不同葡萄品種灰霉病抗性鑒定及褪黑素抗病機(jī)理初探

王憲璞 代瑛姿 郭宏揚(yáng) 楊志峰 許麗麗

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003）

葡萄（VitisViniferaL.）是世界四大水果之一，也是重要的經(jīng)濟(jì)作物，栽培面積和產(chǎn)量逐年遞增，截至2022 年，我國(guó)葡萄栽培面積位居世界第三［1］。隨著栽培面積的不斷擴(kuò)大，葡萄病害日益嚴(yán)重，其中灰霉病是嚴(yán)重危害我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)的主要病害之一，病原菌可侵染葡萄全株，造成大量減產(chǎn)，嚴(yán)重威脅果農(nóng)收益［2］。

葡萄種質(zhì)資源大致可分為東亞種群、美洲種群、歐洲種群和特殊類型的圓葉種群［3］，其中東亞種群灰霉病抗性較強(qiáng)，尤其以中國(guó)野生葡萄種質(zhì)資源抗性最高［4］，其次是美洲種群和圓葉種群，歐洲種群抗性最低，歐亞雜交種抗性居于歐洲種群與美洲種群之間。Gabler 等［5］對(duì)102 個(gè)葡萄品種果實(shí)接種灰霉病病原菌（Botrytiscinerea）后發(fā)現(xiàn)，僅11 個(gè)品種對(duì)灰霉菌表現(xiàn)為高抗，除皇帝和秋黑表現(xiàn)中等抗性外，其余歐洲葡萄品種均易感病。任志華等［6］對(duì)31 個(gè)葡萄品種葉片進(jìn)行灰霉病抗性鑒定，其中歐亞種左優(yōu)紅等抗性較強(qiáng)，歐洲品種無(wú)核白雞心等抗性較差。Rahman 等［7］接種了81 個(gè)葡萄品種葉片，發(fā)現(xiàn)雷司令和黑比諾表現(xiàn)高感，火焰無(wú)核表現(xiàn)感病，刺葡萄紫秋和巨玫瑰表現(xiàn)高抗。

目前，葡萄灰霉病防治多以化學(xué)手段為主，如噴施殺菌劑咯菌腈、唑醚·氟酰胺和寡雄腐霉等，具有操作簡(jiǎn)便和高效經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。然而，長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑嚴(yán)重威脅著果園生態(tài)環(huán)境和食品安全，隨著病原菌發(fā)生耐藥性變異，殺菌劑濫用問(wèn)題也日益嚴(yán)峻。近年來(lái)有研究表明，果實(shí)內(nèi)源次生代謝活性物質(zhì)（如苯丙素、白藜蘆醇和木質(zhì)素）可以激活植物防御信號(hào)通路，抵抗病原菌侵染，但其防治效果受多方面因素影響，目前仍處于研究利用的初期階段［8］。褪黑素（melatonin，MT）于1958 年在牛松果腺中被發(fā)現(xiàn)，又名美拉酮寧、抑黑素、松果腺素，化學(xué)名稱為N-乙酰基-5-甲氧基色胺（N-acetyl-5-methoxytryptamine）［9］。近年來(lái)，MT 在生物脅迫中的作用受到廣泛關(guān)注。例如用不同濃度MT灌溉蘋(píng)果根系，提高了其抗褐斑病能力［10］；MT 處理誘導(dǎo)了擬南芥（煙草）致病相關(guān)基因的表達(dá)，暗示了MT是植物體防御病原體的信號(hào)分子［11-13］。此外，MT能誘導(dǎo)依賴水楊酸（salicylic acid，SA）和乙烯的相關(guān)基因的表達(dá)［14］，通過(guò)茉莉酸（jasmonic acid，JA）、乙烯和一氧化氮信號(hào)途徑，協(xié)調(diào)合作抵抗病原菌［15-16］。但目前，有關(guān)MT 調(diào)控葡萄灰霉病抗性的研究報(bào)道較少，關(guān)鍵抗性機(jī)理尚不明確。

因此，本研究以10 個(gè)新疆主栽葡萄品種為試材，分別在果實(shí)及葉片中接種葡萄灰霉病病原菌Botrytis cinerea，通過(guò)病情嚴(yán)重度與綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)其灰霉病抗性；通過(guò)施用外源褪黑素研究總酚等次生代謝物在褪黑素誘導(dǎo)葡萄果實(shí)抗灰霉病中的作用。研究旨在揭示褪黑素提高葡萄對(duì)灰霉病菌抗性的生理機(jī)制，從而為褪黑素提高葡萄抗灰霉病的田間應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐，也為發(fā)掘、利用優(yōu)質(zhì)抗病種質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

灰葡萄孢菌株為西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院惠贈(zèng)。供試材料取自新疆主栽葡萄品種。參試葉片來(lái)自兩年生盆栽葡萄扦插苗，待植株具20 片功能葉時(shí)噴施孢子懸浮液。參試果實(shí)取自5 年生露地籬架式葡萄，待果實(shí)完全成熟后噴施孢子懸浮液。參試葡萄品種及其遺傳背景見(jiàn)表1。

表1 參試葡萄品種信息表Table 1 Information of grape variety tested

1.2 材料處理

將活化的B.cinerea接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)皿中，22 ℃恒溫暗培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基，無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾后收集孢子懸浮液，室溫儲(chǔ)藏（當(dāng)天使用）。將孢子懸浮液均勻噴施在參試葡萄葉片上，直至葉片表面見(jiàn)水珠滴下，每個(gè)品種設(shè)置10 株重復(fù)；對(duì)照為相同體積無(wú)菌水，處理方式同上。每隔5 d處理一次，15 d后采集葉片樣品進(jìn)行抗性理化指標(biāo)測(cè)定。

采集距新梢頂端性狀一致、長(zhǎng)勢(shì)良好且無(wú)病蟲(chóng)害的3～5 片葉，無(wú)菌水沖洗后吸干多余水分，使用經(jīng)B.cinerea孢子懸浮液濕潤(rùn)的脫脂棉處理葉片陽(yáng)面。各參試品種試驗(yàn)組及對(duì)照組均隨機(jī)選取2片性狀一致的葉片，每2 d處理一次，采用十字交叉法測(cè)量病斑直徑并計(jì)算病斑面積大小。每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

隨機(jī)采集成熟期葡萄果穗進(jìn)行室內(nèi)離體侵染試驗(yàn)，處理方式同上。每個(gè)品種設(shè)置10穗重復(fù)。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 葉片指標(biāo)測(cè)定 目視法觀察葉片絨毛覆蓋率；YMJ-A型葉面積儀（山東恒美電子科技有限公司）測(cè)定葉片葉面積；480-505D型數(shù)顯外徑千分尺（桂林量具刃具有限責(zé)任公司）測(cè)量葉片厚度；稱重法計(jì)算葉片相對(duì)含水量：樣品相對(duì)含水量=（鮮重-干重）/鮮重×100%；HM-YA型葉綠素測(cè)定儀（山東恒美電子科技有限公司）測(cè)定葉片葉綠素含量；蠟質(zhì)含量測(cè)定參考Jetter 等［17］的方法；葉片電導(dǎo)率測(cè)定參照趙世杰等［18］的方法；丙二醛含量測(cè)定采用試劑盒法（索萊寶，北京）。

1.3.2 果實(shí)指標(biāo)測(cè)定 DS-303P型電子天平（廈門(mén)金河源科技有限公司）測(cè)量葡萄果實(shí)單果重；AK002B 型手持式糖度儀（深圳測(cè)友科技有限公司）測(cè)定可溶性固形物（total soluble solid，TSS）含量；LX-A 型水果硬度計(jì)（溫州韋度量具儀器有限公司）測(cè)定果實(shí)硬度；果實(shí)果膠含量測(cè)定參考馬麗等［19］的方法；總酚含量和活性氧清除酶類活性測(cè)定采用試劑盒法（索萊寶，北京）。

1.3.3 基因表達(dá)水平鑒定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）鑒定基因表達(dá)水平。使用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit 試劑盒（RC401，諾唯贊，南京）提取葡萄總RNA；使用HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR（R323，諾唯贊，南京）合成cDNA 第一鏈；利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性定量引物，以β-Actin作為內(nèi)參基因；數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法。qRT-PCR引物序列見(jiàn)表2。

表2 抗氧化酶基因引物序列Table2 Primers of the related genes of antioxidants enzymes

1.3.4 灰霉病抗性綜合評(píng)價(jià) 利用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)的方法，采用公式（1）進(jìn)行原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化［20］，使用SPSS 27.0 軟件進(jìn)行因子分析；采用公式（2）計(jì)算各綜合指標(biāo)的權(quán)重；采用公式（3）計(jì)算各葡萄品種綜合抗病能力得分：

Uij表示i品種j指標(biāo)的灰霉病抗性隸屬函數(shù)值，Xij表示i品種j指標(biāo)的綜合系數(shù)，Xjmax表示所有品種中j指標(biāo)的最大值，Xjmin表示所有品種中j指標(biāo)的最小值，i表示某個(gè)葡萄品種，j表示某個(gè)抗性指標(biāo)［21］。

Wj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度，Pj為各品種第j個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

D為各品種灰霉病抗性綜合評(píng)價(jià)值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

參考Tantasawat 等［22］的方法，利用公式（4）計(jì)算病情嚴(yán)重度（disease severity，DS）：

依據(jù)DS 水平設(shè)定葡萄灰霉病抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：DS=0 代表免疫；0＜DS≤5%代表高抗類型（high resistance，HR）；5%＜DS≤15%代表抗病類型（resistance，R）；15%＜DS≤45%代表中抗類型（moderate resistance，MR）；45%＜DS≤75%代表感病類型（susceptible，S）；75%＜DS 代表高感類型（high susceptible，HS）。

設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。利用SPSS 24.0 進(jìn)行相關(guān)性分析、隸屬函數(shù)分析和單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），顯著性水平為0.05，使用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡萄品種葉片與果實(shí)性狀指標(biāo)測(cè)定

10 個(gè)葡萄品種基本性狀測(cè)定結(jié)果表明，除巨峰、葡之夢(mèng)和陽(yáng)光玫瑰葉片有絨毛之外，其他均無(wú)絨毛覆蓋；參試葡萄品種葉片面積為51.00～116.87 cm2，其中黃金蜜葉面積最大，巨盛一號(hào)最??；葉片相對(duì)含水量、蠟質(zhì)含量及葉綠素含量分別為66.97%～71.73%、1.31～2.32 mg·g-1和1.00～2.46 mg·g-1，其中葉片含水量種間差異不顯著，巨峰葡萄葉片蠟質(zhì)含量顯著高于黃金蜜，為2.32 mg·g-1，黃金蜜葡萄葉片蠟質(zhì)與葉綠素含量均低于其他品種；果實(shí)單果重種間差異較大，其中巨盛一號(hào)、巨峰、美人指葡萄單果重達(dá)12.13、11.76和11.40 g，顯著高于其他品種；巨峰葡萄果實(shí)可溶性固形物、硬度與果膠含量低于其他品種，為16.81%、3.17 kg·cm-1和0.57 mg·g-1（表3）。

表3 不同葡萄品種葉片與果實(shí)基本性狀Table 3 Trait index of leaves and fruits in different grape cultivars

2.2 不同葡萄品種灰霉病抗性水平鑒定

接種B.Cinerea10 d 后，多數(shù)參試品種果實(shí)和葉片均發(fā)生不同程度褐變，抗性水平差異顯著（表4、5）。巨峰和巨盛一號(hào)葡萄病情嚴(yán)重度均未達(dá)15%，接種10 d 后，果實(shí)病情嚴(yán)重度分別為12.68%和8.94%，葉片病情嚴(yán)重度分別為6.00%和12.00%，均屬抗病類型；黃金蜜、葡之夢(mèng)、夏黑、美人指、維多利亞接種后表現(xiàn)較穩(wěn)定，第10 天果實(shí)病情嚴(yán)重度分別為31.12%、32.16%、24.80%、34.37%、32.71%，葉片病情嚴(yán)重度分別為30.00%、14.00%、25.33%、24.00%、25.33%，除葡之夢(mèng)葉片表現(xiàn)為抗病類型外其他均表現(xiàn)為中抗類型；陽(yáng)光玫瑰、克瑞森和藍(lán)寶石在灰霉菌孢子懸浮液處理10 d 后，除藍(lán)寶石果實(shí)病情嚴(yán)重度為36.17%，表現(xiàn)為中抗類型外，其葉片和其他品種的果實(shí)、葉片的病情嚴(yán)重度均大于50%，表現(xiàn)為感病類型。

表5 不同品種葡萄果實(shí)灰霉病抗性類型Table 5 Resistance classification of different grape varieties to Botrytis cinerea

2.3 不同葡萄品種灰霉病抗性綜合評(píng)價(jià)

為探究不同葡萄品種葉片和果實(shí)基本性狀及接種10 d 后病情嚴(yán)重度（采用數(shù)值的相反數(shù)表示抗性）之間的相關(guān)性，采用隸屬函數(shù)對(duì)參試葡萄品種綜合抗性賦分，綜合評(píng)價(jià)其灰霉病抗性。對(duì)不同葡萄品種12個(gè)相互關(guān)聯(lián)的單項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析和變量因子分析，結(jié)果表明，葉片面積與葉片蠟質(zhì)含量和單果重顯著負(fù)相關(guān)；葉片絨毛覆蓋率與蠟質(zhì)含量顯著正相關(guān)，與葡萄果實(shí)果膠含量顯著負(fù)相關(guān)；葉片厚度與蠟質(zhì)含量及葉綠素含量顯著正相關(guān)；葉片蠟質(zhì)含量與葉綠素含量呈顯著正相關(guān)，而與果膠含量顯著負(fù)相關(guān)；葉片病情嚴(yán)重度負(fù)數(shù)與果實(shí)病情嚴(yán)重度負(fù)數(shù)顯著正相關(guān)（表6）。前4 個(gè)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的累計(jì)貢獻(xiàn)率高達(dá)87.895%，綜合指標(biāo)貢獻(xiàn)率分別為48.326%、16.989%、12.834%和9.746%（表7）；計(jì)算各葡萄品種綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值、權(quán)重及綜合得分，其中巨峰的D值最大，而白色葡萄黃金蜜與紅色葡萄克瑞森的D值僅為0.10 和0.14，說(shuō)明兩者綜合抗性最弱（表8）。

表6 不同葡萄品種各個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of various indicators of different grape varieties

表7 不同葡萄品種主要指標(biāo)特征值、貢獻(xiàn)率及綜合權(quán)重分析Table 7 Analysis of characteristic value，contribution rate and comprehensive weight of main indexes of different grape varieties

表8 不同葡萄品種的綜合系數(shù)、隸屬函數(shù)值、D值Table 8 Comprehensive index，membership funcition value，D value of different grape varieties

2.4 B.cinerea侵染對(duì)不同葡萄品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

由以上隸屬函數(shù)分析可知，10個(gè)葡萄品種主要指標(biāo)特征值均為葉片的性狀指標(biāo)，因此測(cè)定B.cinerea侵染前后葡萄葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化可為進(jìn)一步反映B.cinerea對(duì)葡萄生理功能的影響。由圖1-A可知，B.cinerea未侵染葉片時(shí)，所有葡萄品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率最高為0.78，最低為0.70，B.cinerea侵染葉片后，不同抗性品種的葉片相對(duì)電導(dǎo)率均出現(xiàn)了不同程度的增長(zhǎng)，其中維多利亞葡萄葉片相對(duì)電導(dǎo)率增加了16.21%，差異達(dá)極顯著水平，陽(yáng)光玫瑰、葡之夢(mèng)、克瑞森差異達(dá)顯著水平，其他參試品種差異不顯著。B.cinerea侵染葡萄葉片，造成所有葡萄品種葉片中超氧陰離子產(chǎn)生速率程現(xiàn)不同程度的增加（圖1-B）。僅葡之夢(mèng)、陽(yáng)光玫瑰、克瑞森和藍(lán)寶石在灰葡萄孢侵染后表現(xiàn)出與對(duì)照組相比差異極顯著，其葉片中產(chǎn)生速率分別為30.43、34.47、34.48和33.82 nmol·min-1·g-1，而巨峰葡萄葉片中產(chǎn)生速率無(wú)顯著差異。同樣在B.cinerea侵染葡萄葉片后，所有葡萄品種葉片中丙二醛含量均增加，其中，陽(yáng)光玫瑰和克瑞森葡萄葉片丙二醛含量分別增加了146.09%和172.45%，而巨峰、夏黑和維多利亞葡萄葉片丙二醛含量分別增加了22.28%、22.24%和30.02%，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，其余參試品種與對(duì)照組相比，葉片丙二醛含量差異均達(dá)極顯著水平（圖1-C）。

圖1 不同品種葡萄品種葉片電導(dǎo)率等含量測(cè)定Fig.1 Determination of electrical conductivity and other contents in grape leaves of different varieties

B.cinerea未侵染葡萄葉片時(shí)，巨峰葡萄葉片中游離脯氨酸含量為49.77 μg·g-1，在所有品種葉片中含量最高，且在B.cinerea侵染后，其含量增加至57.28 μg·g-1，同樣高于其他品種。除維多利亞葡萄葉片中游離脯氨酸含量侵染前后無(wú)顯著差異外，其他所有品種葉片均有顯著或極顯著性差異（圖1-D）。

2.5 外源MT 對(duì)巨峰和克瑞森葡萄B.cinerea 抗性的影響

為了探索B.cinerea感染后，巨峰和克瑞森葡萄果實(shí)多酚等氧化物質(zhì)代謝的變化及外源MT 抵御B.cinerea侵染的作用，測(cè)定了葡萄總酚含量、總抗氧化能力、苯丙氨酸淀粉酶和多酚氧化酶活性（表9）。結(jié)果表明，接種B.cinerea10 d 后，巨峰和克瑞森葡萄果實(shí)4 項(xiàng)指標(biāo)分別降低了60.27%、47.20%、54.00%、62.43%和15.83%、51.24%、17.04%、48.94%，且指標(biāo)水平在接種B.cinerea前后差異顯著。

表9 葡萄果實(shí)總酚含量、總抗氧化能力、多酚氧化酶、苯丙氨酸解胺酶活性測(cè)定Table 9 Content of total phenols，total antioxidant capacity，phenylalanine amylase and polyphenol oxidase activity in grapes

與B.cinerea侵染10 d 的果實(shí)相比，外源MT 總體上提高了B.cinerea侵染10天后果實(shí)的總抗氧化能力、苯丙氨酸淀粉酶和多酚氧化酶活性。與對(duì)照相比，MT緩解了B.cinerea對(duì)果實(shí)的傷害，巨峰葡萄果實(shí)總酚、總抗氧化能力、苯丙氨酸淀粉酶活性分別增加了11.11%、23.73%和39.39%，呈顯著差異，克瑞森果實(shí)經(jīng)MT 處理后，總酚、多酚氧化酶、苯丙氨酸淀粉酶活性分別增加了195.32%、89.03%和34.55%（表9）。

2.6 外源MT對(duì)B.cinerea侵染后葡萄果實(shí)VvCu/Zn-SOD1a等基因表達(dá)量的影響

為進(jìn)一步探究外源MT 對(duì)受B.cinerea侵染果實(shí)活性氧清除相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)并分別檢測(cè)了B.cinerea處理0 d、10 d 及MT+B.cinerea處理10 d 后果實(shí)VvCu/Zn-SOD1a等基因的表達(dá)水平。

巨峰和克瑞森葡萄在受B.cinerea侵染10 d后，果實(shí)VvCu/Zn-SOD1a等基因表達(dá)量均顯著或極顯著降低，而在外源MT+B.cinerea處理后，所有基因表達(dá)水平又有所升高（圖2）。其中B.cinerea處理10 d后，巨峰和克瑞森葡萄果實(shí)中VvCu/Zn-SOD1a基因表達(dá)量下降幅度最大，分別降低96.86%和97.02%；B.cinerea浸染的巨峰和克瑞森葡萄果實(shí)經(jīng)外源MT 處理后，VvCu/Zn-SOD1a基因表達(dá)量顯著上調(diào)，分別升高了378.85%和1 383.60%，與B.cinerea處理差異顯著。B.cinerea處理10 d后，兩個(gè)葡萄果實(shí)中VvPPO和VvPAL1的表達(dá)量分別降低81.75%、68.45%和83.28%、94.58%，MT+B.cinerea處理下VvPAL1基因表達(dá)量較前處理差異顯著，分別升高134.83%和82.22%。葡萄花青素合成通路中關(guān)鍵酶合成基因VvCHS3基因表達(dá)量下降幅度最小，在兩個(gè)葡萄品種中分別降低26.59%和59.18%，添加MT 后其表達(dá)量又分別升高12.65%和46.39%，除巨峰果實(shí)中VvCHS3 和VvPPO在B.cinerea浸染下后經(jīng)MT處理的表達(dá)量差異不顯著外，其他均差異顯著或極顯著。

圖2 外源MT對(duì)B.cinerea感染10 d后巨峰和克瑞森葡萄活性氧清除相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of exogenous MT on the expression of active oxygen removing related genes in Kyoho and Crimson grape which infected with B.cinerea for 10 days

3 討論

3.1 葡萄種間灰霉病抗性差異

葡萄灰霉病抗性多受遺傳因素影響，屬多基因控制的數(shù)量性狀，群體間差異顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，部分新疆主栽品種灰霉病抗性差異顯著，結(jié)合隸屬函數(shù)進(jìn)行多表型綜合評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，歐美種葡萄抗性強(qiáng)于歐亞種，并以巨峰葡萄抗性最強(qiáng)，黃金蜜葡萄抗性最弱。田園園［23］結(jié)合病原菌侵染前后葉片、果實(shí)灰霉病抗性鑒定及防御酶活性、信號(hào)分子含量變化趨勢(shì)，分別對(duì)23 份葡萄品種（優(yōu)系）進(jìn)行了灰霉病抗性評(píng)價(jià)，其中以歐美種的巨峰優(yōu)系葡萄抗性最強(qiáng)，感病品種以克瑞森、紅地球葡萄等歐亞種居多；任志華［24］通過(guò)葉片接種表型鑒定和顯微結(jié)構(gòu)觀察，對(duì)31 個(gè)葡萄品種以及雜交后代群體進(jìn)行了灰霉病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)歐美種葡萄對(duì)灰霉病抗性表現(xiàn)抗病，而歐亞種葡萄普遍表現(xiàn)感病，與本研究觀點(diǎn)基本一致。Hou等［25］研究發(fā)現(xiàn)葡萄品種雙優(yōu)對(duì)葡萄灰霉病的抗性較高，而紅地球葡萄對(duì)葡萄灰霉病的抗性較低，提出不同葡萄品種對(duì)灰霉病菌感染的抵抗力受不同的基因型影響。

3.2 灰霉病誘導(dǎo)植物細(xì)胞膜透性升高，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累

細(xì)胞膜透性是反映細(xì)胞膜損傷的主要指標(biāo)之一［26］，而植株電導(dǎo)率在一定程度上反映了植物細(xì)胞膜透性受逆境傷害的程度［27］，可作為葡萄品種抗灰霉病特性的重要指標(biāo)之一。本研究中葡之夢(mèng)、陽(yáng)光玫瑰、克瑞森和維多利亞經(jīng)過(guò)灰霉病菌處理之后，植物葉片電導(dǎo)率出現(xiàn)顯著或極顯著變化，細(xì)胞膜透性顯著提高，而巨峰、夏黑、巨盛一號(hào)在處理前后膜透性變化不顯著，由此說(shuō)明葡萄品種抗病性越弱，植物電導(dǎo)率變化越顯著。丙二醛（MDA）是植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，逆境脅迫導(dǎo)致植物活性氧水平升高，引起膜脂過(guò)氧化，造成MDA 積累，MDA 水平可直接反映逆境傷害的程度［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)病菌接種試驗(yàn)，所有葡萄品種葉片中MDA 含量全部增加，其中陽(yáng)光玫瑰和克瑞森等葡萄葉片MDA 含量顯著增加，而巨峰、夏黑、維多利亞等抗病葡萄葉片MDA 含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。這可能是病害脅迫下細(xì)胞膜破壞產(chǎn)生，從而導(dǎo)致葉片MDA 積累所致。B.cinerea侵染導(dǎo)致植物葉片組織內(nèi)活性氧水平升高，其產(chǎn)生速率受病害脅迫程度和時(shí)間的影響。以上3 個(gè)指標(biāo)均與抗性程負(fù)相關(guān)性，而在逆境條件下，植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)游離脯氨酸含量顯著增加，抗性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。由圖1 可知，B.cinerea侵染后，大部分葡萄品種葉片MDA 和游離脯氨酸含量顯著或極顯著上調(diào)，而相對(duì)電導(dǎo)率及產(chǎn)生速率僅在個(gè)別葡萄品種葉片中出現(xiàn)差異。Govrin 等［29］指出，病害和許多其他脅迫都會(huì)導(dǎo)致活性氧生產(chǎn)，對(duì)植物葉片細(xì)胞膜產(chǎn)生傷害。這意味著B(niǎo).cinerea在侵染感病葡萄如陽(yáng)光玫瑰、克瑞森葉片時(shí)，極易破壞其細(xì)胞膜透性，造成離子失衡、MDA 迅速積累、產(chǎn)生速率升高，打破細(xì)胞內(nèi)部氧化還原平衡狀態(tài)，加快細(xì)胞死亡，而抗病葡萄葉片如巨峰等則在細(xì)胞組織中積累較多的游離脯氨酸，可以很好地緩沖由B.cinerea侵染引起的細(xì)胞內(nèi)外滲透壓不平衡。

3.3 MT通過(guò)調(diào)控活性氧平衡緩解B.cinerea對(duì)葡萄的危害

病原菌侵染后通過(guò)激活宿主細(xì)胞免疫抗性響應(yīng)，誘導(dǎo)活性氧（ROS）大量積累，ROS 代謝失衡則對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷，MT的重要的特性是它的抗氧化活性，即通過(guò)清除細(xì)胞產(chǎn)生的多余自由基，增強(qiáng)抗氧化能力，從而提高植株的抗逆性［30-31］。本研究表明，MT可緩解B.cinerea對(duì)葡萄果實(shí)的脅迫：B.cinerea侵染后，葡萄果實(shí)總酚含量驟減，且抗氧化酶相關(guān)基因Cu/Zn-SOD1a、VvPPO等表達(dá)量也顯著或極顯著下調(diào)，而外源MT處理后，除巨峰葡萄VvCH3和VvPPO表達(dá)量無(wú)顯著差異，其他活性氧清除相關(guān)基因表達(dá)量均有不同程度上調(diào)（圖2），表明外源MT 可以降低生物脅迫下植物體內(nèi)過(guò)氧化物含量的積累，緩解細(xì)胞膜脂過(guò)氧化。Mirshekari 等［21］也證實(shí)MT 處理可以調(diào)控超氧化物酶等抗氧化酶活性，進(jìn)而降低ROS 的積累。上述研究均表明，MT可以提高葡萄植株內(nèi)總酚含量、抗氧化酶，從而清除植物體內(nèi)由生物脅迫產(chǎn)生的自由基，提高葡萄對(duì)灰霉病的抗性。

葡萄防御關(guān)鍵基因VvPAL1、VvPPO可通過(guò)誘導(dǎo)苯丙烷代謝相關(guān)酶的活性，促進(jìn)類黃酮，酚類和木質(zhì)素等抗真菌化合物的積累，提高果實(shí)病抗性水平。Xu等［32］研究表明，葡萄受病原菌TalaromycesrugulosusO1侵染后PPO 和PAL 活性上升，提高了對(duì)病原菌的抗性。盡管本研究發(fā)現(xiàn)B.cinerea侵染10 d 后，VvPAL1、VvPPO活性顯著降低、表達(dá)水平顯著或極顯著降低，經(jīng)外源MT 處理后兩種防御酶活性有一定程度提高，增強(qiáng)了葡萄對(duì)病原菌的抗性。T.rugulosus與B.cinerea侵染前后，VvPPO 和VvPAL 活性變化趨勢(shì)存在差異，這可能與兩種病原菌致病機(jī)理和侵染時(shí)期有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究明確了10 個(gè)新疆主栽葡萄品種的灰霉病抗性水平，揭示了MT 調(diào)控葡萄灰霉病抗性的生理基礎(chǔ)。部分葡萄品種灰霉病抗性差異顯著，其中以巨峰葡萄抗性最強(qiáng)，黃金蜜葡萄抗性最弱。B.cinerea誘導(dǎo)葡萄細(xì)胞膜透性升高，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累。MT可通過(guò)抑制植物體內(nèi)過(guò)氧化物含量的積累，緩解細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，進(jìn)而提高葡萄灰霉病抗性。