臨沂市食源性單增李斯特菌分子特征分析

高遠(yuǎn)　李濤　張曉妮

摘 要：目的：基于全基因組測(cè)序分析臨沂市食源性單增李斯特菌的毒力基因、耐藥基因攜帶情況及分子分型特征。方法：利用測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)27株食源性單增李斯特菌株進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型、毒力基因和耐藥基因分析，并構(gòu)建基于cg-SNP的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果：27株分離菌株共分為10個(gè)ST型，其中ST121為優(yōu)勢(shì)型別。27株單增李斯特菌有26株菌攜帶磷霉素（FosX）耐藥基因，占96.3%，2株菌攜帶四環(huán)素類(lèi)（tetM）和甲氧芐氨嘧啶類(lèi)（dfrG）2種耐藥基因，僅有1株菌不耐藥。27株菌出現(xiàn)兩種毒力缺失，第一種是毒力島LIPI-1缺失，缺失率為7.4%。第二種是毒力島LIPI-2中inlF單一缺失，缺失率為40.7%。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示，27株菌株距離較近，聚集于3個(gè)分支中。絕大部分菌株分離自肉制品，占74.1%（20/27）。結(jié)論：食源性單增李斯特菌存在多種耐藥基因，毒力基因分布以毒力島（LIPI-1、LIPI-2）為主，具有潛在的致病性。建議臨沂市單增李斯特菌專(zhuān)項(xiàng)監(jiān)測(cè)工作在牲畜肉制品的基礎(chǔ)上，應(yīng)加大對(duì)冷凍飲品及其乳制品原料、生禽肉類(lèi)、水果蔬菜類(lèi)樣本的監(jiān)管，進(jìn)一步降低單增李斯特菌所致食源性疾病流行風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：全基因組測(cè)序；單增李斯特菌；基因分型；毒力基因；耐藥基因

Molecular Characteristics Analysis of Foodborne Listeria monocytogenes in Linyi City

GAO Yuan， LI Tao， ZHANG Xiaoni*

（Linyi Center for Disease Control and Prevention， Linyi 276000， China）

Abstract： Objective： Based on whole genome sequencing， the virulence genes， drug resistance gene carriers and molecular typing characteristics of foodborne Listeria monocytogenes in Linyi city were analyzed. Method： Using sequencing data， 27 foodborne single-increase Listeria monocytogenes were analyzed by multi-locus sequence typing， virulence genes and drug resistance genes， and a phylogenetic tree based on cg-SNP was constructed. Result： The 27 isolated strains were divided into 10 ST types， among which ST121 was the dominant type. Among the 27 strains of Listeria monocytogenes， 26 strains carried fosfomycin （FosX） resistance genes， accounting for 96.3%， and two strains carried tetracyclines （tetM） and trimethoprim （dfrG） resistance genes， only one strain was not resistant. Two types of virulence were lost in 27 strains， the first was the virulence island LIPI-1 deletion， with a deletion rate of 7.4%. The second was a single deletion of inlF in the virulence island LIPI-2， with a deletion rate of 40.7%. Phylogenetic tree analysis showed that 27 strains were close together and clustered in 3 branches. The vast majority of the strains were isolated from meat products， accounting for 74.1% （20/27）. Conclusion： There are a variety of drug resistance genes in foodborne Listeria monocytogenes， and the distribution of virulence genes is dominated by virulence islands （LIPI-1 and LIPI-2）， which has potential pathogenicity. It is suggested that the special monitoring work of Listeria monocytogenes in Linyi city should be based on livestock meat products， and should increase the supervision of frozen beverages and their dairy raw materials， raw poultry meat， fruits and vegetables samples， further reducing the risk of foodborne diseases caused by Listeria monocytogenes.

Keywords： whole genome sequencing; Listeria monocytogenes; genotyping; virulence gene; resistance gene

單增李斯特菌是一種引起人類(lèi)李斯特菌病的常見(jiàn)食源性致病菌，相關(guān)文獻(xiàn)表明單增李斯特菌感染通常與受污染的食物有關(guān)[1]，并廣泛存在于多種食物中，如生肉、即食食物、牛奶、蔬菜、冰淇淋和水產(chǎn)品等[2]。李斯特菌病臨床表現(xiàn)包括敗血癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，妊娠相關(guān)李斯特菌病可導(dǎo)致早產(chǎn)、流產(chǎn)或死產(chǎn)[3]。美國(guó)先前一項(xiàng)研究報(bào)告了147例人類(lèi)李斯特菌病感染病例和33例死亡病例[4]。2015年歐盟共報(bào)告了2 224例侵襲性李斯特菌病病例，總病例死亡率為18.8%[5]。在我國(guó)，李斯特菌病是一種罕見(jiàn)疾病，尚未被列為法定申報(bào)疾病[6]。到目前為止，我國(guó)沒(méi)有關(guān)于人群中爆發(fā)李斯特菌病的報(bào)告。本研究基于全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)27株食源性單增李斯特菌進(jìn)行耐藥基因、毒力基因及分子分型特征分析，為單增李斯特菌病的預(yù)防控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

27株單增李斯特菌分離自臨沂市食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)樣品。

1.2 試劑與儀器

LB1增菌液；李斯特菌顯色培養(yǎng)基（法國(guó)科瑪嘉）；腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基；全基因組DNA提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）。

VITEK2全自動(dòng)微生物鑒定儀（法國(guó)梅里埃公司）；CLC Genomics Workbench 21分析軟件（德國(guó)Qiagen公司）。

1.3 菌株復(fù)蘇培養(yǎng)

取甘油凍存管保存的27株單增李斯特菌分析用LB1增菌液復(fù)蘇，接種李斯特菌顯色培養(yǎng)基，挑取典型菌落進(jìn)行純培養(yǎng)及生化鑒定。

1.4 全基因組測(cè)序分析

1.4.1 全基因組測(cè)序

依照全基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)完成DNA的提取，送至諾禾致源科技服務(wù)有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序（Whole Genome Sequencing，WGS），將clean data導(dǎo)入CLC Genomics Workbench 21進(jìn)行組裝和分析。

1.4.2 耐藥基因、毒力基因及毒力島分析

通過(guò)CLC Genomics Workbench 21分析軟件對(duì)27株菌進(jìn)行耐藥基因和毒力基因預(yù)測(cè)。根據(jù)毒力基因注釋結(jié)果對(duì)單增李斯特菌毒力島（Listeria Pathogenicity Island，LIPI）Ⅰ、Ⅱ進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4.3 多位點(diǎn)序列分型、譜系分析

基于全基因組測(cè)序結(jié)果，利用BIGSdb-單增李斯特菌數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html）分析基于27株單增李斯特菌菌株的多位點(diǎn)序列分型（Multilocus Sequence Typing，MLST）、譜系及克隆群（Clonal Complex，CC）型。

1.4.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

利用在線(xiàn)分析工具CSI Phylogeny 1.4分析27株單增李斯特菌的全基因組序列，構(gòu)建基于cg-SNP的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用iTOL繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株基本信息

從27株單增李斯特菌來(lái)源情況來(lái)看，59.3%來(lái)自生畜肉（16/27），14.8%來(lái)自生禽肉（4/27），其余7株菌分別來(lái)自水果制品、冷凍飲品、水產(chǎn)品、炒貨堅(jiān)果制品及家庭自制蔬菜制品（水煮花生、腌醬菜）。27株菌株分為10個(gè)ST型，2株菌ST型未命名（NA），ST121為優(yōu)勢(shì)ST型，所占比例為29.63%（8/27），其余19株ST型為ST9（5株）、ST91（3株）、ST155（2株）、ST8（2株）等，ST型ST14、ST87、ST2、ST5、ST37僅包含1株分離菌。27株實(shí)驗(yàn)菌株分屬于2個(gè)譜系（Ⅰ和Ⅱ），以譜系Ⅱ?yàn)橹?，?2株（81.5%）；分為6個(gè)CC型，其中CC9、CC14和CC121為優(yōu)勢(shì)CC型，共占63%（17株）；分為7個(gè)ST型，CC14包括ST14和ST91，其余CC型僅包含1種ST型。詳見(jiàn)表1。

2.2 耐藥基因分析

耐藥基因分析結(jié)果顯示，27株單增李斯特菌有26株菌攜帶磷霉素FosX耐藥基因，占96.3%。菌株SD22LY0009LM和SDLY20Lmo003均攜帶四環(huán)素類(lèi)tetM和甲氧芐氨嘧啶類(lèi)dfrG兩種耐藥基因，這兩株菌都是ST155型，從生畜肉中檢出。僅有1株菌SD22LY0024LM不攜帶耐藥基因，詳見(jiàn)表2。

2.3 毒力基因分析

27株單增李斯特菌分別檢出70～80個(gè)毒力基因，根據(jù)VFanalyzer毒力基因編碼蛋白的注釋?zhuān)x擇其中40個(gè)毒力基因進(jìn)行分析。27株單增李斯特菌毒力基因主要集中在毒力島LIPI-Ⅰ和LIPI-Ⅱ，另外還包括ami、lap基因家族等。27株菌出現(xiàn)兩種毒力缺失（見(jiàn)表3），第1種是毒力島LIPI-Ⅰ缺失，菌株SD22LY0002LM和菌株SSD22LY0024LM出現(xiàn)LIPI-Ⅰ毒力島上的全部基因缺失，缺失率為7.4%；第2種是毒力島LIPI-Ⅱ中inlF單一缺失，缺失率為40.7%，其中菌株SSD22LY0024LM又出現(xiàn)了inlF的缺失。27株分離株均未檢測(cè)到LIPI-Ⅲ和LIPI-Ⅳ毒力島。與黏附侵襲相關(guān)毒力因子ami、iap、lap、lapB、lpeA、pdgA、vip，生存耐受因子bsh、clpC，協(xié)助侵入感染因子aut、gtcA、hpt、lplA1、prsA2在27株分離株中均有檢出。

2.4 進(jìn)化樹(shù)分析

以NC_003210.1為參考菌株，對(duì)27株單增李斯特菌進(jìn)行cg-SNP分析，并據(jù)此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖1。27株菌株距離較近，聚集于3個(gè)分支中。絕大部分單增李斯特菌分離自肉制品，占74.1%（20/27），3個(gè)分支中均有分布，主要聚集于C分支中。有2株分離自水產(chǎn)品，2株分離自家庭自制蔬菜制品（水煮花生、腌醬菜）以及1株分離自炒貨及堅(jiān)果制品，主要聚集于分支C中。其余2株分離自冷凍飲品和水果制品的菌株主要聚集于分支A中。27株單增李斯特菌分屬10種MLST型，每型包括1～6株菌。分析結(jié)果顯示，ST型相同的食品同源性較高。ST121為優(yōu)勢(shì)ST型，所有ST121菌株具有在堿性和氧化應(yīng)激條件下生存的能力，提示這部分菌株可在食品生產(chǎn)加工和流通環(huán)境中長(zhǎng)期存活，增加污染食品和致病的風(fēng)險(xiǎn)[8]。此外ST分型中的ST155、ST87和ST8多為可致病性的ST型。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)全基因組測(cè)序?qū)?7株單增李斯特菌進(jìn)行分析，獲得10個(gè)ST型，另有2株菌ST型未命名。MLST分析結(jié)果顯示，ST121為優(yōu)勢(shì)ST型，ST8型、ST87型單增李斯特菌在我國(guó)食品及人群中具有潛在的危害性，可能引發(fā)食物中毒事件，應(yīng)引起相關(guān)部門(mén)的重視[9]。相關(guān)文獻(xiàn)表明基于SNP位點(diǎn)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，具有更高的靈敏度，可分辨細(xì)微差別，且便于與同源性更相近的菌株進(jìn)行比較[10]。本研究中基于全基因組的cg-SNP分析對(duì)不同來(lái)源的菌株進(jìn)行比較，可提供更準(zhǔn)確可靠的分析結(jié)果。

單增李斯特菌的毒力與胞內(nèi)存活增殖、黏附侵入細(xì)胞、細(xì)胞間擴(kuò)散能力密切相關(guān)。LIPI-1和LIPI-2為單增李斯特菌中不易缺失且高度保守的毒力島，在其感染宿主的過(guò)程中，是介導(dǎo)細(xì)菌入侵和細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的關(guān)鍵毒力因子[11-12]。本研究結(jié)果顯示，27株菌出現(xiàn)2種毒力缺失。菌株SSD22LY0024LM出現(xiàn)LIPI-1和inlF全缺失，同時(shí)該菌也只有norB、lin兩種耐藥基因，這是1株從動(dòng)物水產(chǎn)品花蛤中檢出的分離株，為未命名的ST型。單增李斯特菌內(nèi)化素基因中InlA、InlB為單增李斯特菌所特有，并由轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PrfA調(diào)節(jié)，從而影響細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的侵襲力和致病性[13]。

單核細(xì)胞增生李斯特菌為胞內(nèi)寄生菌，可導(dǎo)致侵襲性感染，數(shù)據(jù)顯示肉與肉制品、水產(chǎn)動(dòng)物及中式?jīng)霭璨说葐魏思?xì)胞增生李斯特菌檢出率較高[14]，本研究分離菌株也多來(lái)自生畜肉、生禽肉和蔬菜水果等?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道指出，臨床上治療李斯特菌病的常用藥物有青霉素類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)及磺胺類(lèi)藥物等[15]。臨沂市27株單增李斯特分離株中攜帶FosX、dfrG和tetM 3種耐藥基因，未發(fā)現(xiàn)攜帶其他耐藥基因，提示臨沂市病例菌株目前并未產(chǎn)生對(duì)臨床藥物的耐藥性，常規(guī)臨床治療用藥依然有效。

綜上所述，臨沂市單增李斯特菌專(zhuān)項(xiàng)監(jiān)測(cè)工作應(yīng)在生畜肉樣本的基礎(chǔ)上，加大對(duì)于冷凍飲品、乳制品原料、生禽肉類(lèi)、水果蔬菜類(lèi)樣本的單增李斯特菌株的監(jiān)測(cè)力度。本研究結(jié)果表明，多種溯源分析方法可以幫助確定受單增李斯特菌污染的食品并防止感染的再次發(fā)生，開(kāi)展食源性單增李斯特菌分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，對(duì)于評(píng)估單增李斯特菌的潛在風(fēng)險(xiǎn)和進(jìn)一步解決食品安全問(wèn)題具有重要意義。

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作者簡(jiǎn)介：高遠(yuǎn)（1986—），女，山東臨沂人，碩士，主管檢驗(yàn)技師。研究方向：微生物檢驗(yàn)。

通信作者：張曉妮（1982—），女，山東榮成人，碩士，主管檢驗(yàn)技師。研究方向：微生物檢驗(yàn)。E-mail：530546771@qq.com。