LEASO 患者血清miR-21、miR-126水平與HMGB1/TLR4信號(hào)通路活性和術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

李雪松，劉一東，肖永生，劉喆，張芊慧

天津第四中心醫(yī)院血管外科，天津 300140

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥（LEASO）是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）引起的下肢供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞，股腘型是LEASO 最常見(jiàn)類型，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1-2］。血管腔內(nèi)介入是LEASO 首選治療方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率仍較高［3］。了解股腘型LEASO 介入術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素，對(duì)降低術(shù)后復(fù)發(fā)非常重要。研究表明，高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/Toll 樣受體4（TLR4）信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與LEASO 發(fā)生發(fā)展［4-5］。微小核糖核酸（miR）能通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)參與LEASO 發(fā)生發(fā)展［6］。miR-21、miR-126 是一種炎癥相關(guān)miRNA，能通過(guò)調(diào)控多種基因表達(dá)參與炎癥過(guò)程［7-8］。有實(shí)驗(yàn)指出，miR-21 與miR-126 能分別通過(guò)影響血管平滑肌細(xì)胞功能與血管內(nèi)皮功能參與LEASO 發(fā)生［9-10］。然而關(guān)于血清miR-21、miR-126 表達(dá)與股腘型LEASO 患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系尚不明確。2020 年1 月—2023 年3 月，我們探討了股腘型LEASO 患者血清miR-21、miR-126 水平與HMGB1/TLR4 信號(hào)通路活性和術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020 年1 月—2021 年3 月在天津市第四中心醫(yī)院行介入手術(shù)的股腘型LEASO患者120 例，本研究經(jīng)天津市第四中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：K2019-524）。其中男71 例、女49例，年齡41～76（59.84 ± 8.10）歲；泛大西洋協(xié)作組織共識(shí)Ⅱ（TASCⅡ）分型［11］：A 型23 例、B 型28 例、C型49 例、D 型20 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>40 歲；②患者或家屬簽署同意書(shū)；③符合《下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥診治指南》［12］LEASO 診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)影像學(xué)檢查為股腘動(dòng)脈閉塞癥；④首次接受介入手術(shù)治療；⑤彩色多普勒超聲或CT血管成像檢查血管狹窄超過(guò)50%；⑥介入手術(shù)成功。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并下肢骨折；②髂動(dòng)脈、股動(dòng)脈LEASO；③妊娠及哺乳期女性；④介入手術(shù)禁忌證（如嚴(yán)重凝血功能障礙、碘過(guò)敏等）；⑤免疫性疾病和惡性腫瘤；⑥精神異常；⑦急性肢體缺血、多發(fā)性大動(dòng)脈炎、血栓閉塞性脈管炎等其他動(dòng)脈疾病。股腘型LEASO 患者入院后均接受介入手術(shù)治療，出院后通過(guò)電話、門診等方式隨訪2年，每6個(gè)月1 次，隨訪截至2023 年3 月或術(shù)后復(fù)發(fā)。術(shù)后復(fù)發(fā)定義為隨訪期間數(shù)字減影血管造影發(fā)現(xiàn)支架管腔血管狹窄超過(guò)50%［13］。根據(jù)術(shù)后是否復(fù)發(fā)將股腘型LEASO患者分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組。

1.2 血清miR-21、miR-126 和外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)檢測(cè) 收集股腘型LEASO患者介入術(shù)前1 d空腹外周靜脈血6 mL，保存于兩管試劑管中，其中一管以10 cm半徑，3 000 r/min離心10 min，取上層血清保存于－80 ℃冰箱中用于血清miR-21、miR-126 檢測(cè)；另一管肝素鈉抗凝后，通過(guò)密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞用于外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達(dá)檢測(cè)。使用TRIzol 總RNA 提取試劑盒（上海冠泰生物科技有限公司）提取血清和外周血單個(gè)核細(xì)胞中總RNA，紫外分光光度計(jì)［島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司，型號(hào)：UV-3600i Plus］完成RNA 濃度和純度合格鑒定后，使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］反轉(zhuǎn)為互補(bǔ)RNA，反應(yīng)條件：40 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min。由南京金斯瑞生物科技股份有限公司完成引物設(shè)計(jì)和合成，將收到的引物用無(wú)酶水溶解后，參考實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）說(shuō)明書(shū)，取1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，加入10 μL 2×熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液、0.5 μL上反向引物、7.5 μL無(wú)酶去離子水，混合均勻后置于聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，型號(hào)：ProFlex?］進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min 1 次，95 ℃ 30 s、60 ℃30 s、72 ℃ 60 s 40 次。miR-21、miR-126 以U6 為內(nèi)參校正，HMGB1、TLR4 以GAPDH 為內(nèi)參校正，采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-21、miR-126、HMGB1、TLR4相對(duì)表達(dá)量。miR-21 正向引物5'-TCGGCAGGU GGUGGGCCGCAG-3'，反向引物5'-CACTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；miR-126 正向引物 5'-TGCAACATCATCTGCTCCCA-3'，反向引物5'-CTGAATAACTGATGGCTGGGC-3'；U6 正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3'；HMGB1 正 向 引 物 5'-GAAAGCGCAAGTCTTCAAAG-3'，反向引物5'-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3'；TLR4 正向引物5'-GGACTCTCGCTGGTCTACCT-3'，反向引物5'-GGGCACAATATGCAGGCAGA-3'；GAPDH 正向引物5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'，反向引物5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS28.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以±s表示，比較采用t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩組比較行U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。股腘型LEASO 患者血清miR-21、miR-126 與外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)法進(jìn)行分析；影響股腘型LEASO患者介入術(shù)后復(fù)發(fā)的因素采用多因素Logistic 回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組血清miR-21、miR-126 和外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達(dá)比較 隨訪2 年，120 例股腘型LEASO 患者術(shù)后復(fù)發(fā)41 例，復(fù)發(fā)率為34.17%（41/120）。復(fù)發(fā)組血清miR-21 和外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達(dá)高于未復(fù)發(fā)組，血清miR-126 表達(dá)低于未復(fù)發(fā)組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組血清miR-21、miR-126和外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)比較（± s± s）

表1 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組血清miR-21、miR-126和外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)比較（± s± s）

組別復(fù)發(fā)組未復(fù)發(fā)組n 41 79 t P miR-21 1.82 ± 0.35 1.46 ± 0.34 7.216＜0.05 miR-126 0.36 ± 0.07 0.44 ± 0.06-7.051＜0.05 HMGB1 mRNA 1.42 ± 0.18 1.23 ± 0.17 6.478＜0.05 TLR4 mRNA 2.74 ± 0.18 2.53 ± 0.18 6.738＜0.05

2.2 血清miR-21、miR-126 與外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)法分析顯示，股腘型LEASO患者血清miR-21與外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（r分別為0.660、0.649，P均＜0.05），miR-126 與外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r分別為－0.632、－0.641，P均＜0.05），外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA 與TLR4 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.742，P＜0.05）。

2.3 股腘型LEASO 患者介入術(shù)后復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組臨床資料比較 兩組性別、年齡、TASCⅡ分型、飲酒、高脂血癥、冠心病、完全閉塞、血管病變長(zhǎng)度、術(shù)前實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、支架數(shù)量和支架長(zhǎng)度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05），復(fù)發(fā)組吸煙、高血壓、糖尿病和單純球囊擴(kuò)張比例高于未復(fù)發(fā)組（P均＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組臨床資料比較

2.4 影響股腘型LEASO 患者介入術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素Logistic回歸分析結(jié)果 高血壓、糖尿病和miR-21、HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 升高為股腘型LEASO患者介入術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，miR-126 升高為獨(dú)立保護(hù)因素（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 影響股腘型LEASO患者介入術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

血管腔內(nèi)介入是股腘型LEASO 患者的重要治療手段，能有效重建血運(yùn)，緩解肢體潰瘍壞疽、靜息痛、間歇性跛行為等癥狀，但仍有部分患者術(shù)后動(dòng)脈再次狹窄甚至閉塞［14］。

HMGB1是一種高度保守核蛋白，能通過(guò)與髓樣分化蛋白2 結(jié)合激活TLR4 復(fù)合物形成HMGB1/TLR4 信號(hào)通路，并由此活化核因子-κB（NF-κB），促進(jìn)大量炎性細(xì)胞因子釋放，且HMGB1/TLR4 是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵炎癥信號(hào)通路之一［15］。本研究結(jié)果顯示，股腘型LEASO 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA 與TLR4 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)，提示HMGB1/TLR4 信號(hào)通路在股腘型LEASO 患者中處于激活狀態(tài)。結(jié)果還顯示，復(fù)發(fā)組外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達(dá)升高，是股腘型LEASO 患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明HMGB1/TLR4 信號(hào)通路激活參與股腘型LEASO 術(shù)后復(fù)發(fā)。

miR-21 最初于腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-21 能通過(guò)調(diào)控免疫細(xì)胞或靶基因參與炎癥反應(yīng)過(guò)程，在冠心病、急性腦梗死等AS 相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用［16-17］。賈敏等［18］研究報(bào)道，miR-21表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)載脂蛋白E敲除小鼠AS發(fā)生發(fā)展。miR-126定位于人染色體9q34.3，由于其特異性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并通過(guò)抑制炎癥發(fā)揮血管內(nèi)皮保護(hù)作用，因此被認(rèn)為是心血管疾病的保護(hù)因子［19］。SHOU 等［20］研究報(bào)道，miR-126 在氧化低密度脂蛋白建立的泡沫細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)miR-126 能抑制泡沫細(xì)胞發(fā)育和巨噬細(xì)胞向促炎表型轉(zhuǎn)換，進(jìn)而抑制AS形成。上述研究表明，miR-21、miR-126 可通過(guò)炎癥反應(yīng)參與AS形成。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組血清miR-21 表達(dá)升高，且是股腘型LEASO 患者介入術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；血清miR-126 表達(dá)降低，而其表達(dá)升高是股腘型LEASO 患者介入術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立保護(hù)因素，說(shuō)明二者與股腘型LEASO 患者介入術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。分析原因可能是miR-21 高表達(dá)能通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶1/2 通路激活炎癥，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換而導(dǎo)致AS 形成，增加股腘型LEASO 患者介入術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［9］；miR-126高表達(dá)通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 抑制炎癥反應(yīng)，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡，進(jìn)而降低股腘型LEASO 患者介入術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［10］。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，股腘型LEASO 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 與血清miR-21表達(dá)呈正相關(guān)，與miR-126表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-21 高表達(dá)和miR-126 低表達(dá)可能通過(guò)HMGB1/TLR4 信號(hào)通路影響股腘型LEASO 患者術(shù)后復(fù)發(fā)。LIU 等［21］研究顯示，上調(diào)miR-126能靶向下調(diào)HMGB1 及其反向促炎基因表達(dá)，改善缺氧酸中毒誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷。此外本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，高血壓、糖尿病也會(huì)增加股腘型LEASO 患者介入術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。分析原因可能是持續(xù)血壓升高和高血糖會(huì)加劇血管壁損傷，激活血管壁炎癥反應(yīng)導(dǎo)致AS形成，進(jìn)而導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加［22］。

綜上所述，血清miR-21 高表達(dá)和miR-126 低表達(dá)與股腘型LEASO 患者HMGB1/TLR4 信號(hào)通路激活有關(guān)，且血清miR-21高表達(dá)是股腘型LEASO患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，miR-126 低表達(dá)是保護(hù)因素。