lncR-HOXA-AS3 靶向miR-29a 對前列腺癌細(xì)胞凋亡和自噬的影響

李強，劉晶，張國民，王亮，劉志飛，朱研峰

1 開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院泌尿外科，河北唐山 063100；2 唐山市人民醫(yī)院泌尿外科

前列腺癌（PCa）是男性尤其是發(fā)達(dá)國家男性癌癥死亡的主要原因，近年來發(fā)病率呈上升趨勢［1］。盡管在過去的幾十年里，藥物治療、放射治療、前列腺根治術(shù)和擴大盆腔淋巴結(jié)清掃取得巨大成就，但約20%的患者診斷時已為晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這部分PCa患者預(yù)后不良的問題目前仍未解決［2-3］。自噬是細(xì)胞程序性死亡的途徑之一，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮多種作用，一方面，適當(dāng)?shù)淖允煽山档图?xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)，維持腫瘤細(xì)胞的生存；另一方面，過度自噬可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［4］。研究表明，長鏈非編碼RNA（lncR）作為致癌基因或抑癌基因，能調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及自噬，在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用［5］。lncR-HOXA-AS3 是一種位于染色體7p15.2 的新型lncR，是一組高度同源的轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育。既往研究報道，在多種腫瘤組織和細(xì)胞中觀察到lncR-HOXA-AS3 表達(dá)上調(diào)，并能促進腫瘤進展和預(yù)測患者不良預(yù)后［6-8］。但至今，PCa 中l(wèi)ncR-HOXA-AS3 表達(dá)及作用機制的研究甚少。近期文獻證實，lncR-HOXA-AS3 可通過靶向調(diào)控miR-29a 影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為［9］。2022 年5 月—12 月，本研究探討lncR-HOXA-AS3 和miR-29a 在PCa 細(xì)胞系中的表達(dá)變化，并觀察其對PCa細(xì)胞凋亡及自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人PCa 細(xì)胞系LNCaP、C4-2B、DU-145及正常前列腺細(xì)胞系RWPE-1均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。TRIzol試劑購自北京天根生化科技有限公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司；LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega 公司；RIPA 裂解液購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；lncRNA沉默質(zhì)粒陰性對照si-NC、lncR-HOXA-AS3 沉默質(zhì)粒si-HOXA-AS3、miRNA 抑制物陰性對照anti-miR-NC、miR-29a 抑制物anti-miR-29a、miRNA模擬物陰性對照mimics-NC、miR-29a模擬物miR-29 mimics、熒光素酶報告基因質(zhì)粒野生型HOXA-AS3-WT、突變型HOXA-AS3-MUT均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限有限公司；抗Caspase-3、抗LC3，抗Beclin1、抗GAPDH 一抗及HRP標(biāo)記的二抗IgG均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 將LNCaP、C4-2B、DU-145 細(xì)胞接種至含10%胎牛血清RPMI 1460 培養(yǎng)基，RWPE-1細(xì)胞接種至含10%胎牛血清D-KSFM培養(yǎng)基中，均放置于37 ℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染操作時，取對數(shù)生長期LNCaP 細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板內(nèi)，應(yīng)用LipofectamineTM3000按照說明書操作，分別將si-HOXA-AS3、si-NC、si-HOXAAS3+anti-miR-NC、si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 轉(zhuǎn)染至LNCaP 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分為si-HOXA-AS3 組、si-NC 組、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 組、si-HOXAAS3+anti-miR-29a 組，轉(zhuǎn)染12 h 后，將培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的RPMI 1460 培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37 ℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中培養(yǎng)48 h。

1.3 lncR-HOXA-AS3 和miR-29a 表達(dá)檢測 采用RT-qPCR 法。應(yīng)用TRIzol 法提取DU-145、LNCaP、C4-2B 和RWPE-1 細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA 樣品OD260/OD280值1.8～2.0 為合格標(biāo)準(zhǔn)。按照Prime ScriptTMⅡ 1 Strand CDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，應(yīng)用RT-qPCR 試劑盒按照說明書加入PCR 引物，進行PCR 擴增反應(yīng)。lncR-HOXA-AS3 正向引物：5'-AGGAAACATCAGGGCGTACA-3'，反向引物：5'-ATCCTAAGTGCTTGCACCCT-3'；miR-29a 正向引物：5'-TAGCACCATCTGAAATCGGTTA-3'，反向引物：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；內(nèi)參GAPDH 正向引物：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，反向引物：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。內(nèi)參U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 15 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃30 s，共40 個循環(huán)。lncR-HOXA-AS3 和miR-29a 的相對表達(dá)量應(yīng)用2-ΔΔCt法計算。

1.4 細(xì)胞凋亡率檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)測算細(xì)胞凋亡率。收集各組LNCaP細(xì)胞，PBS液清洗2次，加入預(yù)冷結(jié)合緩沖液，制備細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度1×106/mL）。取100 μL 細(xì)胞懸液置入流式管，避光條件加入5 μL PI 和5 μL Annexin V-FITC，避光繼續(xù)孵育15 min，加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液混勻后，立即用流式細(xì)胞儀測算細(xì)胞凋亡率。

1.5 Caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting 法檢測蛋白的相對表達(dá)量。取各組LNCaP 細(xì)胞，RIPA 裂解冰上裂解20 min，離心取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。每泳道加入等量總蛋白進行上樣，10 % SDS-PAGE 電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶里室溫封閉2 h，TBST 洗膜3 次，加入一抗Caspase-3（1∶1 000）、LC3（1∶1 000）、Beclin1（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）抗體后，室溫孵育，次日洗膜后加入二抗，ECL顯影，ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C 取LNCaP 細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞板，按照LipofectamineTM3000 說明書操作，將HOXA-AS3-WT、HOXA-AS3-MUT，與miR-29 mimics或mimics-NC共轉(zhuǎn)染至LNCaP細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后分別命名為HOXA-AS3-WT+miR-29 mimics 組、HOXA-AS3-WT+mimics-NC 組、HOXA-AS3-MUT+miR-29 mimics 組、HOXA-AS3-MUT+mimics-NC 組。轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，應(yīng)用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞的相對熒光素酶活性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以±s表示，比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCa 中l(wèi)ncR-HOXA-AS3、miR-29a 表達(dá)比較RT-qPCR 結(jié)果顯示，RWPE-1、DU-145、LNCaP、C4-2B 細(xì)胞中l(wèi)ncR-HOXA-AS3的相對表達(dá)量分別為1.00 ± 0.04、1.71 ± 0.07、1.92 ± 0.12、1.77 ±0.18；miR-29a 的相對表達(dá)量分別為1.05 ± 0.03、0.66 ± 0.08、0.47 ± 0.09、0.63 ± 0.10。與RWPE-1相比，DU-145、LNCaP、C4-2B 細(xì)胞系中l(wèi)ncR-HOXAAS3表達(dá)均升高（P均＜0.05），miR-29a表達(dá)均降低（P均＜0.05）。選取LNCaP細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

2.2 各組熒光素酶活性及LNCaP 細(xì)胞miR-29a 相對表達(dá)量比較 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，HOXA-AS3-WT+miR-29 mimics 組、HOXA-AS3-WT+mimics-NC 組、HOXA-AS3-MUT+miR-29 mimics組、HOXA-AS3-MUT+mimics-NC 組LNCaP 細(xì)胞相對熒光素酶活性分別為0.48 ± 0.07、0.99 ± 0.04、1.02 ± 0.05、1.04 ± 0.06。HOXA-AS3-WT+miR-29 mimics 組LNCaP 細(xì)胞相對熒光素酶活性低于HOXA-AS3-WT+mimics-NC 組（P＜0.05），而HOXAAS3-MUT+miR-29 mimics 組與HOXA-AS3-MUT+mimics-NC 組LNCaP 細(xì)胞相對熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

si-NC 組、si-HOXA-AS3 組、si-HOXA-AS3+antimiR-NC 組、si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 組miR-29a相對表達(dá)量分別為1.05 ± 0.03、3.15 ± 0.32、3.21 ±0.28、1.32 ± 0.21。與si-NC 組相比，si-HOXA-AS3組、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 組LNCaP 細(xì)胞中miR-29a 表達(dá)升高（P均＜0.05）；與si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 組相比，si-HOXA-AS3 組、si-HOXAAS3+anti-miR-NC組miR-29a表達(dá)升高（P均＜0.05）。提示lncR-HOXA-AS3靶向調(diào)控miR-29a表達(dá)。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 si-NC組、si-HOXA-AS3組、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 組、si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 組細(xì)胞凋亡率分別為（5.3 ± 1.4）%、（20.6 ± 3.1）%、（21.3 ± 2.9）%、（7.5 ± 1.8）%。與si-NC 組相比，si-HOXA-AS3 組、si-HOXA-AS3+antimiR-NC 組細(xì)胞凋亡率升高（P均＜0.05）；與si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 組相比，si-HOXA-AS3組、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 組細(xì)胞凋亡率升高（P均＜0.05）。提示沉默lncR-HOXA-AS3 可促進LNCaP 細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染anti-miR-29a 能逆轉(zhuǎn)沉默lncR-HOXA-AS3對LNCaP細(xì)胞凋亡的促進作用。

2.4 各組Caspase-3、LC3II/LC3I 及Beclin 1 蛋白表達(dá)比較 見表1、圖1。與si-NC組相比，si-HOXA-AS3組、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 組LNCaP 細(xì)胞Caspase-3、LC3II/LC3I 及Beclin 1 蛋白表達(dá)升高（P均＜0.05）。 與si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 組相比，si-HOXA-AS3 組、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 組LNCaP 細(xì)胞Caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1 蛋白表達(dá)升高（P均＜0.05）。

圖1 Western blotting檢測各組LNCaP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 各組LNCaP 細(xì)胞Caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對表達(dá)量比較（± s）

表1 各組LNCaP 細(xì)胞Caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對表達(dá)量比較（± s）

注：與si-NC組比較，①P＜0.05；與si-HOXA-AS3組比較，②P＜0.05；與si-HOXA-AS3+anti-miR-NC組比較，③P＜0.05。

組別si-NC組si-HOXA-AS3組si-HOXA-AS3+anti-miR-NC組si-HOXA-AS3+anti-miR-29a組Beclin1 0.18 ± 0.06 0.83 ± 0.10①0.82 ± 0.11①0.22 ± 0.09②③Caspase-3 0.26 ± 0.18 0.73 ± 0.14①0.75 ± 0.12①0.33 ± 0.10②③LC3II/LC3I 0.15 ± 0.07 0.74 ± 0.08①0.78 ± 0.10①0.16 ± 0.05②③

3 討論

PCa 是男性第二常見的惡性腫瘤，約占男性所有癌癥病例的15%。由于PCa的高發(fā)病率和強侵襲性，PCa 被認(rèn)為是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，尤其是在發(fā)達(dá)國家。由于前列腺特異性抗原（PSA）檢測的特異性較低，并且患者早期缺乏可識別的癥狀，很大一部分PCa 患者在晚期才被診斷出來，治療效果欠佳，預(yù)后較差。近年來研究發(fā)現(xiàn)，遺傳基因因素在PCa 的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。然而，目前發(fā)現(xiàn)的PCa 相關(guān)癌基因和抑癌基因作用有限，無法解釋PCa 復(fù)雜的發(fā)生及轉(zhuǎn)移機制，因此尚缺乏有效的分子靶向治療途徑。

lncRNA 是一種內(nèi)源性長鏈非編碼RNA 分子，其本身無蛋白質(zhì)編碼功能，但其能以表觀遺傳學(xué)的形式調(diào)控其他基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等重要過程。既往研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 作為致癌因子或腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，lncRNA 已被認(rèn)為可能成為未來診斷、治療腫瘤的潛力基因［10］。lncR-HOXA-AS3屬于近期發(fā)現(xiàn)的HOXA家族成員之一，因其參與多種惡性腫瘤發(fā)生及耐藥而受到關(guān)注［11-14］。lncR-HOXA-AS3 在PCa 發(fā)病機制中的研究極少。本研究結(jié)果顯示，PCa 細(xì)胞中l(wèi)ncR-HOXA-AS3 表達(dá)異常升高，提示其可能作為致癌因子參與PCa的發(fā)病。

自噬是真核生物特有的，自噬和凋亡是維持機體正常的生理平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機制，自噬是細(xì)胞程序性死亡的途徑之一，與凋亡一樣，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［15］。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA參與腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡的調(diào)控［16］。本研究結(jié)果顯示，沉默lncR-HOXA-AS3 表達(dá)，LNCaP 細(xì)胞凋亡率明顯上升，凋亡調(diào)控關(guān)鍵蛋白Caspase-3、自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin 1 蛋白表達(dá)均明顯升高，提示沉默lncR-HOXA-AS3 表達(dá)能促進LNCaP 細(xì)胞凋亡和自噬，lncR-HOXA-AS3 在PCa 發(fā)生進展中的作用與其對腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)控有關(guān)。

lncRNA 在細(xì)胞調(diào)控中作用與其對下游靶基因的調(diào)控有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，許多l(xiāng)ncRNA 充當(dāng)miRNA的內(nèi)源性競爭性RNA 以調(diào)節(jié)不同途徑的miRNA 靶向基因表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能。近期在宮頸癌［17］和胃癌［18］研究中均發(fā)現(xiàn)，lncR-HOXA-AS3可靶向miR-29a 參與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)控。miR-29a 是 miR-29 家族成員之一，其定位于人染色體7q32.3 的負(fù)鏈，在機體免疫反應(yīng)、腫瘤形成等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近期研究表明，miR-29a 在腫瘤發(fā)生進展中發(fā)揮抑癌因子的作用［19］。目前研究已證實miR-29a 在PCa 細(xì)胞和組織中異常低表達(dá)，在PCa 的發(fā)生進展中起抑癌因子的作用。上調(diào)PCa 細(xì)胞中miR-29a表達(dá)能抑制Pca細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，并促進其凋亡和自噬［20-23］。本研究結(jié)果顯示，PCa細(xì)胞中miR-29a表達(dá)異常降低，與既往研究結(jié)果一致。且本研究通過雙熒光素酶報告基因結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRHOXA-AS3 能靶向miR-29a 抑制PCa 細(xì)胞的熒光素酶活性，沉默lncR-HOXA-AS3 表達(dá)可上調(diào)PCa 細(xì)胞中miR-29a表達(dá)，并且轉(zhuǎn)染anti-miR-29a能降低PCa細(xì)胞中miR-29a表達(dá)，逆轉(zhuǎn)沉默lncR-HOXA-AS3對PCa 細(xì)胞的凋亡和自噬的促進作用。提示抑制lncRHOXA-AS3 對PCa 細(xì)胞凋亡和自噬的促進作用，與其對miR-29a基因的靶向調(diào)控有關(guān)。

綜上所述，Pca 細(xì)胞lncR-HOXA-AS3 呈高表達(dá)，miR-29a 呈低表達(dá)；抑制lncR-HOXA-AS3 能靶向調(diào)控miR-29a基因促進PCa細(xì)胞凋亡和自噬。