離子締合褪色反應(yīng)分光光度法測定甜味劑甘草酸的含量

儲文 田美 黃佃宇 馬衛(wèi)興

摘要：基于甘草酸二銨與三苯甲烷類陽離子染料乙基紫發(fā)生離子締合反應(yīng)，首次提出離子締合褪色反應(yīng)分光光度法間接測定甜味劑甘草酸含量的新方法。在pH 8.6的Clark-Lubs緩沖溶液中，甘草酸二銨與乙基紫發(fā)生離子締合反應(yīng)，生成的離子締合物使溶液顯著褪色，褪色的最大吸收波長在594 nm處，據(jù)此建立了間接測定甘草酸的分析方法。結(jié)果顯示，甘草酸二銨的濃度在3.00～12.00 mg/L之間與吸光度差值ΔA呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，檢出限為0.46 mg/L，表觀摩爾吸光系數(shù)為3.20×104 L/（mol·cm）。方法成功用于市售涼茶樣品的含量測定，加標(biāo)平均回收率為97.11%～101.0%，測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.59%～3.23%（n=5）。該法靈敏度高、專屬性強、省時簡便，可用于實際樣品分析。

關(guān)鍵詞：甘草酸；乙基紫；褪色分光光度法；含量測定；離子締合反應(yīng)

中圖分類號：TS202.3????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2024）02-0147-05

Determination of Sweetener Glycyrrhizic Acid Content by Ion Association Fading Reaction Spectrophotometry

Abstract： Based on the ion association reaction between diammonium glycyrrhizinate and triphenylmethane cationic dye ethyl violet， a new method for the indirect determination of sweetener glycyrrhizic acid content by ionic association fading reaction spectrophotometry is proposed for the first time. In a Clark-Lubs buffer solution with pH 8.6， there is an ionic association reaction between diammonium glycyrrhizinate and ethyl violet， and the generated ion association compounds significantly fade the solution. The maximum absorption wavelength for fading is at 594 nm， and an indirect determination method for glycyrrhetinic acid has been established based on this. The results show that the concentration of diammonium glycyrrhizinate has a good linear relationship with the absorbance difference ΔA between 3.00 mg/L and 12.00 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 5， the detection limit of 0.46 mg/L and the apparent molar absorbance coefficient of 3.20×104 L/（mol·cm）. The method is successfully used for the determination of the content of commercially available herbal tea samples with the average spiked recovery rate of 97.11%～101.0% and the relative standard deviation （RSD） of the measured value of 0.59%～3.23% （n=5）. This method has high sensitivity， strong specificity， is time-saving and convenient， and can be used for actual sample analysis.

Key words： glycyrrhizic acid; ethyl violet; fading spectrophotometry; content determination; ion association reaction

甘草在古希臘語中被稱為“甜根”，其產(chǎn)生甜味的主要成分是甘草酸（glycyrrhizic acid）[1]，即甘草甜素，其在植物組織中的含量在一年中的不同時間段有顯著差異[2]。甘草酸是一種三萜皂苷[3]，具有護(hù)肝、抗炎、解毒、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[4-8]。除此之外，它還是一種高甜度、低熱量、安全無毒的非能量型天然甜味劑[9]，其甜度約是蔗糖的170倍[10]，可作為醬油、豆醬、腌制品、風(fēng)味食品、飲料、冷凍甜食等的矯味劑[11]，使食品的口感更柔和，后味更醇香，是適合高血壓、糖尿病等患者食用的最理想的甜味劑[12]。

目前測定甘草酸含量的方法主要有高效液相色譜法[13-15]、反相高效液相色譜法[16]、近紅外光譜法[17-18]、高速逆流色譜法[19]、液相質(zhì)譜聯(lián)用法[20]等，這些方法大多需要昂貴的精密儀器且前處理方法較復(fù)雜，更加繁瑣耗時。因此，開發(fā)一種簡單、快速、靈敏的方法用于測定甘草酸的含量具有重要意義。可見分光光度法由于操作便捷、選擇性好、測定快速而被廣泛應(yīng)用。由于甘草酸的銨鹽即甘草酸二銨（diammonium glycyrrhizinate）的穩(wěn)定性和生物活性均優(yōu)于傳統(tǒng)的甘草酸[21]，因此本研究利用甘草酸二銨與三苯甲烷類陽離子染料乙基紫（ethyl violet）在pH 8.6的Clark-Lubs緩沖溶液中發(fā)生離子締合反應(yīng)，生成的離子締合物能使溶液顯著褪色，且一定濃度范圍的甘草酸二銨與體系褪色程度呈線性關(guān)系，建立了褪色分光光度法間接測定甘草酸含量的新方法，并成功將其應(yīng)用于市售涼茶飲料的樣品分析，相關(guān)研究尚未見文獻(xiàn)報道。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

752N型紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；BS210S型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；PHS-3D型酸度計 上海高致精密儀器有限公司。

甘草酸二銨（江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司）標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 mg/L，稱取0.100 0 g甘草酸二銨于燒杯中，用水溶解并置于1 L容量瓶中，定容搖勻，得到100 mg/L甘草酸二銨標(biāo)準(zhǔn)溶液（每1 mg甘草酸二銨折合甘草酸為0.960 3 mg）。

乙基紫（上海麥克林生化科技股份有限公司）溶液：5×10-4 mol/L，稱取0.246 0 g乙基紫于燒杯中，用水溶解并置于1 L容量瓶中，定容搖勻，得到濃度為5×10-4 mol/L的乙基紫標(biāo)準(zhǔn)溶液。

Clark-Lubs緩沖溶液：pH 8.2～9.2，用濃度均為0.20 mol/L的硼酸溶液和氫氧化鈉溶液按一定比例混合配制，并用酸度計校準(zhǔn)。

所有試劑均為分析純，試驗用水為超純水。

市售清涼茶、王老吉涼茶、涼茶。

1.2 試驗方法

在10 mL具塞比色管中加入適量濃度為100 mg/L的甘草酸二銨標(biāo)準(zhǔn)溶液或測定溶液，再依次加入1.00 mL pH 8.6的Clark-Lubs緩沖溶液、0.70 mL 5×10-4 mol/L的乙基紫溶液，用水定容至刻度并搖勻，得到測定溶液A1；另配制空白溶液A0 （1.00 mL pH 8.6的Clark-Lubs緩沖溶液、0.70 mL 5×10-4 mol/L的乙基紫溶液，用水定容至刻度并搖勻）。靜置10 min后將其分別置于1 cm石英比色皿中，以超純水作參比，波長調(diào)至594 nm，測定A0和A1的吸光度，并計算吸光度差值ΔA=A0 -A1。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收光譜

按照1.2試驗方法分別掃描500～660 nm范圍內(nèi)的可見吸收光譜，見圖1。

由圖1可知，試劑空白（曲線1）和測定溶液（曲線2）的最大吸收波長均位于580 nm處，該反應(yīng)是典型的褪色反應(yīng)，褪色的最大吸收波長位于594 nm處（曲線3），對比度為14 nm。在pH 8.6的Clark-Lubs緩沖介質(zhì)中，甘草酸根陰離子與乙基紫陽離子依靠靜電引力結(jié)合形成離子締合物，該締合物的形成使體系顯著褪色，其本質(zhì)是甘草酸二銨與乙基紫發(fā)生離子締合反應(yīng)，且甘草酸二銨在一定濃度范圍內(nèi)與體系褪色程度呈線性關(guān)系，故選擇594 nm作為測定波長。

2.2 體系酸度的選擇

試驗考察了室溫下594 nm處不同pH的Clark-Lubs緩沖溶液對體系ΔA的影響。準(zhǔn)確移取1.00 mL pH 7.6～9.2范圍內(nèi)的Clark-Lubs緩沖溶液，按照1.2試驗方法，依次對其進(jìn)行吸光度測定，平行測定3次，作ΔA-pH曲線，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在pH 8.6時，ΔA最大，增大或減小pH值，ΔA均有所減小，因此選擇pH 8.6的Clark-Lubs緩沖溶液進(jìn)一步試驗。

2.3 緩沖溶液用量的選擇

試驗考察了室溫下594 nm處pH 8.6的Clark-Lubs緩沖溶液用量對體系ΔA的影響，準(zhǔn)確移取0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 mL pH 8.6的Clark-Lubs緩沖溶液，按照1.2試驗方法，依次對其進(jìn)行吸光度測定，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，Clark-Lubs緩沖溶液用量對體系ΔA的影響不大，曲線較平穩(wěn)，在0.50～3.00 mL范圍內(nèi)幾乎不變，說明生成的產(chǎn)物不受緩沖溶液用量的影響，綜合考慮，試驗選擇1.00 mL Clark-Lubs緩沖溶液作為最佳用量。

2.4 顯色劑用量的選擇

試驗考察了室溫下594 nm處乙基紫溶液用量對體系ΔA的影響。乙基紫溶液作為整個體系中最重要的反應(yīng)試劑，決定著整個體系反應(yīng)的進(jìn)行，因此其用量對體系有著重要的影響。加入不同體積（0.20～1.10 mL）濃度為5×10-4 mol/L的乙基紫溶液，按照1.2試驗方法，依次對其進(jìn)行吸光度測定，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)乙基紫溶液用量為0.70 mL時，ΔA最大，增加或減少乙基紫溶液用量，ΔA均有所減小，故選擇0.70 mL乙基紫溶液為最佳用量。

2.5 試劑加入順序的選擇

試驗考察了室溫下594 nm處1.00 mL甘草酸二銨標(biāo)準(zhǔn)溶液、0.70 mL乙基紫溶液及1.00 mL pH 8.6 Clark-Lubs緩沖溶液加入順序不同時對體系ΔA的影響。固定其他試驗條件，設(shè)計不同試劑的加入順序，分別測定其吸光度，并計算ΔA。當(dāng)加入順序為甘草酸二銨標(biāo)準(zhǔn)溶液、Clark-Lubs緩沖溶液、乙基紫溶液時，體系的ΔA相對較大，靈敏度較高，因此本試驗選用此順序作為最佳試驗順序。

2.6 放置時間的選擇

試驗考察了室溫下594 nm處反應(yīng)時間對體系ΔA的影響，反應(yīng)時間為0～60 min。通過有規(guī)律的時間間隔對測定溶液和空白溶液進(jìn)行測定，作ΔA-反應(yīng)時間曲線，見圖5。

由圖5可知，在pH 8.6 Clark-Lubs緩沖溶液中，甘草酸二銨與乙基紫的離子締合反應(yīng)十分迅速，在10 min內(nèi)反應(yīng)完全，ΔA最大，10 min后，ΔA有明顯下降趨勢，因此選擇10 min進(jìn)行測定。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

依照上述選定的最佳條件，準(zhǔn)確移取不同體積的濃度為100 mg/L的甘草酸二銨標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2試驗方法，以甘草酸二銨標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C（mg/L）為橫坐標(biāo)，ΔA為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖6。

由圖6可知，甘草酸二銨溶液濃度在3.00～12.00 mg/L范圍內(nèi)時與ΔA呈線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔA=0.037 3C+0.129 6，R=0.999 5，表觀摩爾吸光系數(shù)為3.20×104 L/（mol·cm）。

以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（s）與斜率（k）的比值計算檢出限（3s/k），檢出限為0.46 mg/L。

2.8 精密度試驗

在10 mL具塞比色管中依次加入0.80 mL甘草酸二銨、1.00 mL pH 8.6的Clark-Lubs緩沖溶液、0.70 mL 5×10-4 mol/L的乙基紫溶液，按照1.2試驗方法，對測定液的吸光度重復(fù)測試10次，以試劑空白作參比，分析結(jié)果見表1。

由表1可知，回收率在97.32%～101.7%之間，平均回收率為99.43%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.53%，具有良好的精密度。

2.9 干擾試驗

室溫下溶液中會存在許多共存物質(zhì)，如氨基酸、降解物質(zhì)、輔料等，這些物質(zhì)可能會對本試驗造成干擾。本試驗在最佳試驗條件下考察了一些常見物質(zhì)對甘草酸二銨測定的影響，結(jié)果見表2。

表2 干擾試驗結(jié)果

由表2可知，測定誤差均在±5%以內(nèi)，說明常見的干擾物質(zhì)對體系基本不構(gòu)成干擾。

2.10 樣品分析

精密量取已知含甘草酸的清涼茶1#、王老吉涼茶2#及涼茶3#樣品溶液各6 mL置于10 mL比色管中，按1.2試驗方法測定吸光度，根據(jù)線性回歸方程求出甘草酸二銨的含量，再進(jìn)一步求出涼茶樣品溶液中甘草酸的含量（每1 mg甘草酸二銨折合甘草酸為0.960 3 mg），每種涼茶樣品各平行測定5份。同時加入低、中、高3個質(zhì)量濃度的甘草酸二銨標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗（n=5），結(jié)果見表3。

由表3可知，方法的平均加標(biāo)回收率為97.11%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.59%～3.23%，說明本方法有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

3 機理探究

經(jīng)條件優(yōu)化后，測得甘草酸二銨（分子式：C42H68N2O16）與乙基紫（分子式：C31H42N3Cl）反應(yīng)的物質(zhì)的量比為1∶3。在pH 8.6的Clark-Lubs緩沖溶液中，甘草酸二銨主要以甘草酸根陰離子的形式存在。1個帶3個負(fù)電荷的甘草酸根陰離子與3個帶正電荷的乙基紫陽離子通過靜電引力結(jié)合形成離子締合物，反應(yīng)機理見圖7。

由圖7可知，隨著甘草酸二銨濃度的增加，體系褪色愈發(fā)明顯，ΔA逐漸增大，且甘草酸二銨的濃度在一定范圍內(nèi)與體系褪色程度呈線性關(guān)系，據(jù)此建立乙基紫可見分光光度法間接測定甘草酸的含量。

4 結(jié)論

本研究以乙基紫褪色分光光度法間接對甘草酸含量的影響因素進(jìn)行考察和優(yōu)化。在弱堿性環(huán)境中，甘草酸二銨與乙基紫形成離子締合物，該離子締合物在594 nm處產(chǎn)生褪色的最大吸收波長，且吸光度與甘草酸二銨的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，據(jù)此建立了間接測定甘草酸含量的新方法。該方法專屬性強、準(zhǔn)確度高、有較寬的線性范圍和良好的選擇性，并成功應(yīng)用于市售涼茶飲料中甘草酸含量的測定，有助于生產(chǎn)過程中相關(guān)甜味劑的質(zhì)量控制分析。

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