低共熔溶劑輔助酶法高效合成香草酸的工藝研究

許令俠 梁?jiǎn)? 孫建中 朱道辰

摘要：針對(duì)化學(xué)合成香草酸會(huì)造成環(huán)境污染、活性低，從植物中提取香草酸產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本過(guò)高等問(wèn)題，采用來(lái)源于Bacillus ligniniphilus L1的香草醛脫氫酶進(jìn)行香草酸的生物轉(zhuǎn)化。為了更好地提高酶促反應(yīng)效率，在反應(yīng)體系中添加適量的低共熔溶劑（DES，氯化膽堿∶1，4-丁二醇為1∶3）可以有效提升酶活并使其保持較高的穩(wěn)定性。隨即考察了反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH、反應(yīng)時(shí)間和DES添加量對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響，并通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝研究，得到最佳的轉(zhuǎn)化工藝參數(shù)為反應(yīng)溫度36 ℃、反應(yīng)pH 6.8、DES添加量17%，在此條件下香草酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到84.57%，與未添加DES相比，轉(zhuǎn)化率提升了37.98%。采用DES輔助酶法進(jìn)行香草酸的生物轉(zhuǎn)化，可以有效地提升香草醛脫氫酶的酶活和香草酸的轉(zhuǎn)化率，制備過(guò)程綠色、安全、經(jīng)濟(jì)，符合香草酸綠色工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

關(guān)鍵詞：香草酸；低共熔溶劑；香草醛脫氫酶；生物轉(zhuǎn)化；響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TS201.1????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2024）02-0178-08

Study on Process of Efficient Synthesis of Vanillic Acid Using Deep Eutectic Solvent-Assisted Enzymatic Method

Abstract： In response to the issues of environmental contamination and low activity caused by chemical synthesis of vanillic acid， as well as the low yield and high production cost of extracting vanillic acid from plants， vanillin dehydrogenase derived from Bacillus ligniniphilus L1 is used for the biotransformation of vanillic acid. In order to better improve the efficiency of enzymatic catalysis reaction， adding an appropriate amount of deep eutectic solvent （DES， choline chloride∶1，4-butanediol is 1∶3） into the reaction system can effectively improve the enzyme activity and make it maintain high stability， and then the effects of reaction temperature， reaction pH， reaction time and the addition amount of DES on the conversion rate of vanillic acid are investigated. Response surface experiment is applied to study the process， and the optimal transformation process parameters are determined as follows： reaction temperature is 36 ℃， reaction pH is 6.8 and DES addition amount is 17%. Under these conditions， the conversion rate of vanillic acid reaches 84.57%， which is 37.98% higher than that of vanillic acid without adding DES. The use of DES-assisted enzymatic method for the biotransformation of vanillic acid can effectively improve the enzyme activity of vanillin dehydrogenase and the conversion rate of vanillic acid. The preparation process is green， safe and economical， which meets the requirements for green industrial production of vanillic acid.

Key words： vanillic acid； deep eutectic solvent； vanillin dehydrogenase； biotransformation； response surface optimization

香草酸，別名4-羥基-3-甲氧基苯甲酸，作為一種高檔香料，在食品和化妝品領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，屬于肉桂酸類衍生物，廣泛存在于香蘭豆科植物中[1]。其除了具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值外，還具有較廣泛的醫(yī)學(xué)用途，例如抗菌消炎、抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、化感作用、調(diào)節(jié)神經(jīng)和促凝血活性等作用[2-5]。目前香草酸的獲得方式主要有兩種：一種是工業(yè)合成香草酸，主要通過(guò)堿性條件下裂解香草醛來(lái)獲得；另一種是從天然植物中進(jìn)行提取。前者產(chǎn)量高、活性低，會(huì)給環(huán)境造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，后者產(chǎn)量低、活性高，但是存在植物原料嚴(yán)重不足的問(wèn)題[6-7]。國(guó)內(nèi)外對(duì)醫(yī)藥、食品行業(yè)原料來(lái)源以及生產(chǎn)過(guò)程的要求越來(lái)越嚴(yán)苛，例如香草酸的前體物質(zhì)香草醛，只有生物來(lái)源或者通過(guò)生物途徑合成的香草醛才可以被用于食品、化妝品以及藥品領(lǐng)域[8]。生物合成香草酸的途徑主要有兩種：一種是以香草酸的前體物質(zhì)為底物，通過(guò)微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化；另一種是通過(guò)酶催化合成[9]。由于香草酸及其前體物質(zhì)多為芳香族化合物，過(guò)量的芳香族化合物會(huì)對(duì)參與轉(zhuǎn)化的細(xì)胞宿主產(chǎn)生毒性，從而抑制香草酸的合成，在工業(yè)上很難通過(guò)微生物途徑實(shí)現(xiàn)香草酸的大批量生產(chǎn)。酶催化合成香草酸具有專一性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化過(guò)程綠色清潔等優(yōu)勢(shì)，因此成為眾多香草酸生產(chǎn)方式中的最佳選擇之一。

低共熔溶劑（deep eutectic solvent，DES）是繼離子液體（ionic liquid，IL）之后的新一代綠色溶劑，是一種由氫鍵供體（HBA）和氫鍵受體（HBD）按照特定摩爾比例和條件混合形成的均相透明液體，具有無(wú)毒、低揮發(fā)、不易燃、易保存、可定向設(shè)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品和化工領(lǐng)域[10-11]。關(guān)于DES的研究主要集中于植物中天然產(chǎn)物的分離提取以及生物質(zhì)秸稈中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的三素分離[12-15]。近年來(lái)也有研究表明DES與一些生物材料（酶、微生物細(xì)胞）表現(xiàn)出了較好的生物相容性，并且被證明在提升全細(xì)胞催化和酶催化效率方面具有積極意義[16-19]。例如在對(duì)黃酮苷的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，徐萬(wàn)軍[20]選擇DES作為酶促反應(yīng)溶劑，使得β-葡萄糖苷酶活性提高，黃酮苷轉(zhuǎn)化率達(dá)到96.63%。Lindberg等[21]研究發(fā)現(xiàn)，DES可以改變酶本身的Km值，進(jìn)而影響整個(gè)酶促反應(yīng)。也有研究報(bào)道DES可以提高底物和中間產(chǎn)物在緩沖溶液中的溶解能力，進(jìn)而提升酶促反應(yīng)的轉(zhuǎn)化效率[22]。這預(yù)示著DES作為助溶劑或者助催劑在生物催化領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

本課題組長(zhǎng)期從事生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化及利用的研究，從南海海底泥土中篩選出1株對(duì)木質(zhì)素具有高效降解能力的菌株Bacillus ligniniphilus L1，在闡明香草酸代謝途徑的基礎(chǔ)上，挖掘出香草醛向香草酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因，并通過(guò)基因敲除和大腸桿菌中異源表達(dá)驗(yàn)證了其功能[23-24]。本研究在此基礎(chǔ)上篩選出最佳的DES，并優(yōu)化反應(yīng)條件，以期獲得從香草醛到香草酸的最佳轉(zhuǎn)化效率，為香草酸的生物催化合成提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

香草醛、香草酸、氯化膽堿、尿素、1，4-丁二醇、甘油、蘋(píng)果酸、乳酸、蔗糖、果糖、葡萄糖：上海麥克林生化科技股份有限公司；乙腈、磷酸、IPTG、硫酸卡那霉素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基

所用菌株為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的香草醛脫氫酶工程菌E.coli-VDH，于－80 ℃冰箱中用甘油管保藏。LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L， pH 7.0。LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂1.6 g/L，pH 7.0。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)主要溶液

考馬斯亮藍(lán)（G250）染色液：G250 37 mg，無(wú)水乙醇25 mL，磷酸50 mL，去離子水425 mL，均勻混合，于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）：Tris 36.3 g，用去離子水溶解，用濃鹽酸調(diào) pH 至7.4，定容至 100 mL，于棕色瓶中避光保存。

PBS緩沖溶液（pH 7.2）、0.9% NaCl溶液均于4 ℃保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

LB-RH-250 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱 青島路博建業(yè)環(huán)?？萍加邢薰?；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；FS-1800N超聲波處理器 上海生析超聲儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司；NanoDrop One蛋白濃度檢測(cè)儀、MK3型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DES的制備

選擇氯化膽堿作為氫鍵受體，氫鍵供體為蘋(píng)果酸、甘油、果糖、1，4-丁二醇、蔗糖、尿素、蘋(píng)果酸、乳酸、葡萄糖，按照設(shè)定的摩爾比例參考文獻(xiàn)[14]中的方法制備DES。

1.3.2 菌株的活化與培養(yǎng)

從－80 ℃冰箱中取出保藏的香草醛脫氫酶工程菌E.coli-VDH，取50 μL菌液置于5 mL含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)完成后在含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，直至生長(zhǎng)出單菌落。

挑取1環(huán)單菌落，置于5 mL含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，按照10%接種量，置于200 mL含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4 h，使得OD600處于0.6～0.8。加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)16～20 h。

1.3.3 香草醛脫氫酶的獲取和純化

將培養(yǎng)完成的菌株在4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，離心后棄上清，加入0.9% NaCl溶液重懸，清洗2次，最后加入8 mL PBS緩沖液（pH 7.2），重懸，破碎。破碎后，于4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，上清液即為獲得的粗酶液。

將粗酶液采用鎳親和層析柱分離純化香草醛脫氫酶，將純化好的香草醛脫氫酶用 SDS-PAGE 進(jìn)行分析，隨即進(jìn)行脫鹽處理，檢測(cè)最終蛋白濃度和初始酶活，最終于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 香草醛脫氫酶酶活和蛋白濃度檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[25]中的方法，Tris-HCl（50 mmol/L，pH 7.4），不同濃度已制備的DES溶劑、組分混合溶劑（未制備DES）或單一組分溶劑，5 mmol/L香草醛、1 mmol/L NAD+，30 ℃水浴3 min，加入適量香草醛脫氫酶啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)溶液總體積為3 mL，檢測(cè)5 min內(nèi)溶液在340 nm波長(zhǎng)處吸光值變化，并根據(jù)下式計(jì)算香草醛脫氫酶酶活。孵育前香草醛脫氫酶的酶活被定義為 100%。

酶活（U）=EW×V×103/（6 220×1）。

式中：EW為1 min內(nèi)溶液在340 nm處吸光值變化；V為反應(yīng)溶液總體積，mL；6 220為摩爾消光系數(shù)，L/（mol·cm）；1為光程距離，cm。

采用Bradford法測(cè)定香草醛脫氫酶的蛋白濃度。

1.3.5 香草酸和香草醛HPLC檢測(cè)

準(zhǔn)確配制1 mmol/L香草醛和香草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶劑選擇甲醇，分別取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL香草醛和香草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL甲醇，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，最終繪制各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。高效液相色譜檢測(cè)條件：乙腈∶0.1%磷酸-水溶液（5∶5），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，檢測(cè)溫度為30 ℃。

1.3.6 香草醛脫氫酶穩(wěn)定性測(cè)試

以不同pH值的Tris-HCl（50 mmol/L）緩沖溶液為基準(zhǔn)，加入10%的DES，酶促反應(yīng)pH設(shè)定為5～10，共分為6組，分別測(cè)定最終的剩余酶活。在最適pH條件下，調(diào)整反應(yīng)體系的溫度分別為20，30，40，50，60，70 ℃，按照同樣步驟測(cè)定最終的剩余酶活。

1.3.7 單因素實(shí)驗(yàn)

以不同pH值的Tris-HCl（50 mmol/L）緩沖溶液為基準(zhǔn)，準(zhǔn)確加入1 mL香草醛脫氫酶、終濃度為1 mmol/L的NAD+和香草醛。置于水浴恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速設(shè)置為180 r/min。分別以反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH、DES添加量和反應(yīng)時(shí)間為變量，考察各因素對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.8 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，篩選出對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率影響顯著的因素，通過(guò)Design-Expert 12.0 軟件中的Box-Behnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和模型構(gòu)建，確定香草醛轉(zhuǎn)化為香草酸的最佳工藝條件。

1.3.9 香草酸轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

將反應(yīng)后的溶液加熱，直至蛋白變性析出，離心取0.5 mL上清液加入同等體積的甲醇溶液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣體積設(shè)置為20 μL，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，將所得峰面積代入香草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)最終香草酸含量，計(jì)算香草酸轉(zhuǎn)化率α：

α=C1/C2×100%。

式中：C1為香草酸濃度，mmol/L；C2為初始香草醛濃度，mmol/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS-PAGE凝膠電泳

由圖1可知，條帶A為蛋白Marker，條帶B為未純化的粗酶液，條帶C為純化后的酶液。通過(guò)比對(duì)蛋白Marker，香草醛脫氫酶的分子量大約為56～58 kDa，說(shuō)明蛋白在大腸桿菌中表達(dá)效果良好。純化后的蛋白濃度為5.69 mg/mL，初始酶活為2.71 U/mg。

2.2 DES緩沖液類型的確認(rèn)

在脂肪酶、纖維素酶和過(guò)氧化酶的酶促反應(yīng)中，多種以氯化膽堿作為氫鍵受體的DES已被證實(shí)可以用于提高酶促反應(yīng)[26]。因此在DES組分的篩選中，選擇氯化膽堿作為氫鍵受體，糖基、有機(jī)酸和醇基作為氫鍵供體來(lái)制備不同類型的DES，不同類型DES組分配比見(jiàn)表1。

由圖2可知，糖基作為氫鍵供體時(shí)，并不能提升香草醛脫氫酶的活性，果糖和蔗糖作為氫鍵供體時(shí)甚至表現(xiàn)出了一定的抑制作用，其原因可能是相較于醇基和有機(jī)酸組成的DES，糖基制備的DES通常黏度較高，阻礙了酶促反應(yīng)中的傳質(zhì)過(guò)程，進(jìn)而抑制了酶促反應(yīng)的進(jìn)行[27]。有機(jī)酸作為氫鍵供體時(shí)，雖然并沒(méi)有抑制香草醛脫氫酶的活性，但是與醇基DES相比，提升效果并不明顯，原因可能是有機(jī)酸基DES通常pH較低，改變了催化體系的pH值，進(jìn)而不利于香草醛脫氫酶酶促反應(yīng)的進(jìn)行。在醇基DES中，1，4-丁二醇和甘油各自有2個(gè)和3個(gè)羥基，而尿素并無(wú)羥基結(jié)構(gòu)，在形成DES的過(guò)程中，前兩者形成的氫鍵數(shù)量多，氫鍵作用強(qiáng)，進(jìn)而在提升香草醛脫氫酶酶活方面表現(xiàn)出了較好的效果。 通過(guò)最終的結(jié)果比較，選擇氯化膽堿∶1，4-丁二醇為1∶3的摩爾比合成DES。

高效的酶促反應(yīng)離不開(kāi)水的參與，水對(duì)酶促反應(yīng)通常表現(xiàn)出促進(jìn)作用，而當(dāng)DES作為反應(yīng)溶劑時(shí)，水的添加還可以起到調(diào)節(jié)反應(yīng)介質(zhì)的黏度的效果。由圖2可知，隨著DES添加量的增加，其對(duì)酶活的提升效果呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。但是DES添加量過(guò)低時(shí)，多種類型的DES表現(xiàn)出較低的提升效果，這意味著在酶促反應(yīng)過(guò)程中，DES需有一個(gè)合適的添加量。以篩選的DES4為例，當(dāng)DES添加量為5%時(shí)，酶活并未達(dá)到最佳值，10%添加量時(shí)達(dá)到最佳，但是隨著添加量增加到30%，酶活反而呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。形成這一現(xiàn)象的原因可能是DES添加量過(guò)多，黏度提高，酶促反應(yīng)受到抑制；DES添加量過(guò)少，反應(yīng)過(guò)程中的水分含量增加，DES中少量的氫鍵結(jié)構(gòu)被破壞，但是對(duì)整體的氫鍵網(wǎng)絡(luò)沒(méi)有造成過(guò)大的影響，仍然可以提高反應(yīng)的酶活[28]。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用10%的DES添加量作為酶促反應(yīng)的最佳添加量。

2.3 溶劑體系組分對(duì)香草醛脫氫酶活性的影響

為了更好地驗(yàn)證香草醛脫氫酶活性的增加是否與組成DES的單一組分或者混合組分有關(guān)，對(duì)以上組分進(jìn)行了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。由圖3可知，在添加DES組分的體系中，香草醛脫氫酶的相對(duì)酶活最高達(dá)到166%，而在單一組分和混合組分反應(yīng)體系中，香草醛脫氫酶的相對(duì)酶活則表現(xiàn)平穩(wěn)，甚至出現(xiàn)了略微下降的趨勢(shì)。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是雖然選取的組分多為天然產(chǎn)物，但是隨著含量的增多，單一組分在反應(yīng)體系中不斷擴(kuò)散，很容易結(jié)合到酶的活性位點(diǎn)或者吸附在其附近，破壞分子內(nèi)氫鍵或者阻斷其與底物結(jié)合，從而影響酶的活性。與之相反，DES經(jīng)過(guò)合成后，形成了強(qiáng)大的氫鍵結(jié)構(gòu)，對(duì)酶的活性位點(diǎn)起到了保護(hù)作用。同時(shí)在一定范圍內(nèi)，隨著DES添加量的增加，酶活也隨之增加，這意味著DES對(duì)酶活的提升效果并不是由單一組分決定的，DES在反應(yīng)體系中也具有較好的穩(wěn)定性，并沒(méi)有完成單一組分的解離[29]。

2.4 香草醛脫氫酶的穩(wěn)定性

酶活是影響酶促反應(yīng)進(jìn)行的一個(gè)重要因素，但是酶的穩(wěn)定性也是酶促進(jìn)行過(guò)程中不可或缺的因素。香草醛脫氫酶的穩(wěn)定性主要包括酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，因此選取溶劑體系的pH、溶劑體系的溫度2個(gè)因素對(duì)香草醛脫氫酶的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，并確定適合香草醛脫氫酶的反應(yīng)體系。

2.4.1 pH對(duì)香草醛脫氫酶穩(wěn)定性的影響

反應(yīng)溶劑的pH可以改變酶的活性位點(diǎn)，因此酶的活性通常對(duì)反應(yīng)體系pH具有較大依賴性[30]。由圖4可知，香草醛脫氫酶在pH 5.0～8.0表現(xiàn)出了較高的穩(wěn)定性，其中pH為7.0時(shí)，香草醛脫氫酶的穩(wěn)定性最佳，18 h時(shí)相對(duì)酶活保持在77%，42 h后最終相對(duì)酶活仍能達(dá)到46%。這個(gè)結(jié)果可能表明香草醛脫氫酶是一種中性酶，能夠在中性以及弱酸、弱堿條件下保持較高的活性和穩(wěn)定性，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。與之相比，在pH為9.0和pH為10.0的條件下，18 h后酶的活性基本喪失。造成這一現(xiàn)象的原因可能是在堿性條件下，反應(yīng)體系的高pH會(huì)影響反應(yīng)底物的電荷活性，酶正常的蛋白結(jié)構(gòu)和形貌遭到破壞，酶的活性位點(diǎn)發(fā)生改變，從而阻礙了酶催化反應(yīng)的進(jìn)行，酶的穩(wěn)定性降低[31]。

2.4.2 溫度對(duì)香草醛脫氫酶穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，在30 ℃以下以及60 ℃以上，大部分香草醛脫氫酶已經(jīng)失去活性。在70 ℃維持18 h、20 ℃維持24 h后，酶的活性已經(jīng)完全喪失。在30，40，50 ℃條件下，酶在DES體系中活性喪失不明顯，42 h后仍能達(dá)到72%、77%、57%的相對(duì)酶活。由此推斷香草醛脫氫酶屬于中溫酶，其空間結(jié)構(gòu)中暴露在外的氨基酸殘基多為疏水基團(tuán)，疏水性的氨基酸殘基可以提供更多的疏水相互作用來(lái)維持酶的結(jié)構(gòu)，并最終使酶獲得更高的穩(wěn)定性。而另一個(gè)原因可能是DES具有強(qiáng)大的氫鍵作用，可以在酶分子周圍形成保護(hù)性結(jié)構(gòu)，避免酶結(jié)構(gòu)遭到破壞，提高了酶的穩(wěn)定性[32]。

2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

上述研究已經(jīng)證明低共熔溶劑可以提升香草醛脫氫酶的酶活，并且在低共熔溶劑中酶可以穩(wěn)定存在，但是在實(shí)際轉(zhuǎn)化過(guò)程中產(chǎn)物香草酸的生成仍然受多種因素的影響。香草醛脫氫酶的酶促反應(yīng)需要NAD+的參與，在NAD+定量的情況下，添加過(guò)量的酶無(wú)法提升香草酸的最終產(chǎn)量，因此本次實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有考慮酶添加量對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響。最終選取了反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH、DES添加量、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而使得香草酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高。

2.5.1 反應(yīng)溫度對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖6可知，在選取的溫度范圍內(nèi)，香草酸的轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在反應(yīng)溫度為35 ℃時(shí)香草酸轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到了84%。這個(gè)結(jié)果與2.4.2中的結(jié)果相對(duì)應(yīng)，香草醛脫氫酶在30～40 ℃內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性。當(dāng)反應(yīng)溫度高于35 ℃時(shí)，香草酸轉(zhuǎn)化率下降，這是因?yàn)闇囟冗^(guò)高影響了香草醛脫氫酶的活性，從而影響了香草酸的轉(zhuǎn)化率。因此，本實(shí)驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)溫度為35 ℃。

2.5.2 反應(yīng)pH對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖7可知，當(dāng)pH為7時(shí)香草酸轉(zhuǎn)化率最高，隨著pH繼續(xù)增加，香草酸轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這個(gè)結(jié)果與2.4.1中的結(jié)果相對(duì)應(yīng)，香草醛脫氫酶在pH為7.0時(shí)具有較高的穩(wěn)定性。因此，本實(shí)驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)pH為7.0。

2.5.3 DES添加量對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖8可知，當(dāng)DES添加量為15%時(shí)，香草酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高。當(dāng)DES添加量大于15%時(shí)，香草酸轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢(shì)。DES添加量過(guò)低，反應(yīng)體系中的水含量較高，破壞了DES中的氫鍵結(jié)構(gòu)，DES所提供的保護(hù)功能下降，酶活性提升不明顯，轉(zhuǎn)化率無(wú)法達(dá)到最大值。過(guò)高的DES添加量也會(huì)造成反應(yīng)體系的黏度提升，影響產(chǎn)物香草酸的析出，從而使香草酸轉(zhuǎn)化率降低。因此，本實(shí)驗(yàn)確定的最佳DES添加量為15%。

2.5.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖9可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，香草酸轉(zhuǎn)化率呈上升趨勢(shì)。為了更好地了解香草酸的轉(zhuǎn)化趨勢(shì)，選取1 mmol/L香草醛作為底物最終濃度。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在10～30 min內(nèi)香草酸轉(zhuǎn)化率增加較快，在30～50 min內(nèi)香草酸轉(zhuǎn)化率的增加變得緩慢，50 min時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大。造成這一現(xiàn)象的原因可能是隨著香草酸析出，酶反應(yīng)的平衡受到影響，產(chǎn)物的增加影響了反應(yīng)的進(jìn)行，從而使反應(yīng)效率呈現(xiàn)減緩的趨勢(shì)。因此，本實(shí)驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)時(shí)間為50 min。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.6.1 響應(yīng)面模型的建立與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)pH（B）和DES添加量（C）是影響從香草醛到香草酸轉(zhuǎn)化效果的主要因素，Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表2。設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，共17組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

通過(guò)Design-Expert 12軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行模擬分析，得到香草酸轉(zhuǎn)化率（Y）對(duì)自變量反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)pH（B）和DES添加量（C）的二次多元回歸模型：Y=83.33+3.36A－0.572 5B+6.76C－4.40AB+5.56AC－0.815 0BC－14.04A2-14.06B2－10.51C2。

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，該回歸模型的P<0.000 1，模型極顯著，失擬項(xiàng)的P>0.05，不顯著，表明該回歸模型具有極好的擬合性。模型的R2=0.995 8， RAdj2=0.990 5，表明該模型擬合度好，預(yù)測(cè)值與真實(shí)值偏差不大。單因素影響方面，反應(yīng)溫度（A）和DES添加量（C）的P值均小于0.01，表明二者對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響極顯著，其中DES添加量（C）的P<0.000 1，表明其對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響效果最顯著。反應(yīng)pH（B）的P>0.05，表明該因素對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響不顯著。因此，3個(gè)因素對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響順序?yàn)镈ES添加量（C）>反應(yīng)溫度（A）>反應(yīng)pH（B）。

2.6.2 響應(yīng)面圖分析與優(yōu)化

各因素交互作用對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率影響的等高線和響應(yīng)面見(jiàn)圖10，DES添加量與反應(yīng)pH交互的等高線接近圓形，表明對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響相對(duì)較?。环磻?yīng)溫度與反應(yīng)pH、DES添加量與反應(yīng)溫度交互的等高線為橢圓形，說(shuō)明對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響較大。同時(shí)也印證了2.4.1中的結(jié)果，香草醛脫氫酶在pH 5～8范圍內(nèi)穩(wěn)定性較強(qiáng)，在該范圍內(nèi)pH的改變對(duì)酶活的影響較小，因而對(duì)香草酸轉(zhuǎn)化率的影響較小。

2.6.3 工藝優(yōu)化與驗(yàn)證

通過(guò)觀察響應(yīng)面曲線可以看出，香草酸轉(zhuǎn)化率存在最大值，采用Design-Expert 12.0進(jìn)行最終優(yōu)化，得到香草酸轉(zhuǎn)化率最高的反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度為35.94 ℃，反應(yīng)pH為6.82，DES添加量為16.94%，在此條件下香草酸的轉(zhuǎn)化率為84.76%。為了更好地檢測(cè)結(jié)果的可信度以及考慮實(shí)際轉(zhuǎn)化過(guò)程中的操作性，將最佳轉(zhuǎn)化條件調(diào)整為反應(yīng)溫度36 ℃、反應(yīng)pH 6.8、DES添加量17%，在此條件下將上述條件進(jìn)行3次驗(yàn)證，最終得到香草酸轉(zhuǎn)化率為（84.57±0.15）%。同時(shí)在此條件下將DES添加量設(shè)置為0%，得到的香草酸轉(zhuǎn)化率為（61.29±0.37）%，轉(zhuǎn)化率提升了約40%，更加驗(yàn)證了DES的添加促進(jìn)了香草酸的轉(zhuǎn)化。

3 結(jié)論

以氯化膽堿作為氫鍵受體、1，4-丁二醇作為氫鍵供體的DES（氯化膽堿∶1，4-丁二醇為1∶3）可以有效提升香草醛脫氫酶的酶活，并且可以使酶在反應(yīng)體系內(nèi)保持較高的穩(wěn)定性。以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了DES輔助酶轉(zhuǎn)化香草醛生成香草酸的綠色催化工藝。以提高香草酸轉(zhuǎn)化率為目標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)以及響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，利用Box-Behnken和Design-Expert 12.0優(yōu)化獲得香草酸最佳轉(zhuǎn)化工藝條件為反應(yīng)溫度36 ℃、反應(yīng)pH 6.8、DES添加量17%，通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到香草酸最佳轉(zhuǎn)化率為84.57%，與理論值相比僅差0.19%。模型的可靠性驗(yàn)證以及較高的香草酸轉(zhuǎn)化率預(yù)測(cè)為香草酸的生物合成提供了一種新的可行性途徑，為未來(lái)香草酸的大規(guī)模綠色生產(chǎn)提供了重要指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：

[1]KAUR J， GULATI M， SINGH S K， et al. Discovering multifaceted role of vanillic acid beyond flavours： nutraceutical and therapeutic potential[J].Trends in Food Science & Technology，2022，122：187-200.

[2]龔玉圓.香草酸抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性及生物被膜機(jī)制研究[D].宜昌：三峽大學(xué)，2022.

[3]ALI W I， AL-ABBASY O Y， YOUNIS S A. Vanillic acid： an antioxidant used in preventing browning process in pear （Pyrus communis L.） juice[J].Annals of the Romanian Society for Cell Biology，2021，25（3）：5272-5285.

[4]SHARMA N， KHURANA N， MUTHURAMAN A， et al. Pharmacological evaluation of vanillic acid in rotenone-induced Parkinson's disease rat model[J].European Journal of Pharmacology，2021，903（12）：174112.

[5]JUNG Y， PARK J， KIM H L， et al.Vanillic acid attenuates testosterone-induced benign prostatic hyperplasia in rats and inhibits proliferation of prostatic epithelial cells[J].Oncotarget，2017，8（50）：87194-87208.

[6]錢(qián)偉.一種香草酸連續(xù)化生產(chǎn)設(shè)備及生產(chǎn)方法：中國(guó)，CN108129298A[P].2018-06-08.

[7]LUDWIKOWSKI T M， WAGNER A O， MARGESIN R. Bioconversion of ferulic acid and vanillin to vanillic acid by cold-adapted Paraburkholderia aromaticivorans AR20-38： impact of culture conditions[J].Annals of Microbiology，2023，73（1）：1-17.

[8]KHOYRATTY S， KODJA H， VERPOORTE R. Vanilla flavor production methods： a review[J].Industrial Crops and Products，2018，125：433-442.

[9]ASHENGROPH M， NAHVI I， ZARKESH-ESFAHANI H， et al. Novel strain of Bacillus licheniformis SHL1 with potential converting ferulic acid into vanillic acid[J].Annals of Microbiology，2012，62（2）：553-558.

[10]李金濤，張明祖，何金林，等.低共熔溶劑在高分子合成中的應(yīng)用[J].化學(xué)進(jìn)展，2022，34（10）：2159-2172.

[11]李凌娜，楊繼威，張麗芬，等.響應(yīng)面法優(yōu)化低共熔溶劑提取迷迭香中迷迭香酸和鼠尾草酸的工藝[J].食品工業(yè)科技，2023，44（16）：218-227.

[12]SHANG X， DOU Y， ZHANG Y， et al. Tailor-made natural deep eutectic solvents for green extraction of isoflavones from chickpea （Cicer arietinum L.） sprouts[J].Industrial Crops and Products，2019，140：111724.

[13]LIN J J， XIANG H， SUN-WATERHOUSE D X， et al. Deep eutectic solvents and alkaline extraction of protein from seabuckthorn seed meal： a comparison study[J].Food Science and Human Wellness，2022，11（4）：1028-1035.

[14]李利芬.基于氯化膽堿低共熔溶劑的木質(zhì)素提取改性和降解研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2015.

[15]劉乾靜，陳曉淼，王芷，等.低共熔溶劑預(yù)處理?xiàng)钅舅庠鸾饽举|(zhì)素[J].化工進(jìn)展，2022，41（10）：5612-5618.

[16]仝爭(zhēng)，王渝，何曉希，等.低共熔溶劑在生物催化中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].化學(xué)試劑，2022，44（12）：1723-1730.

[17]GORKE J， KAZLAUSKAS S R. Toward advanced ionic liquids. Polar， enzyme-friendly solvents for biocatalysis[J].Biotechnology & Bioprocess Engineering，2010，15（1）：40-53.

[18]DANESHJOU S， KHODAVERDIAN S， DABIRMANESH B， et al. Improvement of chondroitinases ABCI stability in natural deep eutectic solvents[J].Journal of Molecular Liquids，2017，227：21-25.

[19]XU P， CHENG J， LOU W Y， et al. Using deep eutectic solvents to improve the resolution of racemic 1-（4-methoxyphenyl）ethanol through Acetobacter sp. CCTCC M209061 cell-mediated asymmetric oxidation[J].RSC Advances，2014，5（9）：6357-6364.

[20]徐萬(wàn)軍.低共熔溶劑輔助糖苷酶轉(zhuǎn)化黃酮苷的研究[D].重慶：重慶大學(xué)，2019.

[21]LINDBERG D， REVENGA M D L F， WIDERSTEN M. Deep eutectic solvents （DESs） are viable cosolvents for enzyme-catalyzed epoxide hydrolysis[J].Journal of Biotechnology，2010，147（3-4）：169-171.

[22]ZHAO K H， CAI Y Z， LIN X S， et al. Enzymatic synthesis of glucose-based fatty acid esters in bisolvent systems containing ionic liquids or deep eutectic solvents[J].Molecules，2016，21（10）：1294.

[23]ZHU D， XU L， SETHUPATHY S， et al. Decoding lignin valorization pathways in the extremophilic Bacillus ligniniphilus L1 for vanillin biosynthesis[J].Green Chemistry，2021，23：9554-9570.

[24]司海兵.嗜堿耐鹽菌Bacillus ligniniphilus L1解聚木質(zhì)素生成香草酸的代謝途徑解析[D].鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2020.

[25]張雪瑩.睪丸酮叢毛單胞菌醛脫氫酶的挖掘、性質(zhì)及其催化呋喃醛選擇性氧化的研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2019.

[26]王艷玲，陳小燕，余強(qiáng)，等.低共熔溶劑在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用[J].新能源進(jìn)展，2021，9（3）：211-217.

[27]YANG Z， PAN W. Ionic liquids： green solvents for nonaqueous biocatalysis[J].Enzyme & Microbial Technology，2005，37：19-28.

[28]WAITE S L， LI H， PAGE A J. NO2 solvation structure in choline chloride deep eutectic solvents-the role of the hydrogen bond donor[J].Journal of Physical Chemistry B，2018，122（15）：4336-4344.

[29]XU W J， HUANG Y K， LI F， et al. Improving β-glucosidase biocatalysis with deep eutectic solvents based on choline chloride[J].Biochemical Engineering Journal，2018，138：37-46.

[30]KOTOGN A， KECSKEMTI A， SZEKERES A， et al. Characterization of transesterification reactions by Mucoromycotina lipases in non-aqueous media[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2016，127：47-55.

[31]YANTA H， BELL E. The linkage between citrate， pH regulation and protein folding in glyoxysomal malate dehydrogenase[J].The FASEB Journal，2012，26（S1）：581.

[32]JUNEIDI I， HAYYAN M， HASHIM M A， et al. Pure and aqueous deep eutectic solvents for a lipase-catalysed hydrolysis reaction[J].Biochemical Engineering Journal，2017，117：129-138.