天然木質纖維中五碳糖轉化技術

馬崇敬++徐丹丹++趙曉龍++殷博++單佳玉++原韜

摘 要：天然木質纖維原料在世界范圍擁有極高的產量，是轉化生產天然綠色能源物質的理想底物。但木質纖維降解后成分復雜，特別是其中富含的五碳糖成分，很難被生物轉化菌種充分利用，定向轉化為某種單一產物。該文綜述了五碳糖的來源、含量以及在生物轉化過程中的利用價值，概述了能夠利用五碳糖轉化乙醇的微生物種類，歸納了五碳糖轉化的生物學途徑和改造方法，并簡要介紹了由木質纖維原料降解產生五碳糖和高效利用五碳糖及五、六碳糖混合物進行轉化研究方面的科技進展。

關鍵詞：天然木質纖維 五碳糖 生物轉化

中圖分類號：TS262.2 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2014）06（c）-0044-01

目前，發(fā)酵法生產的燃料乙醇是公認的較為理想的清潔新能源轉化方式。巴西、美國、歐盟等國家紛紛提高乙醇在燃油中的添加量，提高新的能源在燃料中的組成比例。我國同樣面臨能源緊缺和能源安全問題，在眾多糧食作物的副產品及眾多非糧作物中，富含大量的木質纖維產物，而這些木質纖維又是由五、六碳糖構成，因此，如何高效利用農副產品廢料、和天然木質纖維原料降解轉化生產清潔能源就成了科研工作面對的巨大挑戰(zhàn)。

1 木質纖維和五碳糖

木質纖維是大量存在于自然界中的碳水化合物，在木質纖維作物中，纖維素的存在方式是晶體束形式，由半纖維素及木質素復形成的外殼包裹，這種外殼能夠保護植物細胞[1]。目前能夠人工純培養(yǎng)的微生物多數(shù)能夠轉化產出乙醇的微生物可以高效利用六碳糖，其中葡萄糖是最容易被利用的碳源，葡萄糖首先由糖酵解途徑或ED途徑轉化為丙酮酸，丙酮酸通過丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶轉化成為乙醇。

木質纖維中的五碳糖的轉化以木糖轉化為主，野生型釀酒酵母無法利用木糖轉化生產乙醇，因為其體內因缺少能夠將木糖轉化為乙醇合成關鍵中間產物木酮糖的酶系。因此，木糖轉化為木酮糖步驟是實現(xiàn)木糖轉化乙醇的關鍵環(huán)節(jié)。真菌中木糖能夠在木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的催化下轉化為木酮糖，細菌中木糖能夠在木糖異構酶的催化下轉化為木酮糖[2]。當木糖在生物體內轉化為木酮糖后，木酮糖激酶將木酮糖磷酸化為5-磷酸木酮糖，經過轉醛醇酶及轉酮醇酶的共同作用，5-磷酸木酮糖將進而被轉化為甘油醛-3-磷酸及葡萄糖-6-磷酸，然后轉入磷酸戊糖途徑經丙酮酸脫羧轉化為乙醇[3]。

對現(xiàn)有菌種的改造，目前的研究主要通過兩種方法實現(xiàn)：一種是向酵母等高效利用六碳糖的菌種中導入五碳糖代謝途徑；第二種是向混合糖利用能力強，但目的產物產量低的菌種中導入增強代謝通路轉化的關鍵基因。

2 五碳糖菌株改造方法

在這里介紹幾種目前改造菌株較為常用的技術。在五碳糖轉化的研究中，通常使用能夠高效生產乙醇的微生物作為菌株改造的目標，包括酵母菌、運動發(fā)酵單胞菌這樣的菌株，都能以六碳糖作為底物轉化生產乙醇，但無法高效利用五碳糖，因此需要導入五碳糖轉化通路，構建工程菌株[4]。對于能夠轉化混合糖的菌株，如大腸桿菌，由于缺少丙酮酸脫羧酶，且乙醇脫氫酶Ⅱ活性低，因此它們轉化產出乙醇效率則相對較低。這就需要向菌株中導入增大乙醇產出代謝通路的關鍵酶。目前，多數(shù)以大腸桿菌為研究目標的基因工程改造工作都是以質粒作為基因載體，但質粒的遺傳穩(wěn)定性較差，在保藏過程中經常出現(xiàn)丟失等問題，不易于獲得乙醇高產菌株。另外一種常用技術是原生質體融合技術，該技術通過將兩個遺傳性狀不同的細胞融合重組產生一個新細胞，使兩親本株基因融合并產生基因重組并獲得新的性狀的一種技術[5]。原生質體融合技術可在不同種屬間開展，通過不同的生物體細胞融合，達到改造細胞遺傳性狀的目的，并賦予酵母菌代謝五碳糖的能力。

3 轉化產物中的數(shù)據(jù)獲得方法

培養(yǎng)基中葡萄糖含量的測定方法較多，當以葡萄糖作為單一碳源時，發(fā)酵液中葡萄糖含量測定方法通常采用3，5-二硝基水楊酸比色法。在堿性條件下，當葡萄糖與3，5-二硝基水楊酸共熱時，葡萄糖被氧化成產生糖酸等化合物，3，5-二硝基水楊酸發(fā)生還原反應，產物3-氨基-5-硝基水楊酸呈棕紅色。葡萄糖的含量與產物中棕紅色物質成比例關系，這時，可在520 nm波長下測棕紅色物質吸光值，再根據(jù)吸光值標準曲線計算樣品中葡萄糖含量。

測定發(fā)酵液中木糖含量時，同樣利用3，5-二硝基水楊酸比色法。當培養(yǎng)基為葡萄糖與混合糖按比例配置時，可利用葡萄糖試劑盒檢測混合糖發(fā)酵液中葡萄糖的含量，在采用比色法測定總還原糖吸光度值，繪制比色法的葡萄糖標準曲線，之后對發(fā)酵液中葡萄糖含量加以換算，用總還原糖吸光值減去葡萄糖的部分，就可以獲得混合糖中的木糖吸光值，然后繪制的木糖的標線，計算出木糖的含量。

發(fā)酵液中目的產物含量可以通過多種方法獲得，以乙醇為例，乙醇含量可以通過重鉻酸鉀比色法獲得，也可以利用高效液相色譜和氣相色譜法獲得，同時，目前市場上也有多種試劑盒用來測定發(fā)酵液中的乙醇含量[6]。其中，高效液相色譜被廣大科研工作者廣泛認可。

4 結語

目前很多研究工作的重點為通過對五碳糖菌株的改造，以期望得到具有高效轉化五碳糖途徑的工程菌株。在這些研究過程中，人們往往只是通過定向基因導入，替代或敲除等技術單純的改變細胞的某一代謝途徑，而無法做到從整體上來調控細胞的代謝平衡。因此，對于目前的研究現(xiàn)狀，還有很多工作等待著科研工作者去完成。

參考文獻

[1] 許玫英，郭俊，岑英華，等.染料的生物降解研究[J].微生物學通報，2006，33（1）：138-143.

[2] 路鵬，江滔，李國學.木質纖維素乙醇發(fā)酵研究中的關鍵點及解決方案[J].農業(yè)工程學報，2006，22（9）：237，240.

[3] 李祖明，李鴻玉，歷重先，等.纖維素酶轉化木質纖維素生物質生產乙醇的研究進展[J].農業(yè)工程技術（新能源產業(yè)），2008（2）：28.

[4] 張強，冀偉，王一東.五碳糖和六碳糖共發(fā)酵生產酒精菌株選育的研究進展[J].化工進展，2013（1）.

[5] 湯斌，周逢云，張慶慶，等.Candida shehatae的純化及其利用木糖和葡萄糖發(fā)酵的特性研究[J].食品科學，2009，30（3）：159-162.

[6] Richard AK.The next oil crisis looms large and perhaps close[J].Science，l998（8l）：l 128-113l.endprint