脂聯(lián)素對膿毒癥小鼠急性腎損傷的治療作用及機(jī)制

葉方雄，郭誠，萬雨涵，李威，袁進(jìn)，洪茂林，楊定平

1 武漢大學(xué)人民醫(yī)院腎病內(nèi)科，武漢 430060；2 鄂州市中醫(yī)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科；3 襄陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院；4 鄂州市中醫(yī)醫(yī)院腦病科

膿毒癥是一種宿主對感染反應(yīng)失調(diào)所致的臨床綜合征，以嚴(yán)重的全身炎癥和多器官功能障礙綜合征（MODS）為特點［1］。發(fā)生膿毒癥時，外源性毒素可刺激機(jī)體產(chǎn)生并釋放大量細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，激發(fā)組織炎癥反應(yīng)，引起包括腦、心臟、腎臟在內(nèi)的多種臟器損傷，其中急性腎損傷（AKI）是最常見的并發(fā)癥［2-3］。脂聯(lián)素（APN）是一種脂肪細(xì)胞分泌的多聚性脂肪因子，能提高胰島素敏感性，具有抗炎、改善糖脂代謝、抑制動脈粥樣硬化及抗纖維化特性［4］。APN 濃度的降低與心肌梗死、冠心病、高血壓和其他代謝性心血管功能障礙有關(guān)［5］。近年研究表明，APN 在膿毒癥免疫應(yīng)答及抗炎過程中發(fā)揮重要作用，膿毒癥患者APN 水平的下調(diào)與其嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)［6］。LIU 等［7］發(fā)現(xiàn)，APN 能通過激活A(yù)MPK/mTOR 通路減少肝細(xì)胞凋亡，對膿毒癥大鼠的肝損傷具有保護(hù)作用，但APN 對膿毒癥AKI 的影響鮮見報道。2021 年9 月—2022 年12 月，我們通過腹腔注射脂多糖（LPS）建立膿毒癥小鼠模型，觀察APN 在膿毒癥腎損傷小鼠中的治療作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 雄性SPF 級C57BL/6 小鼠24 只，6～8 周齡，體質(zhì)量22～25 g，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗中心提供，許可證編號SYXK（鄂）2015-0027。LPS 購自美國Sigma 公司；APN 購自美國PeproTech公司，超氧化物陰離子熒光探針（DHE）購自上海碧云天生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；核苷酸結(jié)合寡聚域樣受體3（NLRP3）單克隆抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1 單克隆抗體購自英國Abcam 公司；白細(xì)胞介素（IL）-1β 多克隆抗體、GADPH 單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；NLRP3、IL-1β 和腫瘤壞死因子（TNF）-α 引物由武漢塞維爾生物科技有限公司設(shè)計提供；全自動生化分析儀購自深圳雷杜生命科技有限公司。

1.2 動物模型及分組處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為空白對照組（CON 組）、模型組（LPS組）、實驗組（ LPS+APN 組）。按10 mg/kg 腹腔注射LPS 制備膿毒癥模型，CON 組腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液，實驗組在造模前8 h 按0.1 mg/kg 尾靜脈注射APN 進(jìn)行干預(yù)。造模后24 h 處死小鼠，眼球取血2 mL，離心收集上清，－80 ℃冰箱中保存；縱切左側(cè)腎臟，置于4%多聚甲醛溶液中固定，右側(cè)腎臟用液氮速凍制作冰凍切片待用。

1.3 腎組織病理學(xué)評定 固定好的腎組織脫水，包埋于石蠟中，將組織切成3 μm 切片，行HE 染色，參照文獻(xiàn)［8］依據(jù)Paller 評分法進(jìn)行腎小管損傷病理評分：形態(tài)正常為0分；腎小管擴(kuò)張、細(xì)胞扁平、刷狀緣損傷為1 分；管腔脫落或壞死為1 分；上皮細(xì)胞核固縮、空泡狀或顆粒狀為1 分；刷狀緣脫落、腎小管管型為2分。

1.4 腎功能檢測 取小鼠血清，采用全自動生化分析儀檢測肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）濃度，評估小鼠腎功能。

1.5 活性氧（ROS）檢測 采用超氧化物陰離子熒光探針（DHE）。用DSMO 溶解DHE 配制成染色探針工作液，清洗液清洗冰凍切片3 min，滴加染色探針工作液，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育40 min，裝載熒光探針完畢，移除染色液，并用PBS 洗滌切片3 次，加蓋玻片封片，以535 nm 作為激發(fā)波長，在熒光顯微鏡下觀察ROS的熒光強(qiáng)度，使用Image-Pro Plus 軟件對平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化分析。

1.6 NLRP3、IL-1β、TNF-α mRNA 表達(dá)檢測 采用RT-qPCR 法。TRIzol 試劑提取腎臟組織中的RNA，紫外分光光度計確定各組小鼠總RNA 濃度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用Mx3000P qPCR 系統(tǒng)在96 孔光學(xué)反應(yīng)板上對NLRP3、IL-1β、TNF-α 和GAPDH 的mRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析。NLRP3 正向引物：5'-TAAGAACTGTCATAGGGTCAAAACG-3'，反向引物：5'-GTCTGGAAGAACAGGCAACATG-3'；IL-1β 正向引物：5'-AGGCTCCGAGATGAACAACAAA-3'，反向向引物：5' -GTGCCGTCTTTCATTACACAGGA-3'；TNF-α 正向引物：5'-CTCTTCTGTCTACTGAACTTCGGG-3'，反向引物：5'-GGTGGTTTGTGAGTGTGAGGGT-3'；GAPDH 正向引物：5'-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3'，反向引物：5'-GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3'。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃初始變性3 min、95 ℃變性30 s、60 ℃退火40 s、72 ℃延伸30 s，重復(fù)40個循環(huán)，最后75 ℃延伸8 min。以GAPDH作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)并計算基因的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.7 NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting 法。從腎組織勻漿中提取總蛋白，BCA 法測量蛋白質(zhì)濃度。在上樣緩沖液中95 ℃加熱變性10 min，將蛋白質(zhì)上樣至SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳轉(zhuǎn)膜到PVDF 膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃下與NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GAPDH 一抗孵育過夜。TBST 洗滌3 次，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，在化學(xué)發(fā)光儀中顯影觀察，采集圖像并用Image Lab軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腎損傷比較 CON 組小鼠腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，毛細(xì)血管光滑通暢，腎小管上皮細(xì)胞完整；與CON 組相比，LPS 組小鼠腎臟可見腎小管擴(kuò)張，上皮細(xì)胞核溶解壞死，刷狀緣損傷，腎小管出現(xiàn)細(xì)胞管型；與LPS 組相比，LPS+APN 組小鼠腎臟損傷明顯減輕。見圖1。與CON 組比較，LPS 組小鼠腎臟損傷評分、Scr 及BUN 水平升高（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+APN 組腎臟損傷評分、Scr 及BUN水平下降（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠Paller評分、Scr、BUN比較（± s）

表1 各組小鼠Paller評分、Scr、BUN比較（± s）

注：與CON組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別CON組LPS組LPS+APN組BUN（mg/dL）19.22 ± 2.87 55.34 ± 9.25*41.97 ± 6.04*#n8 8 8 Paller評分（分）0.63 ± 0.52 7.62 ± 1.19*4.38 ± 0.92*#Scr（μmol/L）21.73 ± 5.43 116.70 ± 14.16*79.88 ± 10.63*#

圖1 各組小鼠腎臟病理學(xué)比較（HE染色，×400）

2.2 各組小鼠腎組織活性氧比較 CON 組、LPS組、LPS+APN 組ROS 相對熒光強(qiáng)度分別為1.00 ±0.00、26.67 ± 3.38、16.32 ± 2.51。LPS 組小鼠腎組織切片紅色熒光明顯強(qiáng)于對照組，LPS+APN組紅色熒光較對照組強(qiáng)，而比LPS 組弱（P＜0.05）。

2.3 各組小鼠腎組織NLRP3、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)比較 與對照組比較，LPS 組NLRP3、IL-1β、TNF-α 的mRNA 表達(dá)明顯升高（P均＜0.05）；與LPS組比較，LPS+APN 組NLRP3、IL-1β、TNF-α 的mRNA表達(dá)明顯降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組腎組織NLRP3、IL-1β和TNF-α mRNA相對表達(dá)量比較（± s）

表2 各組腎組織NLRP3、IL-1β和TNF-α mRNA相對表達(dá)量比較（± s）

注：與CON組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別CON組LPS組LPS+APN組TNF-α mRNA 1.01 ± 0.16 2.52 ± 0.49*1.52 ± 0.33*#n8 8 8 NLRP3 mRNA 1.04 ± 0.31 3.93 ± 0.74*1.86 ± 0.47*#IL-1β mRNA 1.01 ± 0.15 2.74 ± 0.50*1.43 ± 0.16*#

2.4 各組小鼠NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠腎組織NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 蛋白表達(dá)明顯升高（P均＜0.05）；與模型組比較，APN 干預(yù)組小鼠腎臟NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)明顯下降（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對表達(dá)量比較（± s）

表3 各組腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對表達(dá)量比較（± s）

注：與CON組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別CON組LPS組LPS+APN組IL-1β 0.49 ± 0.04 1.42 ± 0.16*0.92 ± 0.12*#n8 8 8 NLRP3 0.26 ± 0.06 1.15 ± 0.14*0.52 ± 0.07*#Caspase-1 0.12 ± 0.01 0.72 ± 0.11*0.45 ± 0.04*#

3 討論

膿毒癥是危重病患者死亡的主要原因之一，據(jù)統(tǒng)計，危重患者中AKI 的發(fā)病率高達(dá)60%，不低于40%的膿毒癥會出現(xiàn)包括AKI在內(nèi)的多器官功能衰竭，膿毒癥相關(guān)急性腎損傷（SA-AKI）患者進(jìn)展為慢性腎病的風(fēng)險顯著增加［2，9］。近年來，隨著拯救膿毒癥運(yùn)動的推廣和集束化治療的應(yīng)用，膿毒癥病死率較前有所下降［10］。SA-AKI 的病理機(jī)制尚未完全清楚，目前普遍認(rèn)為各種病原菌感染后導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)綜合征，大量炎癥因子和介質(zhì)如TNF-α、IL-1等相互作用引起的“瀑布炎癥反應(yīng)”是SA-AKI 發(fā)生的重要原因［11］。因此，抑制炎癥因子釋放及防止炎性介質(zhì)的產(chǎn)生成為治療SA-AKI的關(guān)鍵。

APN 是一種具有內(nèi)源活性的多肽，由4 個結(jié)構(gòu)域組成并參與代謝和炎癥過程。APN 通過加速抗炎因子的分泌，減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，從而發(fā)揮抗炎作用，避免機(jī)體發(fā)生過度的免疫反應(yīng)［12-13］。有研究表明，在盲腸結(jié)扎穿刺法建立的大鼠膿毒癥模型中，APN 能顯著降低血清TNF-α 等炎癥因子表達(dá)［7］。本研究結(jié)果顯示，LPS 小鼠腎組織病理評分高，腎小管上皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重，腎功能指標(biāo)Scr、BUN水平升高，炎性因子IL-1β 及TNF-α 的轉(zhuǎn)錄和分泌增加。相較于模型組，存在APN 干預(yù)的小鼠病理評分低，腎小管上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管損傷減輕，Scr、BUN 下降，炎性因子的轉(zhuǎn)錄和分泌減少。說明APN對SA-AKI具有保護(hù)作用。

細(xì)胞焦亡是一種與炎癥相關(guān)的程序性細(xì)胞死亡，由Caspase 介導(dǎo)，分為依賴Caspase-1 介導(dǎo)的經(jīng)典途徑和依賴Caspase-4/5/11 介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑［14］。NLRP3 炎癥小體由NLRP3、接頭蛋白ASC 和效應(yīng)蛋白Caspase-1組成，是一種大分子蛋白復(fù)合體。最新研究發(fā)現(xiàn)，無論是經(jīng)典途徑還是非經(jīng)典途徑，NLRP3炎癥小體在細(xì)胞焦亡過程中均發(fā)揮重要調(diào)控作用［15］。膿毒癥發(fā)生時，細(xì)胞缺氧導(dǎo)致線粒體功能紊亂，產(chǎn)生釋放大量ROS，激活NLRP3，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞焦亡?；罨腘LRP3 招募ASC 和Caspase-1，形成NLRP3 炎癥小體復(fù)合物，ASC 通過切割無活性的Caspase-1 前體成為成熟的Caspase-1。成熟的Caspase-1 隨后催化IL-1β 和IL-18 前體剪切成熟，分泌到細(xì)胞外，啟動相應(yīng)的信號級聯(lián)反應(yīng)，并最終導(dǎo)致IL-1β、IL-18、TNF-α 等大量炎性介質(zhì)釋放［16］。本研究中，相較于對照，LPS 小鼠腎組織活性氧含量升高，炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1 表達(dá)增多，炎性因子IL-1β 的mRNA 及蛋白表達(dá)增加，與既往文獻(xiàn)報道一致。

在膿毒癥中，APN 與疾病的嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)，而外源性的APN 在抗氧化過程中發(fā)揮重要作用。張占琴等［17］研究表明，APN 能調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax 及抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)，通過抑制線粒體損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激保護(hù)小鼠的神經(jīng)及認(rèn)知功能，減輕膿毒癥小鼠腦損傷。亦有研究證實APN 通過調(diào)節(jié)AMPK、Akt和NF-κB 信號通路限制單核細(xì)胞微粒誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化，而NF-κB 通路的活化，在NLRP3 經(jīng)典信號通路的激活以及炎性因子IL-1β、TNF-α 的釋放過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［18］。本實驗結(jié)果顯示，在LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥急性腎損傷小鼠的腎組織中，活性氧含量增加，炎性因子TNF-α分泌明顯增多；APN 干預(yù)后，膿毒癥小鼠腎組織活性氧的含量及TNF-α 表達(dá)明顯減少。說明APN 對膿毒癥急性損傷的保護(hù)作用與活性氧的調(diào)節(jié)及炎性介質(zhì)的減少有關(guān)。

綜上所述，APN 可通過調(diào)控炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡相關(guān)通路對SA-AKI起保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低腎組織氧化應(yīng)激水平，抑制NLRP3 炎性小體的產(chǎn)生，減少TNF-α、IL-1β 等炎性因子的釋放有關(guān)。本研究為SA-AKI的治療提供了新思路，但仍存在以下不足：一是APN 調(diào)控氧化應(yīng)激的分子機(jī)制尚不清楚；二是膿毒癥的發(fā)生由多種原因?qū)е?，本研究以LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥為模型，存在一定局限性，這些在后期研究中有待進(jìn)一步完善。