生過程。

圖7 馬鈴薯不同品種（系）愈傷組織誘導分化及StWOX5 的RT-qPCR 驗證Fig.7 Callus induction and differentiation of different potato varieties（lines）, and RT-qPCR verification of StWOX5

3 討論

WOX 是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物生長發(fā)育、干細胞分化、植株離體再生等過程中發(fā)揮重要作用［26］。目前，WOX 基因家族已在擬南芥、玉米、番茄、芥菜等各類植物中得到鑒定［4,27-28］，但馬鈴薯WOX 基因家族相關(guān)研究尚未見報道。

本研究從馬鈴薯基因組中鑒定到11 個WOX 基因家族成員，它們隨機分布在5 條染色體上，對比發(fā)現(xiàn)馬鈴薯WOX成員比同為茄科植物的番茄多1個，即StWOX3c［29］。番茄和馬鈴薯中均包含WOX3a、WOX3b，分布在各自的第11 染色體上，而馬鈴薯StWOX3c 分布在第6 染色體上，且與StWOX3b 具有共線性，可能是因為在物種進化過程中發(fā)生了序列復制事件，推測StWOX3c 由StWOX3b 復制而來。分析物種間共線性發(fā)現(xiàn)StWOX 基因與擬南芥AtWOX基因、番茄SlWOX 基因之間存在多個同源基因?qū)?，表明StWOX 基因可能和擬南芥、番茄WOX 基因的同源基因來源于相同祖先，在調(diào)控植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮類似作用。對11 個馬鈴薯WOX 基因成員的基本信息進行分析，各成員亞細胞定位均在細胞核內(nèi)，氨基酸數(shù)量、等電點、相對分子質(zhì)量等理化性質(zhì)存在一定程度差異，該結(jié)果與李曉旭等［29］對番茄WOX 全基因組研究的結(jié)果相似，可能預示著馬鈴薯WOX 基因家族成員參與或調(diào)控細胞核內(nèi)的基因表達和遺傳信息的傳遞，且不同成員在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮的作用不同。前期研究結(jié)果表明，WOX 基因家族成員可分為3 個分支［1］，馬鈴薯WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員同樣分成WUS、中間和古老共3 個進化分支，且每個亞家族中都至少有1 個成員與番茄、擬南芥WOX 相應(yīng)亞家族中的成員存在直系同源關(guān)系，反映出WOX 基因家族成員分化的時間可能在馬鈴薯、擬南芥、番茄物種分化時間之前。結(jié)構(gòu)分析表明，不同進化分支間，基因外顯子和內(nèi)含子數(shù)量、蛋白motif 組成、啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點類型和數(shù)量存在不同程度的差異。對啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測發(fā)現(xiàn)，數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族為Dof、C2H2、MYB、ERF 等，均具有調(diào)控植物生長和發(fā)育、應(yīng)答環(huán)境脅迫等功能［30-33］。例如，Dof 廣泛參與種子萌發(fā)、維管的發(fā)育和葉片極性、花和花粉發(fā)育、光周期反應(yīng)，參與植物逆境響應(yīng)等過程［34］，C2H2參與調(diào)節(jié)植物器官生長、控制根的分生組織和葉片的極性等植物正常生長發(fā)育的各個進程，同時也參與植物生物和非生物脅迫下逆境應(yīng)答［31］，這預示馬鈴薯WOX 基因家族成員也在植物生長發(fā)育、器官形態(tài)建成、響應(yīng)逆境脅迫等方面參與調(diào)控，具體調(diào)控機制有待研究。

植物特異性轉(zhuǎn)錄因子WOX 基因通常具有組織表達特異性和響應(yīng)逆境脅迫的能力，綠豆中VrWOX5 在種子中表達量較高、VrWOX6 則在葉片中大量表達［35］；煙草NtWOX9 在花器官中特異性表達、NtWOX5b 則在根中表達量較高［36］；茶樹CsWOX1/2/3/20/28/29 在干旱脅迫下表達量較高、CsWOX21 在鹽脅迫下表達量上調(diào)［20］。與上述結(jié)果相似，StWOXs 同樣表現(xiàn)出組織表達特異性和響應(yīng)非生物脅迫的能力。StWOX4/5/11/13 在愈傷組織中特異表達；StWUS、StWOX1/3c/4/5/13 在甘露醇處理后上調(diào)表達；StWOX3a/11 在鹽脅迫下上調(diào)表達；StWOX4/5/13 在熱脅迫下表達量升高，暗示相應(yīng)基因可能參與馬鈴薯離體再生過程和非生物脅迫響應(yīng)。

WOX 基因的表達水平能夠影響植物組織培養(yǎng)過程中外植體愈傷組織的再生能力［37］。篩選在愈傷組織中高表達的基因StWOX5 進行驗證發(fā)現(xiàn)，在離體再生能力不同的4 個馬鈴薯品種（系）中，StWOX5的相對表達量與愈傷組織分化率呈正相關(guān)，進一步證明StWOX5 在馬鈴薯離體再生過程中發(fā)揮重要作用，類似地，在苦蕎中也發(fā)現(xiàn)FtWOX 的表達模式與苦蕎出愈率呈顯著正相關(guān)關(guān)系［38］。同時已有研究表明過表達小麥TaWOX5 能夠顯著提高小麥的轉(zhuǎn)化效率［13］，推測過表達StWOX5 可能會提高馬鈴薯外植體產(chǎn)生愈傷組織的能力，這將對提高馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化效率、促進基因編輯等技術(shù)在馬鈴薯遺傳育種中的應(yīng)用意義重大。

4 結(jié)論

共鑒定得到11 個馬鈴薯WOX 基因家族成員，馬鈴薯WOX 基因家族成員被分成3 個進化分支，即WUS 分支、中間分支和古老分支，不同分支中StWOXs 的基因結(jié)構(gòu)、蛋白motif 組成、啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點類型和數(shù)量存在差異。StWOXs 具有組織表達特異性和響應(yīng)非生物脅迫的能力。在具有不同再生能力的馬鈴薯品種（系）中，StWOX5 的相對表達量與愈傷組織分化率呈正相關(guān)，證明StWOX5在馬鈴薯離體再生過程中的作用。