高效液相色譜熒光檢測器法快速測定水果中乙氧基喹啉殘留量研究

周志杰　程雪　韓東明

摘 要：建立了高效液相色譜儀串聯(lián)熒光檢測器測定蘋果、梨樣品中乙氧基喹啉殘留量的方法。水果樣品加入抗壞血酸后進(jìn)行混合勻漿制樣，向樣品中加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液，在堿性條件下經(jīng)正己烷進(jìn)行3次提取，合并提取液氮吹至干，用含有抗壞血酸的乙腈復(fù)溶，采用液相色譜熒光檢測器法上機(jī)測定，外標(biāo)法定量。熒光檢測器激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長435 nm，流動(dòng)相采用乙腈∶水=65∶35。結(jié)果表明，本方法在2.00～200.00 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性方程為Y=1.06×104X-1.74×103，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 97。在0.02 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、1.00 mg·kg-1 3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)，并進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，回收率在81.09%～86.43%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.18%～3.09%。本方法簡單快速，提取效率高，儀器靈敏度高，準(zhǔn)確度和重復(fù)性良好，可用于水果中乙氧基喹啉殘留量的測定。

關(guān)鍵詞：乙氧基喹啉；熒光檢測器；水果

Rapid Determination of Ethoxyquin Residues in Fruits by High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detector

ZHOU Zhijie， CHENG Xue， HAN Dongming

（Food and Drug Inspection and Testing Center of Jinan， Jinan 250000， China）

Abstract： To establish a method for the determination of residual ethoxyquin in apple and pear samples by high performance liquid chromatograph tandem fluorescence detector. The fruit samples were mixed with ascorbic acid and homogenized for sample preparation. 0.1 mol·L-1 sodium hydroxide solution was added to the samples. The samples were extracted by n-hexane for three times under alkaline conditions， and the liquid nitrogen was extracted and blown to dry. Dissolve with acetonitrile containing ascorbic acid， use liquid chromatography fluorescence detector method for machine measurement， and use external standard method for quantification. The excitation wavelength of fluorescence detector is 365 nm， the emission wavelength is 435 nm， and the mobile phase is acetonitrile∶water = 65∶35. The results showed that the method presented a good linear relationship in the concentration range of 2.00～200.00 ng·mL-1， the linear equation was Y=1.06×104X-1.74×103， and the correlation coefficient （r） was 0.999 97. Three concentration levels of

0.02 mg·kg-1， 0.20 mg·kg-1 and 1.00 mg·kg-1 were added， and six parallel experiments were carried out. The recoveries were 81.09%～86.43%， and the relative standard deviations （RSD） were 1.18%～3.09%. The method is simple and rapid， has high extraction efficiency， high instrument sensitivity， good accuracy and repeatability， and can be used for the determination of ethoxyquin residues in fruits.

Keywords： ethoxyquin; fluorescence detector; fruit

乙氧基喹啉又名虎皮靈、山道喹，是一種在飼料、食品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的抗氧化劑。在飼料中添加可以防止飼料中維生素、蛋白質(zhì)、脂肪的氧化或變性，從而起到防霉作用[1-3]；作為果蔬保鮮劑使用時(shí)，常用在梨類水果、蘋果等的表面，或加到果蔬包裝紙、紙箱中，通過熏蒸起到保鮮作用，對蘋果虎皮病、梨的黑皮病等有較好防治作用[4-5]。

乙氧基喹啉（Ethoxyquin，EQ）化學(xué)名稱為6-乙氧基-2，2，4-三甲基-1，2-二氫化喹啉，通過清除自由基中斷氧化過程來發(fā)揮抗氧化作用，作為一種成本低且效果穩(wěn)定的抗氧化劑，其對維生素保護(hù)效果較好[6]。但隨著人們對食品安全關(guān)注度的持續(xù)提升，近年來各國對乙氧基喹啉的危害性評(píng)估審查持續(xù)進(jìn)行。2017年歐盟暫停乙氧基喹啉在飼料中使用，并于2022年通過2022/1375號(hào)法規(guī)，全面禁用乙氧基喹啉作為飼料添加劑，并且禁止進(jìn)口任何投喂過含該物質(zhì)飼料的農(nóng)產(chǎn)品。韓國食品和藥品安全部（Ministry of Food and Drug Safety，MFDS）對水產(chǎn)品中乙氧基喹啉和二聚乙氧基喹啉也設(shè)置了最大殘留限量（甲殼類0.2 mg·kg-1，魚類0.1 mg·kg-1），并要求于2022年7月1日起對進(jìn)口魚類水產(chǎn)品中乙氧基喹啉進(jìn)行檢查[7]。乙氧基喹啉通常以對氨基苯乙醚和丙酮作為原料進(jìn)行合成，研究表明產(chǎn)物中的對氨基苯乙醚殘留可能存在致癌風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)乙氧基喹啉的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物乙氧基醌亞銨（Ethoxyquin Quinone Imine，EQI）可能存在致畸、致突變等風(fēng)險(xiǎn)[8-10]；也有研究表明乙氧基喹啉在飼料中應(yīng)用會(huì)影響魚類代謝和體內(nèi)微生物多樣性，并在水體中富集對環(huán)境微生物群落造成一定影響，可能對消費(fèi)者產(chǎn)生次級(jí)生物危害[11-12]。乙氧基喹啉在飼料產(chǎn)品和水果中的廣泛使用，都會(huì)造成乙氧基喹啉在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留，最終對人體造成一定隱患和影響。

目前根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014），我國對乙氧基喹啉的限量規(guī)定為在經(jīng)表面處理的鮮水果中最高殘留限量為

1 mg·kg-1。乙氧基喹啉常見的檢驗(yàn)方法包括高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[13-16]、氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）[17-18]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer，LC-MS）[19-20]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）[21-22]等。LC-MS、GC-MS檢測方法雖然有靈敏度高、定性準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但儀器維護(hù)成本高，使用條件要求相對復(fù)雜，使用液相色譜可實(shí)現(xiàn)對乙氧基喹啉的快速定量分析，結(jié)果準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性良好。高效液相色譜可與紫外檢測器（Ultraviolet Detector，UV）、二極管陣列檢測器（Diode Array Detector，DAD）、熒光檢測器（Fluorescence Detector，F(xiàn)LD）串聯(lián)，實(shí)現(xiàn)對不同性質(zhì)化合物的檢測分析，通常熒光檢測器靈敏度高于紫外檢測器，因此選擇高效液相色譜與熒光檢測器結(jié)合使用[23]。

本研究選取蘋果和梨兩種基質(zhì)，建立了高效液相色譜熒光檢測器法測定水果中乙氧基喹啉的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，應(yīng)用于水果樣品檢測的同時(shí)，也為進(jìn)一步監(jiān)測其他種類食品中乙氧基喹啉的殘留情況提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果、梨樣品均購于超市。

抗壞血酸、氫氧化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈、正己烷（色譜純，F(xiàn)isher）；乙氧基喹啉標(biāo)準(zhǔn)溶液（CAS號(hào)：91-53-2，100 μg·mL-1，擴(kuò)展不確定度3%，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀（配有熒光檢測器）；WS-100D振蕩器（北京Wiggens公司）；3K15離心機(jī)（10 000 r·min-1，德國Sigma公司）；24位N-EVAP氮吹儀（可控溫，美國Organomation公司）；AR2140萬分之一電子天平（上海奧豪斯公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

取500 g水果樣品可食部分，加入10 g抗壞血酸，用組織搗碎機(jī)粉碎混勻至漿狀，樣品裝入潔凈容器中，密封，最好現(xiàn)制現(xiàn)測，若無法立即測定，則放置于-18 ℃冷凍避光保存，盡快測定。

1.3.2 試樣提取

稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液5 mL，渦旋30 s混勻，加入8 mL正己烷，渦旋5 s，振蕩提取10 min，8 000 r·min-1常溫離心5 min，將正己烷層轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，繼續(xù)按上述步驟將殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并3次正己烷層于同一容量瓶中，加正己烷定容至刻度，混勻。

吸取5.0 mL正己烷提取液，于30 ℃下氮吹至近干，迅速加入含抗壞血酸的乙腈溶液5.0 mL，渦旋混勻30 s，經(jīng)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，得待測液上機(jī)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確量取100 μL乙氧基喹啉標(biāo)準(zhǔn)溶液

（100 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中，用含抗壞血酸的乙腈溶液溶解并定容至刻度，混勻得1 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，轉(zhuǎn)移至棕色玻璃容器中，-18 ℃保存，取適量上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用含抗壞血酸的乙腈稀釋成2.00 ng·mL-1、4.00 ng·mL-1、10.00 ng·mL-1、20.00 ng·mL-1、50.00 ng·mL-1、100.00 ng·mL-1和200.00 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 儀器條件

色譜條件：Waters Symmetry C18液相色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；熒光檢測器激發(fā)波長：365 nm；發(fā)射波長：435 nm；流動(dòng)相：乙腈+水=65+35；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化劑的選擇

乙氧基喹啉通過清除自由基起到抗氧化和保鮮作用，而蘋果和梨切開后容易迅速氧化。在加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，對直接勻漿處理的蘋果和梨樣品加入乙氧基喹啉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行提取，上機(jī)測試回收率均低于20%，且樣品制備后與空氣接觸，24 h內(nèi)變?yōu)楹稚?，說明蘋果和梨氧化產(chǎn)生的自由基與乙氧基喹啉發(fā)生了反應(yīng)[24]；在樣品制備過程加入抗壞血酸后，回收率顯著提升在70%以上，因此選擇抗壞血酸作為抗氧化劑。隨著樣品制備后保存時(shí)間的延長，樣品回收率呈下降趨勢，在樣品制備后約一周內(nèi)回收率可保持在80%以上。

2.2 前處理方式選擇

樣品提取過程中，液-液萃取操作不當(dāng)會(huì)引起乳化現(xiàn)象[25]。本試驗(yàn)過程中劇烈渦旋和低溫均容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，造成無法分層，影響提取效果，故樣品加入正己烷后，渦旋時(shí)間設(shè)置為5 s，進(jìn)而選擇低頻率振蕩，以達(dá)到充分萃取，離心溫度選擇常溫離心。

2.3 提取次數(shù)選擇

提取次數(shù)、提取液體積對目標(biāo)物提取效果有一定影響，本研究進(jìn)行了10 mL正己烷提取2次和

8 mL正己烷提取3次兩種提取方式對比，結(jié)果（圖1）表明在蘋果和梨基質(zhì)中，提取2次回收率分別為72.22%、77.85%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.17%、3.48%；提取3次回收率分別為81.09%、83.25%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.18%、2.01%，表明8 mL提取液重復(fù)提取3次提取效果較好，因此選擇提取3次。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作溶液依次上機(jī)測定，以乙氧基喹啉峰面積為Y軸，以標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作溶液濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明在2.00～200.00 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性方程為Y=1.06×104X-1.74×103，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 97。

2.5 方法準(zhǔn)確度與精密度

以蘋果和梨為代表性基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，取空白樣品，定量加入0.02 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、

1.00 mg·kg-1 3個(gè)濃度水平的乙氧基喹啉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個(gè)加標(biāo)濃度做6份平行。結(jié)果（表1）可見，蘋果樣品在各加標(biāo)水平下回收率為81.09%～84.28%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.18%～2.01%，梨樣品在各加標(biāo)水平下回收率為83.21%～86.43%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.41%～3.09%，方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-熒光檢測器法測定水果中乙氧基喹啉殘留量的方法，通過對前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，提高了目標(biāo)物提取效率，且該方法儀器靈敏度高，準(zhǔn)確度好，操作簡便，滿足水果中乙氧基喹啉殘留量測定要求，也為進(jìn)一步監(jiān)測其他食品中乙氧基喹啉殘留量提供了思路。

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作者簡介：周志杰（1992—），女，山東泰安人，碩士，工程師。研究方向：食品安全檢測。