血清miR-223、IL-6水平與復(fù)雜型熱性驚厥患兒腦損傷的關(guān)系

李婉晨，孫欣榮

1 西安醫(yī)學(xué)院研究生院臨床醫(yī)學(xué)系，西安 710068；2 商洛市中心醫(yī)院兒科；3 西安市兒童醫(yī)院呼吸科

熱性驚厥（FS）是一種以肢體顫抖或僵硬為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，也是最常見的兒童驚厥原因，患病率為3%～5%［1］。復(fù)雜型熱性驚厥（CFS）是小兒FS 最嚴(yán)重的類型，占20%～30%，驚厥發(fā)作頻率較單純型FS 增多，易導(dǎo)致腦損傷，給患兒生命健康造成嚴(yán)重后果［2］。CFS 患兒腦損傷機(jī)制復(fù)雜，但多項(xiàng)研究證實(shí)神經(jīng)炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮重要作用［3］。微小核糖核酸（miRNA）能通過(guò)調(diào)控神經(jīng)炎癥反應(yīng)參與FS 過(guò)程［4］。miR-223 是一種炎癥反應(yīng)相關(guān)的miRNA，已被報(bào)道可參與創(chuàng)傷性腦損傷、腦膜炎等神經(jīng)炎癥反應(yīng)過(guò)程［5-6］。有學(xué)者通過(guò)分析FS 患兒miRNA 表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，miR-223 在FS 患兒血清中水平降低［7］。白細(xì)胞介素-6（IL-6）是一種炎癥調(diào)節(jié)因子，能通過(guò)調(diào)節(jié)多種炎癥細(xì)胞和信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)炎癥發(fā)生發(fā)展［8］。研究報(bào)道，IL-6 基因多態(tài)性與小兒FS 易感性有關(guān)［9］。然而關(guān)于血清miR-223、IL-6與CFS 患兒腦損傷的關(guān)系仍不明確。2021年1月—2023 年8 月，我們探討了血清miR-223、IL-6 水平與CFS 患兒腦損傷的關(guān)系，以期為降低CFS 患兒腦損傷提供更多理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021 年1 月—2023 年5 月我院收治的124 例CFS 患兒（CFS 組），CFS 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤12 歲；②符合《熱性驚厥診斷治療與管理專家共識(shí)（2017實(shí)用版）》［10］CFS診斷標(biāo)準(zhǔn)；③首次發(fā)??；④經(jīng)患兒監(jiān)護(hù)人同意并簽署同意書；⑤資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他FS類型；②合并腦膜炎、腦血管畸形、顱骨骨折、中毒性腦病、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，或神經(jīng)系統(tǒng)疾病史；③遺傳代謝病、急性中毒等其他原因所致驚厥；④既往有驚厥發(fā)作史；⑤先天性免疫缺陷；⑥血液系統(tǒng)疾病；⑦惡性腫瘤患兒。CFS組男81 例、女43 例，年齡5 個(gè)月～7 歲，病程1～6 d；發(fā)熱原因：中毒性菌痢者13例、急性胃腸炎者16例、上呼吸道感染者84 例、其他11 例。發(fā)熱體溫＜38.5 ℃者31 例、38.5～40 ℃者79 例、＞40 ℃者15例。另選取46例入院體檢的健康兒童（對(duì)照組），納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)肝腎功能異常，無(wú)原發(fā)性心臟病、心臟瓣膜性疾病，無(wú)血液系統(tǒng)疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病及其他代謝性疾病；排除標(biāo)準(zhǔn)：神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常、神經(jīng)發(fā)育遲緩、顱腦外傷及腦水腫。對(duì)照組男30 例、女16例，年齡6個(gè)月～7歲。兩組年齡和性別具有可比性（P>0.05）。根據(jù)CFS患兒發(fā)病后2周內(nèi)是否發(fā)生腦損傷將CFS患兒分為腦損傷組和無(wú)腦損傷組。驚厥性腦損傷定義：排除其他原因所致腦損傷，于驚厥發(fā)作后出現(xiàn)的精神神經(jīng)癥候群（神經(jīng)癥狀、癲癇等），并經(jīng)腦電圖檢查發(fā)現(xiàn)明顯異常［11］。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清miR-223、IL-6 檢測(cè) 收集CFS 組入院時(shí)和對(duì)照組體檢時(shí)空腹靜脈血2 mL，以1500×g 離心15 min（半徑10 cm），取上層血清保存于兩支試劑管中，一管使用北京興怡雅創(chuàng)生物技術(shù)有限公司提供的酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（編號(hào)：YAD8699）檢測(cè)IL-6。另一管用TRIzol 法（上海聯(lián)碩生物科技有限公司，編號(hào)：TRIzol 15596026）提取血清總RNA，鑒定純度合格后（賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)的ND-LITE-PR 紫外可見分光光度計(jì)），TaKaRa 法（上海北諾生物科技有限公司，編號(hào)：l111042）反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA。以互補(bǔ)DNA 為模板、U6 為內(nèi)參，根據(jù)SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒（美國(guó)MCE，編號(hào)：HY-K0501A）說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，血清miR-223 水平以2-ΔΔCT法計(jì)算。北京睿博興科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成引物，miR-223正向引物5'-GGCAGCACCCCATAAACTGTT-3'，反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGTCGTGGAG-3'；U6正向引物5'-CGAATCCATTCAAATCCGGGATCCG-3'，反向引物5'-AAGGCATTCAATCGGACTTAC-3'。反應(yīng)體積：互補(bǔ)DNA 2 μL、2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL、正反向引物各0.8 μL、無(wú)菌超純水加至總體積20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min 1 次，95 ℃ 10 s、64 ℃ 10 s、72 ℃ 30 s 40次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS28.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料若為正態(tài)分布以±s±s表示，兩組比較行t檢驗(yàn)；若為偏態(tài)分布則以M（P25，P75）表示，兩組比較行U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料例（%）表示，比較行χ2檢驗(yàn)；CFS 患者血清miR-223與IL-6水平的相關(guān)性用Spearman 相關(guān)性分析；影響CFS患兒腦損傷的因素用多因素Logistic 回歸分析；血清miR-223、IL-6 水平對(duì)CFS 患兒腦損傷的預(yù)測(cè)價(jià)值用受試者工作特征（ROC）曲線分析，Delong 檢驗(yàn)比較血清miR-223、IL-6 水平單獨(dú)與聯(lián)合預(yù)測(cè)CFS患兒腦損傷的曲線下面積（AUC）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFS 組與對(duì)照組血清miR-223、IL-6 水平比較 CFS組與對(duì)照組血清miR-223水平分別為0.81 ±0.12、1.32 ± 0.21，IL-6 水平分別為25.48（14.36，37.40）、4.52（3.46，5.68）ng/mL。與對(duì)照組比較，CFS組血清miR-223水平降低，IL-6水平升高（P均＜0.05）。

2.2 CFS患者血清miR-223與IL-6水平的相關(guān)性Spearman 相關(guān)性分析顯示，CFS 患兒血清miR-223與IL-6 水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.800，95%CI：-0.857～-0.723，P＜0.05）。

2.3 腦損傷組與無(wú)腦損傷組臨床資料比較 124例CFS患兒發(fā)生腦損傷39例，腦損傷發(fā)生率為31.45%（39/124）。腦損傷組病程長(zhǎng)于無(wú)腦損傷組，全身抽搐、發(fā)熱體溫>40 ℃、驚厥發(fā)作次數(shù)≥2次、驚厥發(fā)作持續(xù)時(shí)間≥5 min 比例和IL-6 水平高于無(wú)腦損傷組，miR-223水平低于無(wú)腦損傷組（P均＜0.05），兩組其他資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。見表1。

表1 腦損傷組與無(wú)腦損傷組臨床資料比較

2.4 影響CFS 患兒腦損傷的多因素Logistic 回歸分析結(jié)果 以CFS患兒腦損傷（是/否=1/0）為因變量，以表1有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的因素（P＜0.05）：病程（原值錄入）、抽搐范圍（全身/局部=1/0）、發(fā)熱體溫（＜38.5 ℃/38.5～40 ℃/>40 ℃=1/2/3）、驚厥發(fā)作次數(shù)（≥2 次/＜2 次=1/0）、驚厥發(fā)作持續(xù)時(shí)間（≥5 min/＜5 min=1/0）、miR-223（原值錄入）、IL-6（原值錄入）為自變量，建立影響CFS 患兒腦損傷的多因素Logistic回歸模型。結(jié)果顯示，全身抽搐、驚厥發(fā)作次數(shù)≥2次、驚厥發(fā)作持續(xù)時(shí)間≥5 min、IL-6 升高為CFS 患兒腦損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，miR-223 升高為獨(dú)立保護(hù)因素（P均＜0.05）。見表2。

表2 影響CFS患兒腦損傷的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 血清miR-223、IL-6 水平對(duì)CFS 患兒腦損傷的預(yù)測(cè)價(jià)值 繪制血清miR-223、IL-6水平單獨(dú)與聯(lián)合預(yù)測(cè)CFS患兒腦損傷的ROC曲線。血清miR-223、IL-6水平聯(lián)合預(yù)測(cè)CFS患兒腦損傷的AUC為0.899，大于血清miR-223、IL-6 水平單獨(dú)預(yù)測(cè)的0.803、0.780（Z分別為2.351、2.553，P均＜0.05）。見表3。

表3 血清miR-223、IL-6水平對(duì)CFS患兒腦損傷的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

FS是由發(fā)熱（腋溫≥38 ℃或肛溫≥38.5 ℃）引起的驚厥發(fā)作，主要由病毒感染所致，小兒由于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不完善、神經(jīng)興奮易擴(kuò)散或泛化，在發(fā)熱后極易引起腦組織化學(xué)成分變化導(dǎo)致驚厥發(fā)作，盡管多數(shù)FS患兒驚厥發(fā)作時(shí)間短暫（1～3 min），病程具有自限性，預(yù)后較好，但CFS患兒驚厥發(fā)作時(shí)間較長(zhǎng)且常反復(fù)發(fā)作，極易損傷神經(jīng)系統(tǒng)功能導(dǎo)致腦損傷，甚至誘發(fā)癲癇［12-13］。發(fā)熱是CFS的病理基礎(chǔ)，但發(fā)熱體溫并不能較好地預(yù)測(cè)腦損傷發(fā)生，因此還需探索其他可靠指標(biāo)，以促進(jìn)腦損傷早期診斷，改善患兒預(yù)后。

神經(jīng)炎癥反應(yīng)參與CFS 的發(fā)生發(fā)展，各種原因所致發(fā)熱可激活和刺激神經(jīng)系統(tǒng)中熱原途徑促炎細(xì)胞因子釋放，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)生，神經(jīng)炎癥反應(yīng)不僅能破壞體溫調(diào)節(jié)中樞導(dǎo)致體溫進(jìn)一步上升，還能誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡或引起神經(jīng)元異常放電等導(dǎo)致腦損傷發(fā)生［14］。miRNA 能通過(guò)與靶基因mRNA 的3′-非翻譯端中的互補(bǔ)序列結(jié)合來(lái)抑制靶基因的表達(dá)，從而調(diào)控神經(jīng)炎癥反應(yīng)［15］。miR-223 定位于人染色體Xq12，近年來(lái)研究報(bào)道其與神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。在缺血再灌注建立的急性腦梗死大鼠模型中，上調(diào)miR-223 能減少腦組織炎性細(xì)胞因子釋放，抑制神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)［16］。在慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激建立的抑郁小鼠模型中，上調(diào)miR-223 能抑制NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）信號(hào)通路抑制海馬組織炎癥反應(yīng)［17］。上述研究提示miR-223 具有抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)的作用。WU 等［18］實(shí)驗(yàn)報(bào)道，上調(diào)miR-223 表達(dá)能抑制神經(jīng)元凋亡，縮短大鼠驚厥持續(xù)時(shí)間。同時(shí)有報(bào)道指出，F(xiàn)S 患兒血清miR-223水平降低［7］。因此推測(cè)血清miR-223可能與CFS患兒腦損傷有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，CFS 患兒血清miR-223 水平降低，miR-223 升高為CFS患兒腦損傷的獨(dú)立保護(hù)因素，提示血清miR-223水平升高能降低CFS患兒腦損傷風(fēng)險(xiǎn)，其機(jī)制可能與miR-223能抑制NLRP3/半胱天冬酶-1（Caspase-1）信號(hào)通路有關(guān)。NLRP3/Caspase-1 是神經(jīng)炎癥反應(yīng)重要信號(hào)通路，能促進(jìn)促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄并介導(dǎo)細(xì)胞焦亡［19］。最近WANG 等［20］實(shí)驗(yàn)報(bào)道，上調(diào)miR-223 表達(dá)能抑制NLRP3/Caspase-1 信號(hào)通路激活，減少海馬神經(jīng)元炎癥損傷和凋亡，進(jìn)而減輕大鼠驚厥發(fā)作，并提升學(xué)習(xí)記憶能力。

IL-6 是由多種細(xì)胞表達(dá)的一種可溶性蛋白，生理狀態(tài)下呈低表達(dá)，在各種病理刺激下可大量釋放，通過(guò)結(jié)合IL-6受體和糖蛋白130（gp130），啟動(dòng)Janus激酶（JAK）磷酸化，以此激活JAK/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（STAT）參與炎癥反應(yīng)過(guò)程［21］。研究報(bào)道，IL-6參與腦缺血再灌注損傷、阿爾茨海默病、癲癇等神經(jīng)炎癥疾病過(guò)程［22-24］。實(shí)驗(yàn)報(bào)道，IL-6 在FS 小鼠腦組織中高表達(dá)，下調(diào)IL-6能縮短驚厥持續(xù)時(shí)間［25］。臨床研究指出，CFS 患兒血清IL-6 水平較單純型FS升高［26］。然而關(guān)于血清IL-6水平與CFS患兒腦損傷的關(guān)系尚不明確。本研究結(jié)果顯示，CFS 患兒血清IL-6 水平升高，IL-6 升高為CFS 患兒腦損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示血清IL-6 水平升高會(huì)增加CFS 患兒腦損傷風(fēng)險(xiǎn)，其機(jī)制可能是IL-6 能激活JAK/STAT信號(hào)通路，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重神經(jīng)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致CFS 患兒腦損傷風(fēng)險(xiǎn)增加［27］。此外，IL-6 作為一種致熱原性的細(xì)胞因子，其水平升高可進(jìn)一步破壞體溫調(diào)節(jié)中樞，加劇神經(jīng)功能損害而增加CFS 患兒腦損傷風(fēng)險(xiǎn)［14］。WANG 等［28］研究顯示，抑制FS小鼠海馬IL-6表達(dá)能改善腦損傷。

本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CFS患兒血清miR-223與IL-6 水平呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明miR-223 與IL-6 可能共同參與CFS 過(guò)程，考慮原因可能與miR-223 能抑制NLRP3/Caspase-1 信號(hào)通路減少IL-6 表達(dá)有關(guān)［19］。二者具體關(guān)系還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，全身抽搐、驚厥發(fā)作次數(shù)≥2 次、驚厥發(fā)作持續(xù)時(shí)間≥5 min 為CFS 患兒腦損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其可能原因：全身抽搐、驚厥發(fā)作次數(shù)越多、驚厥發(fā)作持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)反映CFS 患兒病情更嚴(yán)重，因此腦損傷風(fēng)險(xiǎn)更高。本研究ROC 曲線顯示，血清miR-223、IL-6 水平最佳截?cái)嘀禐?.82、24.85 ng/mL 時(shí)，預(yù)測(cè)CFS 患兒腦損傷的AUC分別為0.803、0.780，血清miR-223、IL-6 水平聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC為0.899，較血清miR-223、IL-6水平單獨(dú)預(yù)測(cè)顯著升高。提示血清miR-223、IL-6 水平可能成為CFS 患兒腦損傷的輔助預(yù)測(cè)指標(biāo)，有助于指導(dǎo)臨床制定措施降低CFS 患兒腦損傷風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，CFS患兒血清miR-223水平降低，IL-6水平升高，與腦損傷發(fā)生密切相關(guān)；血清miR-223、IL-6 水平聯(lián)合對(duì)CFS 患兒腦損傷的預(yù)測(cè)價(jià)值較高。但本研究存在選擇偏倚和樣本量小等不足，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究。