常綠鉤吻堿對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

陳 亮，聶平平

福州市中醫(yī)院，福建 福州 350001

鉤吻，又名斷腸草、大茶藥、野葛等，為馬錢科植物胡蔓藤Gelsemiumelegans(Gardn.etchamp) Benth.的全草，是有毒植物，在我國主要分布在我國浙江、福建、廣東、廣西、貴州、云南等地[1]。鉤吻具有破瘕積的功效[2]，現(xiàn)代藥理研究[3]發(fā)現(xiàn)鉤吻具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等作用。曾有醫(yī)者將鉤吻總生物堿制成注射劑應(yīng)用于臨床治療癌性疼痛取得一定療效[4]，鉤吻生物堿的毒性也對其臨床應(yīng)用帶來一定限制，也需要進(jìn)一步研究相關(guān)作用機(jī)制，以便能夠更好地應(yīng)用于臨床。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)鉤吻中提取出的常綠鉤吻堿具有較強(qiáng)抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖的作用，但是具體機(jī)制尚未明確。本研究利用MTT實(shí)驗(yàn)、DAPI染色及western-blot等研究方法，從Bcl-2/Bax途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的角度出發(fā)，探討常綠鉤吻堿抗結(jié)腸癌作用的機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與細(xì)胞 常綠鉤吻堿，由昆山遠(yuǎn)慕生物技術(shù)有限公司提供(純度>99%，貨號YM-0065)，配制前用二甲基亞砜(DMSO)溶液配制成5 mg/mL的母液，于4 ℃保存待用。人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株，由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供(貨號KGG3225-1)。

1.2 試劑和儀器 南美胎牛血清(美國Hyclone公司，貨號SV30087.02)；雙抗青鏈酶素(10000units/mL，10000μg/mL鏈霉素。美國Hyclone公司，貨號SV30010)；McCoys’5A液體培養(yǎng)基(武漢博士德公司，貨號PYG0026)；胰蛋白酶-EDTA(美國Hyclone公司，貨號SH30042.01)；二甲基亞砜(DMSO)溶液(北京索萊寶公司，貨號D8371)；噻唑藍(lán)(MTT)干粉(江蘇凱基公司，貨號KGH3101-1)；細(xì)胞凋亡DAPI染色劑試劑盒(江蘇凱基公司，貨號KGA215)；RIPA細(xì)胞裂解液(上海碧云天公司，貨號P0013B)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天公司，貨號P0011)；一抗稀釋液(上海碧云天公司，貨號P0023A)；二抗稀釋液(上海碧云天公司，貨號P0023D)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天公司，貨號P0012A)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(上海碧云天公司，貨號P0015)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天公司，貨號P0018S)；β-actin蛋白一抗(英國abcam公司，貨號ab8226)；Bcl-2蛋白一抗(英國abcam公司，貨號ab59348)；Bax蛋白一抗(英國abcam公司，貨號ab32503)；二抗(北京全式金公司，貨號HS201-01、HS101-01)；ELX800酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(中國力康公司)；IX7熒光倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；潔凈工作臺(蘇州泰安空氣技術(shù)有限公司)；25 cm2培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板(美國Corning公司)；Gel DOC 2000 型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。

2 方法

2.1 HT-29細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、1%雙抗青鏈酶素的McCoys’5A液體培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞以McCoys’5A培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL分別接種于3塊96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，使細(xì)胞貼壁。吸棄原培養(yǎng)液，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察到常綠鉤吻堿對HT-29細(xì)胞增殖的抑制情況，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(常綠鉤吻堿終質(zhì)量濃度分別為4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培養(yǎng)液培養(yǎng))，對照組(等體積不含常綠鉤吻堿的培養(yǎng)液培養(yǎng))及調(diào)零組(不含細(xì)胞直接加等體積的培養(yǎng)液)，以上5組各設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，然后吸取各孔中的液體加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL/孔 ，振蕩混勻，并于室溫放置10 min，使結(jié)晶充分溶解并混勻，在ELX800酶標(biāo)儀于570 nm處測定5組吸光度值(即OD值)，抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組-調(diào)零組)/(對照組-調(diào)零組)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將取對數(shù)生長期的HT-29接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(用常綠鉤吻堿終質(zhì)量濃度分別為4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培養(yǎng)液培養(yǎng))，對照組(等體積不含常綠鉤吻堿的培養(yǎng)液培養(yǎng))。HT-29細(xì)胞用常綠鉤吻堿干預(yù)培養(yǎng)24 h后，用IX7熒光倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及變化，并拍照。

2.4 DAPI染色液染色觀察 HT-29細(xì)胞的凋亡情況 將取對數(shù)生長期的HT-29接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(用常綠鉤吻堿終質(zhì)量濃度分別為4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培養(yǎng)液培養(yǎng))，對照組(等體積不含常綠鉤吻堿的培養(yǎng)液培養(yǎng))，HT-29細(xì)胞用常綠鉤吻堿干預(yù)培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔用1 μg/mL的DAPI染色液500 μL漂洗后，棄去染色液，每孔再加1 μg/mL的DAPI染色液500 μL，37 ℃孵育染色15 min，棄去染色液，后每孔加500 μL無水甲醇溶液漂洗，棄去甲醇溶液，每孔加入500μL Buffer后，用IX7熒光倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的凋亡情況。

2.5 western-blot檢測Bcl-2和Bax蛋白 取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞胰酶消化后，取3×106個/mL接種于6孔板中，每孔2 mL培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后。吸棄原培養(yǎng)液，細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(用常綠鉤吻堿終質(zhì)量濃度分別為4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培養(yǎng)液培養(yǎng))，對照組(直接加等體積的培養(yǎng)液)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，收集細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液150 μL，4 ℃裂解30 min，收集細(xì)胞裂解液，14000 rpm離心15 min，收集上清液，BCA試劑測定蛋白含量，加入5×蛋白上樣緩沖液至終濃度為1×，100 ℃蛋白變性5 min，上樣于SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠，每孔20 μg蛋白進(jìn)行電泳分離。將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，一抗(β-actin、Bcl-2、Bax蛋白用一抗稀釋液1∶1000稀釋)4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗(以1∶8000用二抗稀釋液稀釋)室溫孵育2 h，TBST漂洗3遍，每遍10 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，以β-actin為內(nèi)參基因，用Image Lab軟件進(jìn)行顯色分析，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 常綠鉤吻堿對于HT-29細(xì)胞增殖的影響 質(zhì)量濃度4 μg/mL常綠鉤吻堿干預(yù)24 h后，即對HT-29細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用(P<0.05)。隨著藥物濃度的提高及干預(yù)時間的延長，HT-29的抑制率也升高，呈明顯的時間劑量依賴。8 μg/mL常綠鉤吻堿干預(yù)24 h后，對 HT-29 細(xì)胞增殖的平均抑制率可達(dá)58.81%，使用SPSS 17.0計算IC50約為7.48 μg/mL。詳見表1。

表1 常綠鉤吻堿對于HT-29細(xì)胞增殖的影響情況表(常綠鉤吻堿干預(yù) 24 h)

3.2 常綠鉤吻堿對于HT-29細(xì)胞形態(tài)的影響(干預(yù)24 h) 空白對照組細(xì)胞胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核仁清晰，呈良好的貼壁生長，如圖1A所示。實(shí)驗(yàn)組當(dāng)常綠鉤吻堿質(zhì)量濃度為4 μg/mL作用24 h時，可明顯觀察到細(xì)胞胞質(zhì)混濁，細(xì)胞體積縮小，開始出現(xiàn)細(xì)胞懸浮、脫落，甚至死亡，如圖1B所示；隨著劑量的增加細(xì)胞狀態(tài)越差，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少如圖1C和圖1D所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示常綠鉤吻堿對于HT-29細(xì)胞有明顯的抑制作用，并隨濃度的增加逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

A.0 μg/mL；B.4 μg/mL；C.6 μg/mL；D.8 μg/mL

3.3 常綠鉤吻堿對于HT-29細(xì)胞凋亡的影響(干預(yù)24 h) DAPI染色劑染色后，空白對照組HT-29細(xì)胞染色均勻，細(xì)胞核呈圓形，邊緣清晰，如圖2A所示。實(shí)驗(yàn)組常綠鉤吻堿干預(yù)后凋亡的細(xì)胞出現(xiàn)藍(lán)色熒光，細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，核小體碎片增加。隨著藥物劑量的增加，HT-29細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，表明常綠鉤吻堿可促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡。如圖2B、C、D所示。

A.0 μg/mL；B.4 μg/mL；C.6 μg/mL；D.8 μg/mL

3.4 western-blot檢測 常綠鉤吻堿對于HT-29細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響(干預(yù)24 h) 與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組各組Bcl-2蛋白的表達(dá)逐漸降低(P<0.05)，而Bax蛋白的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，表明常綠鉤吻堿可降低HT-29細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)，但對Bax蛋白的表達(dá)無明顯影響。如圖3和圖4所示。

圖3 常綠鉤吻堿對HT-29細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)影響的電泳情況圖

注：與對照組相比，*P<0.05，**P>0.05

4 討論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持穩(wěn)定的重要保護(hù)機(jī)制之一，細(xì)胞凋亡率的減少是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵性步驟。腫瘤發(fā)展過程中增殖與凋亡平衡的破壞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖[5]。

Bcl-2和Bax蛋白均屬于Bcl-2家族，Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡，Bax則為促凋亡蛋白，Bcl-2家族是凋亡調(diào)控的重要分子，在腫瘤中Bcl-2家族成員表達(dá)異常，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能夠逃逸凋亡，保持持續(xù)的增殖能力，Bcl-2定位于線粒體膜，Bax則主要以單體形式定位于細(xì)胞漿，當(dāng)受到凋亡刺激時，Bax發(fā)生構(gòu)象改變，從胞漿移位到線粒體外膜形成二聚體或寡聚體并插入線粒體膜，導(dǎo)致線粒體跨膜電位下降和促凋亡分子的釋放，進(jìn)而促發(fā)線粒體介導(dǎo)的凋亡通路，Bcl-2可與Bax形成異二聚體，阻礙Bax等促凋亡蛋白的功能，抑制細(xì)胞色素C(Cyt-c)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的釋放，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[6]。Bcl-2/Bax異常升高可見于多種腫瘤之中，Bax/Bcl-2與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[7]。

結(jié)腸癌是一種發(fā)病率和死亡率都很高的惡性腫瘤[8]。結(jié)腸癌的發(fā)病與遺傳、環(huán)境因素、飲食及生活習(xí)慣均密切相關(guān)，其發(fā)病涉及多因素、多個階段及不同基因的變化。細(xì)胞凋亡程序的失常與結(jié)腸癌的發(fā)病密切相關(guān)。有研究表明Bcl-2表達(dá)量可影響結(jié)腸組織的惡變程度，從而影響結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展[9]。

目前，中藥的抗腫瘤作用越來越受到重視，以其副作用少、療效確切的特點(diǎn)受到許多研究者關(guān)注。中藥對于逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥也具有一定作用[10]。研究中藥中的有效抗腫瘤成分將有助于抗腫瘤藥物的研發(fā)。隨著對中藥生物堿研究的不斷深入，越來越多的生物堿被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用，中藥生物堿成分的抗腫瘤機(jī)制主要有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，影響腫瘤細(xì)胞自噬和調(diào)節(jié)免疫功能等，可通過調(diào)控 PI3K/AKT、AKT/mTOR、JNK/p38 MAPK、Wnt/β-catenin 等相關(guān)信號通路，多環(huán)節(jié)、多途徑參與到腫瘤增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及自噬過程中，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11]。

鉤吻含有鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、鉤吻綠堿等多種生物堿成分[12]。吳達(dá)榮等[13]的實(shí)驗(yàn)證明鉤吻生物堿的主要成分鉤吻素子在體外對于人結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo有抑制作用。黃靜等[14]也通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鉤吻生物堿中的鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己和1-甲氧基鉤吻堿對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖具有顯著的抑制作用。本課題前期研究[15]發(fā)現(xiàn)鉤吻總生物堿可抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖，也可抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的增殖及遷移[16]，具有一定抑制血管新生的作用。常綠鉤吻堿是鉤吻生物堿中含有的單體成分之一。有研究[17]通過體外細(xì)胞培養(yǎng)及裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)常綠鉤吻堿可抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251生長，用100 mg/kg的常綠鉤吻堿灌胃給藥小鼠時也未發(fā)現(xiàn)對正常小鼠存在明顯毒性作用。目前鉤吻生物堿抗腫瘤作用的研究仍較少，本研究通過常綠鉤吻堿體外作用于HT-29細(xì)胞，利用MTT試驗(yàn)及倒置相差顯微鏡觀察到常綠鉤吻堿可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖，表現(xiàn)出明顯量效關(guān)系。另外，通過DAPI染色法證實(shí)常綠鉤吻堿可促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡。western-blot檢測發(fā)現(xiàn)常綠鉤吻堿可顯著下調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)(P<0.05)，對Bax的蛋白表達(dá)未見明顯影響(P>0.05)。由此我們推測常綠鉤吻堿可能通過減少HT-29細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而減輕細(xì)胞對凋亡的抑制作用，而非直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因而對Bax蛋白的表達(dá)無明顯影響。這也為常綠生物堿抗腫瘤作用的研究提供了一定理論參考。