礦泉水中銅綠假單胞菌檢測能力的驗(yàn)證與分析

王同智　朱文斌　張洪偉　李俊霞　周浩

摘 要：通過參加外單位組織的礦泉水中銅綠假單胞菌檢測能力驗(yàn)證，探索減少過濾后菌落數(shù)的計(jì)數(shù)方式和范圍，提高實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用GB 8538—2022進(jìn)行檢測的能力，同時(shí)驗(yàn)證MALDI-TOF MS的準(zhǔn)確性。依據(jù)組織方的作業(yè)指導(dǎo)書對樣品進(jìn)行處理，采取25 mL+225 mL的方式進(jìn)行稀釋，根據(jù)GB 8538—2022進(jìn)行檢測，同時(shí)應(yīng)用MALDI-TOF MS進(jìn)行鑒定。樣品23-V717、23-H802報(bào)告結(jié)果的評價(jià)Z值分別為-0.1、-0.9，皆為滿意。此方式提高了實(shí)驗(yàn)員檢測水平，驗(yàn)證了借助基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）鑒定的準(zhǔn)確性，縮短了檢驗(yàn)檢測時(shí)間。

關(guān)鍵詞：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）；銅綠假單胞菌；檢測能力；準(zhǔn)確性

Validation and Analysis of Detection Capability of Pseudomonas aeruginosa in Mineral Water

WANG Tongzhi1，2，3， ZHU Wenbin1，2，3， ZHANG Hongwei1，2，3， LI Junxia1，2，3， ZHOU Hao1，2，3*

（1.Chengdu Institute of Food Inspection， Chengdu 611130， China; 2.Key Laboratory of Chemical Metrology and Applications on Nutrition and Health for State Market Regulation， Beijing 100029， China;

3.Irradiation Preservation Key Laboratory of Sichuan Province， Chengdu 611130， China）

Abstract： By participating in the validation of the detection ability of Pseudomonas aeruginosa in mineral water organized by external units， exploring the counting method and range of reducing the number of colonies after filtration， and improving the laboratorys ability to apply GB 8538—2022 for detection， while verifying the accuracy of MALDI-TOF MS. Processing the samples according to the capability verification work instruction， were diluted by

25 mL+225 mL， and detecting in parallel according to GB 8538—2022， and identified by MALDI-TOF MS. The Z values of 23-V717 and 23-H802 were -0.1 and -0.9 respectively. The result is satisfactory. This capability validation improved the laboratory detection capability， verified the accuracy of MALDI-TOF MS identification， and shortened the testing time.

Keywords： matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS）; Pseudomonas aeruginosa; detection ability; accuracy

銅綠假單胞菌（簡稱銅綠）是一種常見的水源性條件致病菌，存在于各類型水中，可通過水源、土壤、工器具、接觸等多種方式進(jìn)行傳播，對消毒劑、干燥、紫外等理化因素及不良環(huán)境具有很強(qiáng)的抵抗力[1]。銅綠假單胞菌可產(chǎn)生胞外酶、內(nèi)毒素等數(shù)十種致病因子[2]，是容易致人產(chǎn)生急性腸道疾病和皮膚炎癥的致病菌[3]。對長期大量使用抗生素、大面積燒傷、機(jī)體免疫功能低下者，銅綠假單胞菌會(huì)引起皮膚黏膜感染、肺炎、腦膜炎、敗血癥等疾病[4-13]。大量的研究文獻(xiàn)指出飲用水中銅綠假單胞菌的檢出率比較高[4-13]，所以客觀地計(jì)數(shù)水中銅綠假單胞菌就相當(dāng)重要。

能力驗(yàn)證是參加實(shí)驗(yàn)室間比對來提高實(shí)驗(yàn)檢測能力的重要手段，是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的重要方

式[14-20]。為了提高實(shí)驗(yàn)室的檢測能力，2023年，實(shí)驗(yàn)室參加了由中國檢科院測試評價(jià)中心組織的ACAS-PT1626（2023）礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測能力驗(yàn)證，應(yīng)用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2022）進(jìn)行檢測，同時(shí)借助基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）進(jìn)行鑒定。日常實(shí)驗(yàn)中按照GB 8538—2022的方法，濾膜上有很多菌落生長，對計(jì)數(shù)和挑取目標(biāo)菌落都容易形成干擾。本次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MALDI-TOF MS的準(zhǔn)確性，試驗(yàn)過程中所涉及的過濾方式﹑計(jì)數(shù)原則同樣適用于日常檢驗(yàn)檢測，既可以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，也能縮短檢驗(yàn)檢測時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 樣品與對照菌株

樣品由中國檢科院測試評價(jià)中心提供（編號(hào)為23-V717、23-H802），陽性菌株選用銅綠假單胞菌（ATCC 27853）和陰性菌株熒光假單胞菌（ATCC 13525）。

1.2 試劑

銅綠假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CN）瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、綠膿菌素測定培養(yǎng)基（北京陸橋）；無菌親水性微孔濾膜（Millipore）：直徑47 mm，孔徑為0.45 μｍ；濾杯（Millipore）。

1.3 儀器

生化培養(yǎng)箱（Panasonic），Millipore六聯(lián)過濾系統(tǒng)，紫外檢測箱（上海嘉鵬科技有限公司）；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Bruker Daltonik GmbH）。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理

依據(jù)組織方提供的參試指導(dǎo)書進(jìn)行樣品處理，在生物安全柜中打開樣品瓶，移入10 mL滅菌水進(jìn)行復(fù)溶，復(fù)溶后倒入干燥的裝有玻璃珠的1 000 mL滅菌三角瓶中，用1 mL槍頭吸取殘留的懸液，再加入10 mL滅菌水清洗樣品瓶，最后用100 mL大肚吸管移取滅菌水到三角瓶中，每次移取時(shí)都加入一部分到樣品瓶中進(jìn)行清洗，直至三角瓶中菌懸液總量為520 mL。三角瓶中的520 mL菌懸液即為樣品液。

1.4.2 樣品的稀釋

基于GB 8538—2022 以CFU/250 mL計(jì)，對樣品進(jìn)行稀釋：吸取25 mL樣品液+225 mL滅菌水視為1∶10樣品液；吸取25 mL 1∶10樣品液+225 mL滅菌水視為1∶100樣品液，吸取25 mL 1∶100樣品液+225 mL滅菌水視為1∶1 000樣品液。

1.4.3 樣品過濾與培養(yǎng)

本次實(shí)驗(yàn)采取兩種方式對樣品進(jìn)行過濾，且每一稀釋度進(jìn)行兩次過濾。方式一：對樣品稀釋后的250 mL樣品液進(jìn)行過濾，過濾完后用滅菌水沖洗內(nèi)壁。方式二：分別取樣品液（原液）250 mL、25 mL、2.5 mL、0.25 mL進(jìn)行過濾，過濾后用滅菌水多次沖洗內(nèi)壁。截留完成后的濾膜貼在CN瓊脂培養(yǎng)基上（注意瓊脂與濾膜之間不能有空隙），將貼好濾膜的CN瓊脂培養(yǎng)基倒置放入35～37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從24 h開始觀察計(jì)數(shù)直至48 h。

1.4.4 生化鑒定

依據(jù)GB 8538—2022對目標(biāo)菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)，同時(shí)采用MALDI-TOF MS對菌落進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 本次能力驗(yàn)證

通過兩種方式過濾，培養(yǎng)后CN瓊脂平皿上有兩種可疑菌落形態(tài)，一種呈綠色且紫外線觀察有熒光產(chǎn)生，計(jì)數(shù)見表1。另外一種呈淡綠色菌落且紫外線觀察無熒光產(chǎn)生，計(jì)數(shù)見表2。綠色菌落較淡綠色菌落大，淡綠色菌落數(shù)比綠色菌落數(shù)多。

從表1與表2可知，同一稀釋度方式一結(jié)果普遍比方式二結(jié)果大，說明方式一的菌落更分散；計(jì)數(shù)24 h大于48 h的結(jié)果，可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌落變大出現(xiàn)融合現(xiàn)象。

2.2 可疑菌落的確證

按照GB 8538—2022確證試驗(yàn)的步驟，分別挑取不同稀釋度兩種菌落形態(tài)各10個(gè)（不足10個(gè)則全挑）劃線接種營養(yǎng)瓊脂36 ℃培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行綠膿菌數(shù)試驗(yàn)，同時(shí)按照《出口食品中病原微生物快速篩選方法 MALDI-TOF MS法 第9部分：銅綠假單胞菌》（SN/T 5228.9—2019）進(jìn)行鑒定。同一菌落形態(tài)的10個(gè)菌落鑒定結(jié)果一致，且匹配分值均大于2.3（根據(jù)MALDI-TOF MS對于鑒定的規(guī)則，確定匹配分值大于2.3表示可信度很高），鑒定結(jié)果見表3。對于MALDI-TOF MS鑒定為可疑金黃色葡萄球菌的淡綠色菌落，再次按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）進(jìn)行復(fù)核，復(fù)核結(jié)果確認(rèn)為金黃色葡萄球菌。本次試驗(yàn)中MALDI-TOF MS法與常規(guī)生化（GB 8538—2022）的鑒定結(jié)果一致，且較常規(guī)鑒定更方便快捷，為檢驗(yàn)檢測提供多種選擇。

2.3 計(jì)數(shù)與報(bào)告結(jié)果

參考GB 4789.10—2016的計(jì)數(shù)規(guī)則，選取菌落數(shù)在20～200的稀釋度進(jìn)行計(jì)數(shù)，方式一與方式二兩種稀釋方式計(jì)數(shù)結(jié)果見表4。按照GB 8538—2022中57.5.3 結(jié)果觀察與計(jì)數(shù)的要求，本次能力驗(yàn)證報(bào)告結(jié)果選用方式一的24 h結(jié)果進(jìn)行報(bào)送，組織單位根據(jù)本實(shí)驗(yàn)報(bào)送的結(jié)果計(jì)算的Z值見表5。組織單位返回的Z值說明本次試驗(yàn)結(jié)果偏低于中位值，菌落分散不夠或者是菌落相互融合計(jì)數(shù)偏低。

3 結(jié)論與討論

這次能力驗(yàn)證需要進(jìn)行稀釋，以減少濾膜上菌落數(shù)，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，而GB 8538—2022中沒有稀釋過程，且沒有要求進(jìn)行多次過濾。減少濾膜上的菌落數(shù)有兩種途徑，稀釋后過濾和減少過濾量，本次試驗(yàn)稀釋后過濾比減少過濾量結(jié)果好，但需要更多試驗(yàn)驗(yàn)證。GB 8538—2022中沒有選取濾膜的計(jì)數(shù)范圍。目前GB 4789系列標(biāo)準(zhǔn)中，常見直徑為90 mm培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)范圍有10～100 CFU[21]﹑10～150 CFU[22]﹑15～150 CFU[23-24]﹑20～200 CFU[25-26]﹑30～300 CFU[27-28]。選擇不同的計(jì)數(shù)范圍直接影響稀釋度的選擇，從而影響報(bào)告結(jié)果。GB 8538—2022要求的濾膜直徑為47 mm，相比直徑為90 mm培養(yǎng)皿則小得多，不利于菌落在濾膜上分散，容易導(dǎo)致菌落聚集融合，因此選擇合適的計(jì)數(shù)范圍則尤為重要，這直接影響計(jì)數(shù)結(jié)果。計(jì)數(shù)范圍的選擇應(yīng)充分考慮計(jì)數(shù)面積和菌落生長的情況。

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作者簡介：王同智（1993—），男，甘肅白銀人，本科，工程師。研究方向：食品安全檢測。

通信作者：周浩（1982—），男，四川達(dá)州人，碩士，高級工程師。研究方向：食品安全檢測。E-mail：402241344@qq.com。