糞便SDC2 基因甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值

李蕊慧，朱華聰，李勝龍，歐陽(yáng)平

1 南方醫(yī)科大學(xué)普外肛腸亞?？?，廣州 510405；2 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院普外肛腸亞?？疲? 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院健康管理科

結(jié)直腸癌（CRC）是由多種環(huán)境或遺傳因素引起的結(jié)直腸黏膜惡性病變，包括結(jié)腸癌和直腸癌。2022 年，中國(guó)腸癌新發(fā)病例約59 萬(wàn)例，死亡約30 萬(wàn)例，在腫瘤類別中排名第五，發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)［1］。多數(shù)CRC 由腺瘤進(jìn)展形成，從腺瘤進(jìn)展到CRC 一般需要3~10 年，這為CRC 的早期診斷提供了充分的篩查時(shí)間［2］。常用的傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括糞便隱血檢測(cè)、結(jié)腸鏡檢查和計(jì)算機(jī)斷層掃描等，但上述技術(shù)均存在特異性或敏感性低、高侵入性和高輻射等缺點(diǎn)，給CRC 篩查帶來(lái)困難。因此，探索靈敏度高、無(wú)創(chuàng)、依從性好的檢測(cè)方法對(duì)CRC 的早期篩查有重要意義［3-6］。Syndecan-2（SDC2）是一種纖維聚糖，屬于跨膜乙酰硫酸肝素蛋白聚糖家族。研究表明，SDC2 在惡性膠質(zhì)瘤組織中高甲基化［7］。甲基化syndecan-2（mSDC2）在結(jié)直腸癌患者的血液中被檢出［8］。由于在結(jié)直腸癌的發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入結(jié)直腸管腔先于血管浸潤(rùn)［9］，因此理論上糞便比血液檢查更適合早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腫瘤。自2020 年8 月至今，南方醫(yī)院普外肛腸亞?？茖?duì)結(jié)直腸癌高風(fēng)險(xiǎn)患者進(jìn)行無(wú)創(chuàng)糞便基因篩查，采用定量甲基化特異性PCR 檢測(cè)糞便標(biāo)本中的mSDC2，以評(píng)估結(jié)直腸癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。標(biāo)本采集簡(jiǎn)單、方便，可在家中完成，無(wú)侵入性風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過(guò)檢測(cè)患者糞便標(biāo)本中的mSDC2 水平并結(jié)合結(jié)腸鏡檢查及病理檢查結(jié)果，進(jìn)一步評(píng)估該檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期篩查中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年8月—2023年5月至南方醫(yī)院普外肛腸亞?？崎T診及住院的結(jié)直腸癌高危人群進(jìn)行糞便SDC2基因甲基化檢測(cè)者共1 845例，在實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員的指導(dǎo)下采集糞便標(biāo)本，并同意后續(xù)隨訪。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。入組患者符合《2020年中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)結(jié)直腸癌診療指南》和《中國(guó)早期結(jié)直腸癌篩查流程專家共識(shí)意見(jiàn)》［10］。納入標(biāo)準(zhǔn)：①與慢性便秘、慢性腹瀉、便血或排便習(xí)慣改變有關(guān)的癥狀；②癌胚抗原（CEA）或糖類抗原19-9 升高。排除標(biāo)準(zhǔn)：①取樣時(shí)間與結(jié)腸鏡檢查當(dāng)天者；②mSDC2 基因內(nèi)參基因人內(nèi)源性肌動(dòng)蛋白（ACTB）檢測(cè)值>36；③重復(fù)檢測(cè)者；④腸癌術(shù)后檢測(cè)者；⑤有結(jié)直腸癌病史者。納入研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 糞便mSDC2 檢測(cè) 應(yīng)用糞便采集裝置采集約4.5 g 糞便，放入含有16 mL 保護(hù)溶液的樣管中，3 d內(nèi)將糞便樣本寄回醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室。采用磁珠法從糞便中提取目的基因SDC2 和內(nèi)參基因ACTB 的DNA片段，然后用25%亞硫酸鹽處理，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（“長(zhǎng)安心”腸癌糞便基因檢測(cè)試劑盒，康立明公司，中國(guó)）［11-12］。轉(zhuǎn)移10 μL純化產(chǎn)物進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件：95 ℃下變性5 min；48 個(gè)循環(huán)（95 ℃ 15 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s），然后40 ℃冷卻30 s。以體外mDNA為陽(yáng)性對(duì)照，正常人外周血淋巴細(xì)胞DNA為陰性對(duì)照。根據(jù)Ct值判斷結(jié)果：①ACTB基因Ct值≤36表示標(biāo)本合格，Ct值>36表示標(biāo)本不合格，需要重新采樣或拒絕配合；②mSDC2基因Ct 值≤38 為陽(yáng)性，提示SDC2 高甲基化；Ct 值>38 或無(wú)產(chǎn)物擴(kuò)增為陰性，提示SDC2 低甲基化或無(wú)甲基化。為便于統(tǒng)計(jì)，未檢測(cè)到mSDC2擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct設(shè)為48。

1.3 腸鏡檢查 SDC2基因甲基化檢測(cè)陽(yáng)性患者需進(jìn)一步行結(jié)腸鏡檢查，因年齡及疾病或不能耐受腸鏡者未進(jìn)行腸鏡檢查?；颊呔ㄟ^(guò)結(jié)腸鏡檢查或術(shù)后病理檢查腺癌（CRC）明確診斷，病理區(qū)分為結(jié)直腸癌、進(jìn)展型腺瘤、非腺瘤性息肉、炎癥。根據(jù)《2021年NCCN 結(jié)直腸癌腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南》對(duì)結(jié)直腸者癌患者進(jìn)行分期［13］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism8.0 統(tǒng)計(jì)軟件。采用行×列交叉表的卡方檢驗(yàn)比較組間發(fā)病率和相關(guān)性的差異。采用Pearson相關(guān)法分析SDC2基因甲基化檢測(cè)結(jié)直腸腫瘤陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPV）與年齡的相關(guān)性。采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)比較各組Ct值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mSDC2 循環(huán)閾值與性別年齡的關(guān)系 共納入1 845 例受檢者，mSDC2 陽(yáng)性268 例，陰性1 556例，重新取樣不合格21 例。其中268 例陽(yáng)性人員均具有mSDC2 具體循環(huán)閾值。其中男159 例，循環(huán)閾值均值為36.31 ± 1.72；女109 例，循環(huán)閾值均值為36.52 ± 1.70，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。mSDC2循環(huán)閾值與年齡呈負(fù)相關(guān)（r=-0.68，P＜0.05）。

2.2 腸鏡檢查結(jié)果 在268例mSDC2陽(yáng)性患者中，83例患者未接受腸鏡檢查及隨訪，僅185例患者接受結(jié)腸鏡檢查，且均在南方醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心進(jìn)行，隨診率為69.0%。其中82 例患者腸鏡下未見(jiàn)炎癥、息肉、腫塊，另外103例患者中，診斷結(jié)直腸惡性腫瘤23例、進(jìn)展型腺瘤42例、非腺瘤息肉20例、炎癥18例。

2.3 結(jié)直腸病變中mSDC2 陽(yáng)性預(yù)測(cè)值的性別和年齡分布 結(jié)直腸腫瘤中mSDC2 陽(yáng)性并接受腸鏡檢查185 例，男105 例、女80 例。男性結(jié)直腸癌患者SDC2 基因甲基化檢測(cè)PPV 為13.33%（14/105），女性為11.25%（9/80）；男性進(jìn)展型腺瘤患者SDC2 基因甲基化檢測(cè)PPV 為25.71%（27/105），女性為18.75%（15/80）；男性非腺瘤息肉患者SDC2基因甲基化檢測(cè)PPV 為17.14%（18/105），女性為2.5%（2/80）；男性炎癥患者SDC2 基因甲基化檢測(cè)PPV為10.48%（11/105），女性為8.75%（7/80）。在所有結(jié)直腸病變中，男性的mSDC2 PPV 均高于女性，但僅在非腺瘤性息肉中出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。男性結(jié)直腸癌+進(jìn)展型腺瘤的PPV 為39.0%，高于女性（30.0%），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

＜60 歲結(jié)直腸癌患者SDC2 基因甲基化檢測(cè)PPV 為7.04%（10/142），≥60 歲者為30.23%（13/43）；＜60 歲進(jìn)展型腺瘤患者SDC2 基因甲基化檢測(cè)PPV 為21.83%（31/142），≥60 歲者為25.58%（11/43）；＜60 歲非腺瘤息肉患者SDC2 基因甲基化檢測(cè)PPV 為11.27%（16/142），≥60 歲者為9.30%（4/43）；＜60 歲炎癥患者SDC2 基因甲基化檢測(cè)PPV 為11.27%（16/142），≥60歲者為4.65%（2/43）；mSDC2在結(jié)直腸癌患者中的PPV 隨年齡增長(zhǎng)而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SDC2 基因甲基化試驗(yàn)的PPV 在≥60 歲結(jié)直腸癌患者中更為顯著，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)展型腺瘤中，兩組年齡段患者的mSDC2水平相當(dāng)?！?0歲患者的非腺瘤性息肉、炎癥患者mSDC2水平低于＜60歲患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 結(jié)直腸癌、進(jìn)展型腺瘤、非腺瘤性息肉、炎癥等病變的mSDC2 甲基化水平比較 23 例CRC 患者mSDC2 Ct 值為33.65 ± 2.93，42 例進(jìn)展型腺瘤患者mSDC2 Ct 值為36.67 ± 1.11，20 例非腺瘤性息肉患者mSDC2 Ct 值為36.74 ± 1.13，18 例炎癥患者mSDC2 Ct 值為36.31 ± 1.50。CRC 患者Ct 值低于進(jìn)展型腺瘤、非腺瘤性息肉、炎癥患者（P均＜0.05），進(jìn)展型腺瘤、非腺瘤性息肉、炎癥患者Ct 值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。

2.5 不同程度SDC2 基因甲基化的結(jié)直腸癌患者與臨床特征的關(guān)系 經(jīng)mSDC2 檢測(cè)和結(jié)腸鏡檢查診斷為結(jié)直腸癌的患者23 例，按mSDC2 中位數(shù)為34.58分為mSDC2高值12例與低值11例，血清癌胚抗原（CEA 值）>5 ng/mL 為陽(yáng)性，CEA≤5 ng/mL 為陰性（表1）。mSDC2 高低值者間性別、年齡、T 分期、N分期、CEA 陰陽(yáng)性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但較晚的T分期與低mSDC2值有關(guān)。

表1 不同mSDC2循環(huán)閾值結(jié)直腸癌患者臨床特征比較［例（%）］

3 討論

結(jié)腸鏡檢查能有效識(shí)別結(jié)直腸早期病變，降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率［14］。在美國(guó)，結(jié)腸鏡的普及和癌前病變的及時(shí)診治，使結(jié)直腸癌的發(fā)病率正以每年3%的速度穩(wěn)步下降［15］。在中國(guó)城市地區(qū)，結(jié)直腸癌高危人群的結(jié)腸鏡檢測(cè)覆蓋率偏低，僅15.3%。這一數(shù)據(jù)凸顯了在提高結(jié)直腸癌早期發(fā)現(xiàn)率和推廣結(jié)腸鏡檢查方面的挑戰(zhàn)，特別是在提高公眾對(duì)于結(jié)腸鏡檢查重要性的認(rèn)識(shí)方面，亟需采取更有效措施［16］。在本研究中，2 年多時(shí)間接受糞便mSDC2檢測(cè)的總?cè)藬?shù)約1 845例，結(jié)直腸癌高危人群的陽(yáng)性檢出率約為14.5%。同時(shí)，高危人群結(jié)腸鏡檢查依從率達(dá)69.0%，與現(xiàn)有文獻(xiàn)中提及的人群篩查腸鏡依從率相比較高，說(shuō)明mSDC2檢測(cè)能有效提高結(jié)腸鏡檢查依從性，從而有利于降低結(jié)直腸癌相關(guān)的發(fā)病率。然而，高危人群中83例陽(yáng)性患者未進(jìn)一步行結(jié)腸鏡檢查，原因如下：①部分患者年齡過(guò)大，無(wú)法承受檢查；②部分患者基礎(chǔ)疾病較多，無(wú)法承受檢查和麻醉風(fēng)險(xiǎn)；③部分患者自認(rèn)為健康，不需檢查。

本研究中，結(jié)直腸癌男性患者通過(guò)mSDC2 檢測(cè)得到的PPV 為13.33%，而女性患者的PPV 為11.25%。這一性別差異可能與男性較高的結(jié)直腸惡性腫瘤發(fā)病率有關(guān)，值得注意的是，mSDC2 檢測(cè)在男性和女性患者中均展現(xiàn)出較高的PPV，表明其在篩查結(jié)直腸癌方面具有一定臨床價(jià)值。這與GLOBOCAN 2020數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的數(shù)據(jù)一致［17］，提示男性和女性均面臨較高的結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)，男性群體的風(fēng)險(xiǎn)高于女性，特別在亞洲地區(qū)，這種性別差異表現(xiàn)尤為突出，男性與女性的粗發(fā)病率比為1.38：1。本研究結(jié)果顯示，mSDC2檢測(cè)中男性患者腺瘤息肉檢出率高于女性，表明SDC基因甲基化檢測(cè)在診斷腺瘤方面有較高的PPV。這種性別差異可能與男性腺瘤發(fā)病率較高的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素相關(guān)［18］，女性體內(nèi)存在的雌激素受體可與腫瘤抑制基因結(jié)合，從而在體內(nèi)抑制腺瘤性息肉的生長(zhǎng)，降低結(jié)直腸腫瘤的發(fā)病率［19］。

mSDC2 檢測(cè)陽(yáng)性率在結(jié)直腸癌患者的T、N 分期等方面各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與WANG 等［20］研究結(jié)果一致。NIU 等［21］報(bào)道，mSDC2 在腸癌患者糞便中高度甲基化，而在正?；颊呒S便中甲基化較少。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者糞便中SDC2 基因甲基化水平高于進(jìn)展型腺瘤、非腺瘤性息肉及炎癥者，說(shuō)明相比于良性病變，mSDC2 對(duì)于結(jié)直腸癌的早期診斷和篩查具有重要臨床意義。

綜上所述，糞便SDC2 基因甲基化檢測(cè)作為一種非侵入性的檢測(cè)手段，有助于癌前病變的篩查及結(jié)直腸癌早期診斷。但本研究有一定局限性，首先，嘗試對(duì)高齡患者及低齡患者進(jìn)一步年齡分組，由于病例數(shù)量較少，進(jìn)一步分層人數(shù)較少導(dǎo)致結(jié)果不可靠，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本后再驗(yàn)證。其次，許多首次mSDC2 檢查結(jié)果為陰性的患者不希望進(jìn)一步結(jié)腸鏡檢查，因此無(wú)法納入分析。本研究結(jié)論需更大樣本的多中心研究進(jìn)一步驗(yàn)證。