轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合揭示甜瓜響應(yīng)澇害脅迫的分子機(jī)制

張煥欣 閆承璞 李國權(quán) 張新龍 曹 娜 樂美旺朱方紅 劉文革

（1江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，江西 南昌 330200；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009）

澇害是普遍存在且頻繁發(fā)生的嚴(yán)重自然災(zāi)害，影響全球約10%的耕地，導(dǎo)致作物減產(chǎn)約15%～80%［1］。我國是受澇害影響較為嚴(yán)重的國家，尤其在長(zhǎng)江中下游地區(qū)，春季經(jīng)常陰雨連綿，夏季多暴雨天氣，導(dǎo)致土壤含水量過高，因此春夏季節(jié)土壤經(jīng)常處于澇漬狀態(tài)［2-3］。甜瓜（CucumismeloL.）是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的葫蘆科作物，根系呼吸能力強(qiáng)，需氧量高，不耐濕澇，對(duì)澇害脅迫非常敏感，其產(chǎn)量和品質(zhì)都會(huì)因澇害脅迫而降低，甚至導(dǎo)致植株死亡［3］。澇害脅迫已成為我國長(zhǎng)江中下游地區(qū)甜瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約因素之一，因此，探明甜瓜對(duì)澇害脅迫的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)甜瓜具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

澇害脅迫對(duì)植物的影響具有多面性，最嚴(yán)重的是導(dǎo)致低氧次生脅迫。氧氣在水中的低擴(kuò)散率與低溶解率導(dǎo)致其較難從氣-水表面進(jìn)入水中，難度約為氣相中的320 000倍［4］。當(dāng)土壤遭遇澇害脅迫時(shí)，土壤孔隙被水分填充，進(jìn)而阻礙空氣進(jìn)入，致使供給植物根系的氧氣大幅減少［5-6］。在低氧情況下，植物根系無法進(jìn)行有氧呼吸作用。作為臨時(shí)補(bǔ)救途徑，植物通過無氧呼吸作用來維持細(xì)胞活性，但是長(zhǎng)時(shí)間的無氧呼吸會(huì)影響植物生長(zhǎng)發(fā)育必須的能量供給、中間代謝物、養(yǎng)分吸收等，而且無氧呼吸產(chǎn)生的乙醇、乙醛等物質(zhì)也會(huì)對(duì)植物自身產(chǎn)生毒害作用［2］。另外，澇害脅迫致使植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的平衡遭到破壞，從而加速H2O2、超氧陰離子等活性氧的累積，影響植物的正常生長(zhǎng)［7］。澇害脅迫還會(huì)嚴(yán)重影響植物的光合作用，使葉片氣孔關(guān)閉且氣孔擴(kuò)散阻力增加、氣孔導(dǎo)度下降，進(jìn)一步導(dǎo)致CO2與O2擴(kuò)散交換受阻，光合作用下降；此外，澇害脅迫會(huì)破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，抑制光合色素合成，加速光合色素降解，降低光合產(chǎn)物的運(yùn)輸速率，從而影響植物能量的供應(yīng)。

鑒于此，本研究通過對(duì)甜瓜耐澇型材料L45 和澇敏感型材料L39 葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組測(cè)序，分析差異表達(dá)的基因和蛋白，以期挖掘甜瓜澇害脅迫響應(yīng)中的關(guān)鍵基因及通路，從而為耐澇甜瓜分子育種實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

2021年9—10月在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所的實(shí)驗(yàn)室和玻璃溫室進(jìn)行試驗(yàn)。供試材料為甜瓜（CucumismeloL.）品系L39 和L45，由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所西甜瓜研究室提供，其中L39 為澇敏感型材料，L45 為耐澇型材料［8］。選取籽粒飽滿的甜瓜種子放入55 ℃溫水中，迅速攪拌，水溫降至30 ℃左右時(shí)停止攪拌，浸泡4 h。洗凈種子表面黏液，瀝干水分，用濕毛巾包裹后，放入30 ℃恒溫設(shè)備中催芽，待80%以上種子露白即可播種。將萌發(fā)整齊一致的種子播于填裝有混合基質(zhì)（草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1，V/V）的塑料缽（7 cm×7 cm×7 cm）中，置玻璃溫室培養(yǎng)，常規(guī)栽培管理。選取三葉一心時(shí)期長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯植株，移入塑料盒（71 cm×45.5 cm×18 cm）中，進(jìn)行澇害脅迫處理，水位保持在高出基質(zhì)表面3 cm；對(duì)照不進(jìn)行澇害脅迫處理，即正常管理。澇害脅迫后5 d分別取兩個(gè)材料的處理組和對(duì)照組葉片樣品，2 次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)30株，樣品收集后迅速置于液氮中，存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱備用。正常管理的對(duì)照樣品分別命名為L(zhǎng)39-C1、L39-C2、L45-C1和L45-C2，澇害脅迫處理的樣品分別命名為L(zhǎng)39-W1、L39-W2、L45-W1和L45-W2。

1.2 RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

利用RNAprep pure Plant Kit植物總RNA提取試劑盒（天根，北京）提取RNA，DNase I （Sigma，美國）去除基因組DNA。利用Nanodrop 2000 超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher，美國）和Bioanalyzer 2100 生物分析儀（Agilent，德國）測(cè)定RNA的濃度和質(zhì)量，質(zhì)檢合格的樣品用于轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建。利用帶有Oligo （dT）的磁珠富集mRNA，然后加入打斷試劑使mRNA片段化，以其為模板反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，再加入dNTPs、DNA聚合酶、RNase H 與緩沖液以合成第二鏈cDNA；經(jīng)純化回收、粘性末端修復(fù)、3′末端加堿基A、連接接頭、片段大小的選擇后，使用NEBNEXT Ultra RNA Library Prep Kit文庫制備試劑盒（New England Biolabs，美國）進(jìn)行PCR擴(kuò)增；利用Agilent Bioanalyzer 2100生物分析儀檢測(cè)cDNA 文庫的質(zhì)量，質(zhì)檢合格的樣品利用Illumina HiSeqTM4000高通量測(cè)序平臺(tái)（Illumina，美國）進(jìn)行測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

從下機(jī)原始數(shù)據(jù)中去除含接頭的讀段、含未知堿基比例超過5%的讀段和低質(zhì)量讀段，將獲得的有效讀段通過HISAT2［9］映射到NCBI 甜瓜基因組（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Cucumis+melo）。利用StringTie 軟件［10］通過FPKM（reads per kilo bases per million mapped reads）衡量基因的表達(dá)量。使用DESeq2［11］鑒定差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），篩選條件設(shè)置為：錯(cuò)誤發(fā)生率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤0.05 且表達(dá)倍數(shù)差異在2 倍以上即|log2Ratio|≥1。使用Bioconductor 中的topGO［12］和KOBAS軟件［13］，以FDR≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)DEG進(jìn)行Gene Ontology（GO）富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）途徑富集分析。

1.4 蛋白質(zhì)提取與蛋白組測(cè)序

利用三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）/丙酮沉淀結(jié)合SDT 裂解法進(jìn)行蛋白提取，采用二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，然后各樣品取蛋白質(zhì)20 μg 分別加入6×上樣緩沖液，沸水浴5 min，進(jìn)行12% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，考馬斯亮藍(lán)染色。各樣品取80 μg蛋白質(zhì)溶液，分別加入二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）至終濃度為100 mmol·L-1，沸水浴5 min，冷卻至室溫。經(jīng)尿素緩沖液、碘乙酰胺緩沖液、NH4HCO3溶液、胰蛋白酶緩沖液后收集濾液，采用C18 Cartridge 對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽，肽段凍干后加入甲酸溶液復(fù)溶，OD280肽段定量。各樣品采用納升流速Easy nLC 系統(tǒng)（Thermo Fisher，美國）進(jìn)行分離，緩沖液A 液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為80%），樣品經(jīng)色譜分離后用 Q Exactive Plus 質(zhì)譜儀（Thermo Fisher，美國）進(jìn)行質(zhì)譜分析，原始數(shù)據(jù)利用數(shù)據(jù)依賴性采集（data-dependent acquisition，DDA）方式進(jìn)行采集。

1.5 蛋白組數(shù)據(jù)分析

利用MaxQuant 1.5.5.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，使用的數(shù)據(jù)庫為Uniprot-Cucumis_25421_20190812（http：//www.uniprot.org），通過肽段水平過濾（FDR≤0.01）獲得具有顯著性的譜圖和肽段列表，為了控制蛋白的假陽性率，在蛋白水平進(jìn)行過濾（FDR≤0.01），采用無標(biāo)記定量（label free quantitation，LFQ）算法進(jìn)行定量分析［14］，F(xiàn)DR≤0.05 且表達(dá)倍數(shù)差異在2 倍以上即|log2Ratio|≥1的為差異表達(dá)蛋白（differentially expressed proteins，DEPs）。以FDR≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)DEPs進(jìn)行GO富集分析和KEGG途徑富集分析。

1.6 生理指標(biāo)及測(cè)定方法

脫落酸、游離水楊酸、茉莉酸和α-亞麻酸含量采用高效液相色譜法測(cè)定。脫落酸的提取與測(cè)定參考Yang 等［15］的方法。游離水楊酸含量的測(cè)定參考Dong等［16］的方法。茉莉酸含量的測(cè)定參考Kristl 等［17］的方法。α-亞麻酸含量的測(cè)定參考楊會(huì)芳等［18］的方法。利用植物類黃酮含量檢測(cè)試劑盒（索萊寶，北京）提取甜瓜葉片中的類黃酮，測(cè)定樣本提取液在470 nm 處的吸光值，通過制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中類黃酮的含量（單位為mg·g-1FW）。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）驗(yàn)證

使用與轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建相同的RNA 樣品，第一鏈cDNA 用TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（全式金，北京）合成，每個(gè)樣品3次重復(fù)，甜瓜CmACT基因作為內(nèi)參基因［8］。PCR體系為20 μL：Top Green qPCR SuperMix（全式金，北京）10 μL、cDNA模板0.5 μL、10 μmol·L-1引物1 μL（表1）、ddH2O 8.5 μL。所用儀器為L(zhǎng)ightCycler?96（Roche，德國），程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性 300 s；95 ℃變性 10 s，58 ℃退火 10 s，72 ℃延伸10 s，共45個(gè)循環(huán)；95 ℃熔解 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s［8］。

表1 qRT-PCR所用引物Table 1 The primer sequences for qRT-PCR

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用SAS 9.1.3 軟件的ANOVA 程序進(jìn)行方差分析，采用最小顯著差異法進(jìn)行差異顯著性比較分析，顯著性水平為P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 澇害脅迫對(duì)內(nèi)源性物質(zhì)含量的影響

如圖1 所示，澇害脅迫處理后，澇敏感型材料L39中脫落酸含量顯著提高，為對(duì)照的2.72 倍，而耐澇型材料L45 中脫落酸含量無顯著變化；L39 和L45中游離水楊酸含量在澇害脅迫處理后都顯著提高，分別為對(duì)照的1.63和1.72倍；茉莉酸含量在澇害脅迫處理后也顯著提高，L39和L45中分別為對(duì)照的1.90和2.12倍。澇害脅迫后類黃酮顯著積累，L39和L45中類黃酮含量分別為對(duì)照的2.27 和2.47 倍；澇害脅迫后α-亞麻酸含量在耐澇型材料L45中顯著提高，為對(duì)照的2.24倍，而在L39中無顯著變化（圖2）。

圖1 澇害脅迫處理對(duì)甜瓜葉片激素含量的影響Fig.1 Effects of waterlogging stress on endogenous hormone contents of melon leaves

圖2 澇害脅迫處理對(duì)甜瓜葉片類黃酮和α-亞麻酸含量的影響Fig.2 Effects of waterlogging stress on flavonoid and α-linolenic acid contents of melon leaves

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序整體評(píng)估

利用高通量測(cè)序儀對(duì)8個(gè)樣品測(cè)序得到44 275 178～48 310 008 條原始讀段，再通過數(shù)據(jù)過濾處理得到38 287 494～43 584 000條有效讀段，有效堿基數(shù)為5.74～6.54 Gb，GC含量為43.50%～47.00%；與甜瓜參考基因組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)成功比對(duì)到25 254 777～33 659 962條有效讀段；堿基質(zhì)量值大于20 的比例為99.98%～99.99%，堿基質(zhì)量值大于30的比例為97.90%～98.08%，表明測(cè)序質(zhì)量較高（表2）。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Summary of RNA-seq data

2.3 差異表達(dá)基因鑒定

在L39-W vs L39-C 和L45-W vs L45-C 兩個(gè)比較組中分別鑒定差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），發(fā)現(xiàn)L39-W vs L39-C的差異表達(dá)基因數(shù)為3 532個(gè)，上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)分別為2 266和1 266個(gè)；L45-W vs L45-C 的差異表達(dá)基因數(shù)為1 842 個(gè)，上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)分別為1 280和562個(gè)（圖3）。

圖3 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Fig.3 Statistical histogram of differentially expressed genes （DEGs）

2.4 差異表達(dá)基因功能顯著性富集分析

差異表達(dá)基因GO功能顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，L39-W vs L39-C 和L45-W vs L45-C 分別有280 和177 個(gè)顯著富集的GO 條目，其中生物過程條目分別有139 和104 個(gè)。生物過程條目中，光合作用（GO：0015979）、肉桂酸生物合成過程（GO：0009800）、次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成過程（GO：0044550）、氧化還原過程（GO：0055114）、脫落酸激活信號(hào)通路（GO：0009738）、L-苯丙氨酸分解代謝過程（GO：0006559）、缺水反應(yīng)（GO：0009414）、吲哚硫甙代謝過程（GO：0042343）、苯丙素生物合成過程（GO：0009699）、脫落酸響應(yīng)（GO：0009737）等在L39-W vs L39-C 中顯著富集；乙烯激活信號(hào)通路（GO：0009873）、谷胱甘肽代謝過程（GO：0006749）、毒素分解代謝過程（GO：0009407）、茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)通路（GO：0009864）、乙烯響應(yīng)（GO：0009723）、吲哚硫甙代謝過程（GO：0042343）、水楊酸響應(yīng)（GO：0009751）、苯丙素生物合成過程（GO：0009699）、葉片衰老負(fù)調(diào)控（GO：1900056）、水楊酸介導(dǎo)的信號(hào)通路（GO：0009862）等在L45-W vs L45-C 中顯著富集。

差異表達(dá)基因KEGG 功能顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，L39-W vs L39-C和L45-W vs L45-C分別有35和11個(gè)顯著富集的KEGG途徑，乙醛酸和二羧酸代謝（ko00630）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（ko00280）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（ko00260）、苯丙素生物合成（ko00940）、酮類的合成與降解（ko00072）、半萜類和三萜類生物合成（ko00909）、脂肪酸降解（ko00071）、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（ko00250）等代謝途徑在L39-W vs L39-C 中顯著富集（圖4）；植物-病原菌互作（ko04626）、黃酮和黃酮醇生物合成（ko00944）、α-亞麻酸代謝（ko00592）、亞油酸代謝（ko00591）等代謝途徑在L45-W vs L45-C中顯著富集（圖5）；此外，光合作用（ko00195）、類胡蘿卜素生物合成（ko00906）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路（ko04016）、異黃酮生物合成（ko00943）在L39-W vs L39-C和L45-W vs L45-C中都顯著富集。

圖4 L39-W vs L39-C差異表達(dá)基因的KEGG富集分析Fig.4 Significant enrichment analysis of KEGG pathway for DEGs of L39-W vs L39-C

圖5 L45-W vs L45-C差異表達(dá)基因的KEGG富集分析Fig.5 Significant enrichment analysis of KEGG pathway for DEGs of L45-W vs L45-C

2.5 蛋白組測(cè)序整體評(píng)估

本研究共鑒定得到22 765條肽段，3 259個(gè)蛋白。對(duì)鑒定到的肽段序列長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)肽段分布在5～20 aa，占所有肽段的86.94%（圖6-A）。對(duì)所有鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量主要為10～60 kDa，占總蛋白的75.97%。分子質(zhì)量為0～10 kDa 和60～100 kDa的蛋白分別占總蛋白的1.38%和16.48%，大于100 kDa的蛋白約占總蛋白6.17%（圖6-B）。

圖6 肽段與蛋白質(zhì)統(tǒng)計(jì)Fig.6 Statistical histogram of peptide and protein

2.6 差異表達(dá)蛋白鑒定

在L39-W vs L39-C 和L45-W vs L45-C 兩個(gè)比較組中分別鑒定差異表達(dá)蛋白（differentially expressed proteins，DEPs），發(fā)現(xiàn)L39-W vs L39-C 的差異表達(dá)蛋白數(shù)為105 個(gè)，上調(diào)和下調(diào)蛋白數(shù)分別為73 和32 個(gè)；L45-W vs L45-C的差異表達(dá)蛋白數(shù)為38個(gè)，上調(diào)和下調(diào)蛋白數(shù)分別為21和17個(gè)（圖7）。

圖7 差異表達(dá)蛋白統(tǒng)計(jì)Fig.7 Statistical histogram of differentially expressed proteins （DEPs）

2.7 差異表達(dá)蛋白功能顯著性富集分析

差異表達(dá)蛋白GO功能顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，L39-W vs L39-C 和L45-W vs L45-C 分別有82和53個(gè)顯著富集的GO條目，其中生物過程條目分別有39和25個(gè)。生物過程條目中，氧化還原過程（GO：0055114）、過氧化氫分解代謝過程（GO：0042744）、氧化應(yīng)激響應(yīng)（GO：0006979）、甘氨酸代謝過程（GO：0006544）、L-絲氨酸代謝過程（GO：0006563）、蘇氨酸代謝過程（GO：0006566）、類固醇生物合成過程（GO：0006694）、滲透脅迫響應(yīng)（GO：0006970）、香豆素生物合成過程（GO：0009805）、脂肪酸β 氧化（GO：0006635）等在L39-W vs L39-C 中顯著富集；腈代謝過程（GO：0050898）、苯丙素生物合成過程（GO：0009699）、花青素3-O-葡萄糖苷生物合成過程（GO：0033485）、飛燕草色素3-O-葡萄糖苷生物合成過程（GO：0033486）、色素沉積（GO：0043473）、蛋白谷胱甘肽化（GO：0010731）、韌皮部蔗糖裝載（GO：0009915）、D-絲氨酸代謝過程（GO：0070178）、類黃酮生物合成過程（GO：0009813）、脅迫應(yīng)答（GO：0006950）等在L45-W vs L45-C中顯著富集。

差異表達(dá)蛋白KEGG 功能顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，L39-W vs L39-C和L45-W vs L45-C分別有16和13個(gè)顯著富集的KEGG途徑。苯丙素類生物合成（ko00940）、托烷、哌啶和吡啶生物堿生物合成（ko00960）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工（ko04141）、脂肪酸降解（ko00071）、卟啉與葉綠素代謝（ko00860）、酪氨酸代謝（ko00350）等在L39-W vs L39-C 中顯著富集（圖8）；α-亞麻酸代謝（ko00592）、黃曲霉毒素生物合成（ko00254）、氰基氨基酸代謝（ko00460）、細(xì)胞色素P450 對(duì)有害異物的代謝（ko00980）、鉑類耐藥性（ko01524）等在L45-W vs L45-C中顯著富集（圖9）；此外，次生代謝物生物合成（ko01110）和類黃酮生物合成（ko00941）在L39-W vs L39-C 和L45-W vs L45-C中都顯著富集。

圖8 L39-W vs L39-C差異表達(dá)蛋白的KEGG富集分析Fig.8 Significant enrichment analysis of KEGG pathway for DEPs of L39-W vs L39-C

圖9 L45-W vs L45-C差異表達(dá)蛋白的KEGG富集分析Fig.9 Significant enrichment analysis of KEGG pathway for DEPs of L45-W vs L45-C

2.8 轉(zhuǎn)錄組與蛋白組聯(lián)合分析

將轉(zhuǎn)錄組與蛋白組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，L39-W vs L39-C比較組中有38個(gè)基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平上聯(lián)合上調(diào)表達(dá)，12 個(gè)基因聯(lián)合下調(diào)表達(dá)（電子附表1）；L45-W vs L45-C 比較組中有7個(gè)基因在mRNA 和蛋白質(zhì)水平上聯(lián)合上調(diào)表達(dá)，3個(gè)基因聯(lián)合下調(diào)表達(dá)（電子附表2）。L39-W vs L39-C 比較組中聯(lián)合上調(diào)表達(dá)的基因顯著富集在脂肪酸降解（ko00071）、類黃酮生物合成（ko00941）、苯丙烷生物合成（ko00940）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成（ko00290）、二苯乙烯類、二芳庚烷類和姜酚生物合成（ko00945）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（ko04141）、苯丙氨酸代謝（ko00360）、精氨酸和脯氨酸代謝（ko00330）KEGG 途徑中，而L45-W vs L45-C比較組中聯(lián)合上調(diào)表達(dá)的基因顯著富集在α-亞麻酸代謝（ko00592）、苯丙烷生物合成（ko00940）、二苯乙烯類、二芳庚烷類和姜酚生物合成（ko00945）、亞油酸代謝（ko00591）和類黃酮生物合成（ko00941）KEGG 途徑中；對(duì)聯(lián)合下調(diào)表達(dá)的基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，卟啉與葉綠素代謝（ko00860）和葉酸合成（ko00790）在L39-W vs L39-C 中顯著富集，MAPK 信號(hào)通路（ko04016）在L45-W vs L45-C中顯著富集（表3）。

表3 轉(zhuǎn)錄組與蛋白組聯(lián)合表達(dá)基因KEGG富集分析Table 3 Significant enrichment analysis of KEGG pathway for jointly expressed genes between transcriptome and proteome

電子附表1 L39-W vs L39-C聯(lián)合表達(dá)基因Electronic Table S1 Jointly expressed genes between transcriptome and proteome of L39-W vs L39-C

2.9 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

利用qRT-PCR 方法檢測(cè)了參與類黃酮生物合成、苯丙烷生物合成、α-亞麻酸代謝、脫落酸響應(yīng)、水楊酸生物合成等15 個(gè)差異表達(dá)基因（表1）的相對(duì)表達(dá)水平，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。如圖10 所示，qRT-PCR 與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果基本一致，相關(guān)性分析結(jié)果顯示二者的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.983 2，表明本研究中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性較高。

圖10 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.10 qRT-PCR confirmation of differentially expressed genes

3 討論

澇害脅迫是世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)遭遇最為頻繁的非生物脅迫之一，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。為了探明甜瓜響應(yīng)澇害脅迫的分子機(jī)制，本研究利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白組測(cè)序?qū)μ鸸夏蜐承筒牧螸45 和澇敏感型材料L39在正常培養(yǎng)和澇害脅迫處理?xiàng)l件下進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)L39-W vs L39-C的差異表達(dá)基因數(shù)為3 532個(gè)（圖3），差異表達(dá)蛋白數(shù)為105 個(gè)（圖7），而L45-W vs L45-C的差異表達(dá)基因數(shù)為1 842 個(gè)（圖3），差異表達(dá)蛋白數(shù)為38 個(gè)（圖7）。與耐澇型材料L45 相比，澇敏感型材料L39在澇害脅迫處理后的差異表達(dá)基因和差異表達(dá)蛋白數(shù)目更多，這與黃瓜［19-20］、野豇豆［21］、紫花苜蓿［22］等植物的研究結(jié)果相類似，表明澇敏感型材料遭遇澇害脅迫后轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的變化更大。

植物激素作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)抗各種生物和非生物脅迫中都發(fā)揮著重要作用。據(jù)報(bào)道，脫落酸、水楊酸、茉莉酸、乙烯等激素參與了植物澇害脅迫響應(yīng)［3，23］。本研究中轉(zhuǎn)錄組結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)KEGG 途徑在L39-W vs L39-C 和L45-W vs L45-C 中都顯著富集（圖4、5）。脫落酸不僅可以調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉，還可以影響與應(yīng)激反應(yīng)和代謝變化有關(guān)的基因表達(dá)，在植物逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用［24］。Wang 等［25］發(fā)現(xiàn)在芝麻中，10 個(gè)脫落酸途徑基因?qū)澈γ{迫有響應(yīng)。澇害脅迫處理后葡萄葉片中脫落酸生物合成相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)［26］。本研究中，差異表達(dá)基因GO 功能顯著性富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)脫落酸激活信號(hào)通路、脫落酸響應(yīng)和缺水反應(yīng)在L39-W vs L39-C 中顯著富集；此外，澇害脅迫處理后，澇敏感型材料L39 中脫落酸含量顯著提高，而耐澇型材料L45中無顯著變化（圖1），推測(cè)脫落酸的澇害脅迫響應(yīng)可能在澇敏感型甜瓜材料中更為突出。水楊酸在提高植物抗逆性方面具有巨大潛力，它可以減輕干旱、低溫、高溫、鹽脅迫等非生物脅迫的不利影響［16，27-29］。Koramutla 等［30］報(bào)道水楊酸在澇害脅迫下可以促進(jìn)小麥形成不定根以增強(qiáng)澇害適應(yīng)能力。葡萄中參與水楊酸生物合成相關(guān)基因在澇害脅迫后誘導(dǎo)表達(dá)［26］。本研究發(fā)現(xiàn)澇害脅迫處理后，澇敏感型材料L39 和耐澇型材料L45中水楊酸含量都顯著提高（圖1），推測(cè)水楊酸在甜瓜響應(yīng)澇害脅迫中發(fā)揮重要作用。茉莉酸在介導(dǎo)或協(xié)調(diào)植物的應(yīng)激反應(yīng)中具有關(guān)鍵功能［31-32］。茉莉酸途徑相關(guān)基因已被證實(shí)參與澇害脅迫響應(yīng)［25-26］。相類似地，本研究中轉(zhuǎn)錄組與蛋白組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，L39中參與茉莉酸生物合成的基因LOC103497841和LOC103497860在澇害脅迫后顯著上調(diào)表達(dá)，L45中參與茉莉酸生物合成的基因LOC103485373和LOC107991008在澇害脅迫后顯著上調(diào)表達(dá)（電子附表1、2），此外，澇害脅迫處理后，澇敏感型材料L39和耐澇型材料L45中茉莉酸含量都顯著提高（圖1），表明茉莉酸在甜瓜澇害脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。以上響應(yīng)澇害脅迫的激素可能有助于提高甜瓜的耐澇性，需要進(jìn)一步深入研究。

來源于苯丙烷途徑的類黃酮物質(zhì)是一類重要的防御性抗氧化劑，具有自由基清除活性和抗氧化活性［33］。Wang等［34］發(fā)現(xiàn)澇害脅迫可以顯著提高菊花查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）、黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、黃烷酮4-還原酶（flavanone 4-reductase，DFR）和花色素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平，類黃酮含量顯著提高。Li等［35］報(bào)道澇害脅迫使類黃酮生物合成相關(guān)基因在楓楊葉片中顯著上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)澇害脅迫處理后，澇敏感型材料L39 和耐澇型材料L45 中類黃酮含量都顯著提高（圖2），此外，轉(zhuǎn)錄組與蛋白組聯(lián)合分析中，類黃酮生物合成途徑在L39-W vs L39-C 和L45-W vs L45-C 比較組的聯(lián)合上調(diào)表達(dá)的基因中都顯著富集（表3），暗示類黃酮在響應(yīng)澇害脅迫中的重要作用，可能作為抗氧化劑來減輕澇害脅迫造成的ROS 損傷。Zeng 等［22］在紫花苜蓿中發(fā)現(xiàn)澇害脅迫處理使苯丙烷生物合成途徑在耐澇品種和澇敏感品種中都顯著富集。本研究也有類似結(jié)果，轉(zhuǎn)錄組與蛋白組聯(lián)合分析中發(fā)現(xiàn)苯丙烷生物合成途徑在耐澇型材料L45和澇敏感型材料L39比較組的聯(lián)合上調(diào)表達(dá)的基因中都顯著富集（表3），推測(cè)苯丙烷途徑在植物響應(yīng)澇害脅迫中可能發(fā)揮重要作用。從膜脂質(zhì)中釋放α-亞麻酸對(duì)植物響應(yīng)非生物脅迫非常重要［36］。澇害脅迫后，楓楊葉片中α-亞麻酸代謝途徑顯著上調(diào)［35］。Qiao 等［37］發(fā)現(xiàn)鴨茅遭遇澇害脅迫后葉片中參與α-亞麻酸代謝途徑的基因表達(dá)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)澇害脅迫處理后，耐澇型材料L45 中α-亞麻酸含量顯著提高，而澇敏感型材料L39 無顯著變化（圖2），此外，轉(zhuǎn)錄組與蛋白組聯(lián)合分析中，α-亞麻酸代謝途徑僅在L45-W vs L45-C比較組的聯(lián)合上調(diào)表達(dá)的基因中顯著富集（表3），推測(cè)甜瓜可能通過調(diào)控α-亞麻酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)來增強(qiáng)膜脂質(zhì)的不飽和性，從而提高對(duì)澇害脅迫的耐受性。下一步將結(jié)合基因功能研究方法對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，以期深入解析甜瓜響應(yīng)澇害脅迫的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)方法探討了甜瓜耐澇型材料L45 和澇敏感型材料L39 在正常培養(yǎng)和澇害脅迫處理?xiàng)l件下的差異表達(dá)基因和蛋白，發(fā)現(xiàn)L45-W vs L45-C 中鑒定到1 842 個(gè)差異表達(dá)基因和38 個(gè)差異表達(dá)蛋白，而L39-W vs L39-C 中鑒定到3 532 個(gè)差異表達(dá)基因和105 個(gè)差異表達(dá)蛋白。差異表達(dá)基因富集分析與內(nèi)源激素含量表明脫落酸、水楊酸和茉莉酸參與甜瓜澇害脅迫響應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，類黃酮和苯丙烷生物合成途徑在甜瓜響應(yīng)澇害脅迫中發(fā)揮重要作用。此外，α-亞麻酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)可能有助于提高甜瓜耐澇性。