基于UPLC-QTOF-MS解析苦蕎黃酮組成及藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析

董玲 張鳳菊，* 趙馳 楊文淵 韓梅 黃巧蓮 阿木布哈 李治華，*

（1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066；2四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，四川 成都 610066；3四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，四川 成都 610066；4甘洛縣教育體育和科學(xué)技術(shù)局，四川 涼山 615100）

苦蕎［Fagopyrumtataricum（L.）Gaertn.］是蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（FagopyrumMill）雙子葉植物成熟的種子［1］?？嗍w作為重要的藥食同源性食品原料，具有很高的醫(yī)藥價值，包括預(yù)防高血壓、癌癥，輔助降血糖、血脂和消炎鎮(zhèn)痛等多種功效［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎黃酮提取物具有多種生物活性功能，如降低脂質(zhì)過氧化對機(jī)體的損傷，治療心血管疾?。?］；抑制肝細(xì)胞脂肪積累與變性、減輕乙醇對肝細(xì)胞膜和細(xì)胞的氧化損傷，從而緩解脂肪肝炎癥［5］；阻止血漿氧化三甲胺（plasma trimethylamine-N-oxide，TMAO）引起的血管功能障礙和肝損傷［6］；通過靶向調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs），防止細(xì)胞氧化還原態(tài)失衡，改善胰島素抵抗作用，顯著保護(hù)細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的氧化損傷［7］?？嗍w提取物的生物功能與苦蕎富含黃酮類物質(zhì)相關(guān)［6-7］，主要包括蘆丁、槲皮素和山奈酚等［8］。

目前，黃酮提取方法主要包括有機(jī)溶劑浸提、熱水提取、超臨界萃取、超聲輔助提取、微波輔助提取和酶法提取等［9-10］。由于大多數(shù)黃酮類物質(zhì)不溶于水，所以黃酮物質(zhì)提取常采用有機(jī)溶劑。提取溶劑包括甲醇、乙醇、丙酮等。相較于甲醇、丙酮等有機(jī)試劑，乙醇具有綠色、高效、易回收、污染小且價格低等優(yōu)點。超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupoletime of flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）是復(fù)雜樣品中化學(xué)組成分析和鑒定的重要工具，具有高效分離能力以及高靈敏度、高選擇性、高質(zhì)量精度和掃描范圍廣等特點，已被廣泛應(yīng)用于植物成分鑒定。中藥系統(tǒng)藥理學(xué)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）收錄了《中華人民共和國藥典 2010年版》中所有中草藥的化合物成分，并為每種化合物提供了藥理作用靶點及相關(guān)疾病信息。該研究平臺被廣泛應(yīng)用于中藥新藥開發(fā)及中醫(yī)理論研究，為傳統(tǒng)中藥活性物質(zhì)開發(fā)提供了網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)分析［11］。

本研究通過優(yōu)化以乙醇為試劑的苦蕎黃酮綠色高效提取方法，基于UPLC-QTOF-MS解析苦蕎中黃酮主要物質(zhì)結(jié)構(gòu)，同時采用液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry，UPLCQqQ-MS/MS）分析方法對鑒定到的主要關(guān)鍵黃酮進(jìn)行定量分析，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析其活性物質(zhì)的中藥傳統(tǒng)藥理學(xué)作用，旨在為苦蕎精深加工及黃酮物質(zhì)開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎，甘洛大涼山蕎升酒業(yè)有限責(zé)任公司；蘆丁對照品，上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇（分析純），成都市科龍化工試劑廠；甲醇，賽默飛世爾科技公司（美國）。

對照品：白楊素（I1521027）、大豆苷元（E1631116）、漆黃素（K1629007）、山奈酚（A1619011）、木犀草素（H1617016）、兒茶素（B1707017）、槲皮素（C20J6Y17 22）、淫羊藿苷（F1806121）、柚皮苷（C1420111）、地奧司明（K1809143），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘草素（RDD-G03611805007）、芒柄花黃素（BZ2021101803）、芹菜素（RFS-Q00211801029）、黃豆黃素（BZ2021101805）、二氫槲皮素（BZ2021101804）、二氫楊梅素（BZ2021101801）、牡荊素（BX2021101802）、染料木苷（BZ2021101806）、黃豆黃苷（BZ2021101807）、黃芪苷（Z-020-160519）、槲皮苷（RFS-H01111805008）、木犀草苷（M-025-160307）、大豆苷（BZ2021101808）、異槲皮苷（K2002218），成都瑞芬思德丹生物科技有限公司；染料木素（20150615）、黃芩苷（20210317），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）；柚皮素（BCBN9024 V），美國sigma公司；鷹嘴豆芽素A（J1215AS）、表兒茶素（N0906AS）、異牡荊素（M0420AS），大連美侖生物技術(shù)有限公司；山奈素（F11A11X108412）、楊梅素（YM0311YA13）、水飛薊素（C27N11Y131954）、蘆?。‥1908122），上海源葉生物科技有限公司；葛根素（C10800621），上海麥克林生化科技股份有限公司，均供含量測定用。

1.2 主要儀器與設(shè)備

5810R臺式冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；SynergyHTX多功能微孔板檢測儀，美國伯騰儀器有限公司；超高效液相色譜儀，美國Waters公司；AB 5000三重四極桿質(zhì)譜儀，AB SCIEX公司（美國）；Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜儀、Thermo Q Exactive Focus四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 苦蕎原料處理

將黑苦蕎初篩去雜，在50 ℃烘箱中干燥4 h，取出后磨成細(xì)粉，密封保存，待用。

1.4 苦蕎乙醇超聲提取條件工藝優(yōu)化

本試驗重點研究乙醇濃度、超聲功率、超聲溫度、超聲時間以及料液比5種關(guān)鍵因素對苦蕎黃酮提取率的影響。稱取樣品1.0 g，精密稱定后置于小燒杯中，在以下試驗條件下進(jìn)行黃酮提取。（1）乙醇濃度：加入40 mL濃度（V/V）分別為50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇，超聲功率為200 W，在50 ℃條件下超聲30 min。超聲后用中速濾紙過濾，濾液用各對應(yīng)濃度乙醇溶液定容到50 mL，待測。（2）超聲功率：加入40 mL濃度為60%的乙醇，超聲功率分別為100、120、140、160、180、200 W，在50 ℃條件下超聲30 min。超聲后用中速濾紙過濾，濾液用60%濃度乙醇定容到50 mL，待測。（3）超聲溫度：加入40 mL濃度為60%的乙醇，超聲功率為200 W，在40、50、60、70、80℃條件下分別超聲30 min。超聲后用中速濾紙過濾，濾液用60%濃度乙醇定容到50 mL，待測。（4）超聲時間：加入40 mL濃度為60%的乙醇，超聲功率為200 W，在50 ℃條件下分別超聲30、40、50、60、80、100 min。超聲后用中速濾紙過濾，濾液用60%濃度乙醇定容到50 mL，待測。（5）料液比：分別加入30、40、50、60、70 mL濃度為60%的乙醇，超聲功率為200 W，在50 ℃條件下超聲30 min。超聲后用中速濾紙過濾，濾液用60%濃度乙醇定容到100 mL，待測。

1.5 苦蕎總黃酮測定

1.5.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 參照葛瑞宏等［12］的方法，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮含量。具體操作如下：取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.000 0 mg，用60%的乙醇溶液定容至25 mL容量瓶中，得到濃度為0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。分別取0、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mL的上述儲備液于9個10 mL的容量瓶中，用60%乙醇稀釋定容至10 mL，得到濃度分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.12 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別取上述濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液5 mL于試管中，加入5%亞硝酸鈉0.7 mL放置6 min，再加入10%硝酸鋁0.7 mL放置6 min，加4%氫氧化鈉2 mL，搖勻并定容至10 mL，10 min后測定510 nm處的吸光值（A），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.5.2 苦蕎提取物中總黃酮測定 取5 mL提取液置于試管中，加入5%亞硝酸鈉0.7 mL放置6 min，再加入10%硝酸鋁0.7 mL放置6 min，加4%氫氧化鈉2 mL，搖勻并定容至10 mL，10 min后測定510 nm處的吸光值（A1），減去空白板吸光值（A0）得到準(zhǔn)確吸光度值（A）。提取得率（mg·g-1）按以下公式計算［12］：

提取得率=提取液中黃酮類化合物總量/提取用苦蕎質(zhì)量。

1.6 UPLC-QTOF-MS黃酮結(jié)構(gòu)定性解析

色譜柱采用Kinetex?Biphenyl 100 ?柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫為40 ℃；流動相A為0.1%甲酸水溶液；流動相B為乙腈，梯度洗脫，流速為0.3 mL·min-1。梯度洗脫程序見表1，黃酮提取液進(jìn)樣量為2 μL。

表1 UPLC洗脫程序Table 1 UPLC elution procedure

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；掃描模式為二級子離子采用加數(shù)據(jù)依賴采集模式（data-dependent acquisition，DDA）；掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）80～1 200；噴霧電壓為-3 kV；鞘氣壓力為7 000 kPa，輔助氣壓力為1 750 kPa；一級質(zhì)譜全掃描分辨率為70 000，二級質(zhì)譜分辨率為17 500，碰撞能量為20、40、60 eV；離子傳輸溫度為325 ℃；輔助加熱溫度為350 ℃。

1.7 UPLC-QqQ-MS/MS黃酮定量分析

定量分析采用Waters超高效液相色譜儀和AB 5000三重四極桿質(zhì)譜儀。

色譜條件：采用ACQU ITY UPLC?BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國Waters公司），黃酮提取液和黃酮對照品進(jìn)樣量5 μL，柱溫40 ℃，流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為甲醇，流速為0.25 mL·min-1。梯度洗脫條件為0～1 min，10% B；1～3 min，10%～33% B；3～10 min，33% B；10～15 min，33%～50% B；15～20 min，50%～90% B；20～21 min，90% B；21～22 min，90%～10%B；22～25 min，10% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子電離模式。離子源溫度500 ℃，離子源電壓-4 500 V，碰撞氣41.37 kPa，氣簾氣206.84 kPa，霧化氣和輔助氣均為344.74 kPa。檢測方式：采用多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）進(jìn)行掃描，用特征離子對進(jìn)行定量分析。

1.8 苦蕎中關(guān)鍵有效生物活性類黃酮成分的藥理學(xué)分析

用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢從UPLCQTOF-MS分析得到的代謝物，鑒定其是否屬于關(guān)鍵活性成分，并查詢防治相關(guān)疾病信息。當(dāng)代謝產(chǎn)物的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥5%、藥物相似度（drug-likeness，DL）≥0.14時［13］，視為苦蕎中屬于中藥的關(guān)鍵活性成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件對黃酮提取率的影響

以蘆丁作為總黃酮測定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測定蘆丁系列濃度在510 nm波長處的吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程如下。由圖1-A可知，盧丁質(zhì)量濃度與吸光值間的線性關(guān)系良好。

圖1 提取條件對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of extraction conditions on the extraction rate of total flavonoids

y=2.957 2x+0.001 4，R2=1（n=6）

苦蕎黃酮提取率隨著乙醇濃度（圖1-B）、超聲功率（圖1-C）、超聲溫度（圖1-D）、超聲時間（圖1-E）和提取液與苦蕎原料比（圖1-F）的增加而提高，當(dāng)達(dá)最高值時，又開始呈現(xiàn)下降趨勢。

單因素試驗結(jié)果表明，乙醇濃度90%（V/V）、超聲功率140 W、超聲溫度70 ℃、超聲時間60 min、提取液與苦蕎原料比50∶1（mL·g-1）為超聲輔助乙醇提取苦蕎黃酮的有效條件。

2.2 UPLC-QTOF-MS黃酮結(jié)構(gòu)鑒定

如表2所示，本研究從苦蕎乙醇提取物中共鑒定到16種黃酮類物質(zhì)，［M-H］-分子量為268.898～609.138。其中分子量為268～300的有6個，300～400的有2個，400～500的有6個，500～600的有1個，大于600的有1個。在黃酮結(jié)構(gòu)方面，主要可分為黃酮醇、黃烷醇和黃酮糖苷3類，其中蘆丁、異牡荊素、牡荊素、異槲皮苷、槲皮苷、柚皮苷、黃芪苷和木犀草苷均為黃酮糖苷類，表明黃酮糖苷類化合物是苦蕎中的主要類黃酮成分結(jié)構(gòu)。

表2 苦蕎提取物中黃酮鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of flavonoids in tartary buckwheat extract

2.3 黃酮定量分析

由表3可知，所有測定的黃酮對照品在測定范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好，定量限為0.1～2.0 ng·mL-1。用標(biāo)準(zhǔn)曲線對苦蕎黃酮提取物進(jìn)行定量分析，檢測到的黃酮物質(zhì)總含量為239.87 μg·mL-1。其中，蘆丁、表兒茶素和兒茶素含量較高，分別為115.81、72.99和23.08 μg·mL-1。

表3 苦蕎提取物中黃酮定量分析結(jié)果Table 3 Quantitative analysis results of flavonoids in tartary buckwheat extract

2.4 苦蕎中黃酮類關(guān)鍵活性物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

采用TCMSP數(shù)據(jù)庫分析苦蕎中黃酮類物質(zhì)的潛在功能價值，結(jié)果見表4。苦蕎中黃酮化合物的口服生物利用度（OB）整體較高，僅少量糖苷類化合物的OB較低。本試驗提取和鑒定的黃酮化合物分子量大部分小于500（表2），表明苦蕎黃酮在潛在口服生物利用度上較高。同時，由表4可以看出，苦蕎黃酮化合物的類藥性（DL）值也較高，均大于0.14。

3 討論

本研究乙醇濃度對苦蕎黃酮提取率影響的結(jié)果，與龍旭等［14］提取丹參黃酮的結(jié)果相似，可能與苦蕎中黃酮物質(zhì)的極性相關(guān)；超聲功率增大可增加空化效應(yīng)，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，有利于黃酮物質(zhì)溶出，當(dāng)功率過大，也會破壞黃酮的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率降低［15］；當(dāng)提取溫度超過70 ℃時，黃酮提取率呈現(xiàn)下降趨勢，可能是高溫導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)受到破壞所致［16］。當(dāng)超聲時間從60 min增至100 min時，黃酮提取率明顯下降，可能是由于提取時間過長導(dǎo)致黃酮發(fā)生變性損失，進(jìn)而導(dǎo)致黃酮提取率呈現(xiàn)下降趨勢［17］。

UPLC-QTOF-MS鑒定結(jié)果顯示，苦蕎中黃酮類化合物主要屬于黃酮苷類化合物，這與王佳蕊［18］的研究結(jié)果一致。值得注意的是，前人在苦蕎葉和花中都發(fā)現(xiàn)了木犀草素（Luteolin）［19-20］，本研究在蕎麥種子中也發(fā)現(xiàn)了該化合物，有利于豐富對苦蕎生長周期中各階段形成的黃酮類化合物的認(rèn)識。有報道顯示，苦蕎中的槲皮素和山奈酚含量高于表兒茶素和兒茶素含量，這與本研究結(jié)果不一致，推測主要原因是原料和提取工藝不同［21］。本研究的試驗材料為涼山州黑苦蕎。涼山州地處川西高原，受當(dāng)?shù)睾０?、氣溫的影響，黑苦蕎獨特的植物生物代謝方式造成其黃酮類化合物間的差異［22］。

從苦蕎中鑒定到的黃酮經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，大部分具有較高的口服生物利用度（OB）和類藥性（DL），雖然有個別黃酮物質(zhì)OB較低，但該活性物質(zhì)經(jīng)胃腸道消化代謝，脫去糖后形成的苷元的OB較高，如蘆丁的OB只有3.2，經(jīng)胃腸道菌群消化代謝后的產(chǎn)物槲皮素的OB為46.43［23］。由此推測苦蕎的藥用功能可能與苦蕎中的黃酮化合物質(zhì)具有較高的OB相關(guān)?？嗍w黃酮類物質(zhì)作用靶點主要集中在前列腺素G/H合成酶受體1和2（prostaglandin G/H synthase 1/2，PTGS1/PTGS2），PTGS1有間接保護(hù)心臟的作用［24］。蘆丁是苦蕎中的主要酚類物質(zhì)［25-26］，其可作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，具有治療白血病、抗感染、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)細(xì)胞、神經(jīng)和心血管等多種藥理活性［27-28］。表兒茶素（又名L-表兒茶素，（-）-表兒茶素和L-兒茶素）和兒茶素（又名兒茶酸、兒茶精）是異構(gòu)體［29］，屬于黃烷醇類化合物，具有抗糖尿病活性、抗高血脂癥、預(yù)防心血管疾病和代謝紊亂的功能［30-31］。上述結(jié)果表明大部分苦蕎活性物質(zhì)可在治療抗動脈硬化和血管炎等血管疾病中發(fā)揮重要作用。因此，推測苦蕎中的大部分活性黃酮類物質(zhì)在預(yù)防、治療心血管疾病方面具有一定優(yōu)勢。此外，表兒茶素作為苦蕎中含量較多的化學(xué)物質(zhì)，還能作用于雌激素受體預(yù)防治療女性高發(fā)的乳腺癌，以及絕經(jīng)期婦女綜合征。

中草藥成分發(fā)揮藥理作用需達(dá)到特定的劑量，因此對中草藥中的活性成分開展準(zhǔn)確的定量研究有一定必要性。本研究證實，基于UPLC-QqQ-MS/MS的多離子反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）是一種高效的定性、定量分析黃酮的方法，未來可進(jìn)一步結(jié)合非靶向的定性鑒定優(yōu)勢和三重四級桿的定量優(yōu)勢，開發(fā)更多的植物黃酮定性和定量分析方法，為后續(xù)藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

單因素試驗結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度為90%、超聲功率為140 W、超聲溫度為70 ℃、超聲時間為60 min、乙醇溶液與苦蕎原料比為50∶1（mL·g-1）時，超聲提取苦蕎黃酮的提取率最高。本研究采用UPLC-QTOF-MS共鑒定到16種黃酮物質(zhì)，采用UPLC-QqQ-MS/MS定量分析發(fā)現(xiàn)苦蕎黃酮提取物中的主要成分為蘆丁、表兒茶素和兒茶素，含量分別為115.81、72.99和23.08 μg·mL-1。經(jīng)TCMSP網(wǎng)絡(luò)分析，已鑒定到的黃酮化合物中，大部分物質(zhì)都具有潛在的抗癌、防治心血管疾病等藥用功效。