腫瘤抑制基因7L通過Wnt/β-catenin信號通路抑制胰腺癌細(xì)胞生長的作用機(jī)制

陳小麗 田小容 黃曉東 田霞

胰腺癌是最致命的癌癥之一,我國胰腺癌的發(fā)病率和死亡率仍在逐年上升,對人類健康構(gòu)成重大威脅[1-2]。因此,探索胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn),對改善胰腺癌患者的預(yù)后尤為重要[3-4]。研究表明腫瘤抑制基因(ST)7L通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路起腫瘤抑制作用并被表征為抑癌基因[5-6]。曲美他嗪可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制人腦血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移及活性氧表達(dá)[7]。當(dāng)Wnt通路被激活時,β-catenin磷酸化被抑制,導(dǎo)致細(xì)胞中β-catenin增加,β-catenin蛋白轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中,與轉(zhuǎn)錄因子的共調(diào)節(jié)因子形成復(fù)合物,共同激活Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄,最終參與促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活、分化和遷移等基因表達(dá)[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)ST7L基因能夠作為靶基因,在上游基因的調(diào)控下參與胰腺癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和耐藥。然而,關(guān)于ST7L對胰腺癌細(xì)胞增殖及凋亡能力影響的報道甚少。因此,本研究主要探討ST7L對胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響及其可能的作用機(jī)制,以期為胰腺癌的治療提供新依據(jù)。

材料與方法

1.材料:臨床樣本:選取于我院就診、病理組織活檢確診為胰腺癌且未行放化療的患者及同期健康體檢者血漿標(biāo)本各22例,同時收集胰腺癌組織和癌旁組織(距癌組織邊緣≤3 cm)標(biāo)本13對。取血漿標(biāo)本在4 ℃下1 000 g離心15 min,隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。組織標(biāo)本離體后先液氮速凍,后儲存于-80 ℃?zhèn)溆?。本研究?jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)(KY2019-012),所有受試者均簽署知情同意書。主要試劑:DMEM、RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清均購于美國Gibco公司;Trizol及Lipofectamine2000試劑購于美國Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒購于日本TOYOBO公司;UltraSYBR混合物購于江蘇康為世紀(jì)公司;ST7L和β-actin引物購于廣州銳博公司;細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)購于上海碧云天公司;ST7L抗體購于美國Sigma公司;Caspase-3抗體購于美國CST公司;Bcl-2抗體購于美國R&D公司;β-catenin、c-Myc、Cyclin D1及β-actin抗體均購于英國Abcam公司。

2.方法

(1)細(xì)胞培養(yǎng):人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、PaCa-2、AsPC-1和胰腺導(dǎo)管正常細(xì)胞H6C7均來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。PANC-1和PaCa-2生長于DMEM培養(yǎng)基,AsPC-1和H6C7生長于RPMI 1640培養(yǎng)基,所有細(xì)胞在37 ℃、含5%的CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基均含有1%青-鏈霉素及10%胎牛血清。

(2)RNA的提取及實(shí)時熒光定量(qRT)-PCR:總RNA的提取使用Trizol試劑,隨后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,在20 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行定量PCR,操作步驟均按照試劑盒說明書進(jìn)行,ST7L基因mRNA水平按照2-ΔΔCT法通過β-actin進(jìn)行內(nèi)源性校正。qRT-PCR用于檢測臨床樣本及細(xì)胞系中ST7L的表達(dá)水平。

(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組:將細(xì)胞接種于6孔板,第2天細(xì)胞大部分融合后,使用Lipofectamine2000試劑,將ST7L過表達(dá)質(zhì)粒及空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞作為ST7L組和對照組,將ST7L敲降質(zhì)粒及空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞作為si-ST7L組和si-NC組。轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

(4)CCK-8檢測:將細(xì)胞接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁相應(yīng)時間后,向每孔培養(yǎng)液中加入10 μl的CCK-8溶液,充分混合,分別檢測細(xì)胞在24 h、48 h、72 h、96 h于450 nm的OD值,反映各組細(xì)胞的增殖情況。

(5)流式細(xì)胞術(shù):流式細(xì)胞術(shù)用于分析細(xì)胞的凋亡情況,將細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)3天后,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(PI),室溫避光條件下孵育15 min,所有樣品在1 h內(nèi)使用FACSCalibur Ⅱ流式儀進(jìn)行檢測分析。

(6)Western blot:用細(xì)胞裂解液從各組細(xì)胞中提取總蛋白,將蛋白與上樣緩沖液混合后100 ℃變性10 min,用10% SDS-PAGE膠分離每個樣品中等量的蛋白質(zhì)提取物并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,隨后與相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜,用羊抗兔二抗在室溫下孵育1 h,隨后使用ECL發(fā)光顯色試劑盒進(jìn)行顯色顯影,成像儀曝光掃描分析結(jié)果。

結(jié) 果

1.ST7L在胰腺癌患者血漿、組織及胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況:胰腺癌患者血漿ST7L表達(dá)水平明顯低于健康對照者[(5.64±3.34)比(10.27±7.94),P<0.05]。胰腺癌組織中ST7L的表達(dá)水平顯著低于對應(yīng)癌旁組織[(5.31±2.89)比(12.63±10.36),P<0.05]。ST7L在胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、AsPC-1、PaCa-2中的表達(dá)水平明顯低于胰腺導(dǎo)管正常細(xì)胞H6C7[(0.25±0.03)、(0.41±0.04)、(0.18±0.03)比(0.58±0.07),P<0.05]。

2.ST7L對胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響:ST7L組及對照組細(xì)胞24 h、48 h、72 h及96 h的增殖能力均依次升高,ST7L組細(xì)胞24 h、48 h、72 h及96 h的增殖能力均明顯低于同期對照組(P<0.05),見表1。ST7L組PANC-1及PaCa-2細(xì)胞凋亡率均高于對照組[(34.14±0.61)比(10.67±0.52)、(25.89±0.48)比(13.64±0.70),P均<0.05]。ST7L組PANC-1及PaCa-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)水平均高于對照組[(0.64±0.13)比(0.17±0.04)、(0.55±0.08)比(0.25±0.03),P均<0.05],而Bcl-2表達(dá)水平均低于對照組[(0.06±0.02)比(0.57±0.10)、(0.38±0.05)比(0.74±0.08),P均<0.05]。

表1 ST7L組及對照組胰腺癌細(xì)胞增殖能力比較

3.4組胰腺癌細(xì)胞β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表達(dá)水平比較:ST7L組細(xì)胞β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表達(dá)均低于對照組;si-ST7L組細(xì)胞β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表達(dá)均高于si-NC組(P<0.05)。見表2。

表2 4組胰腺癌細(xì)胞β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表達(dá)水平比較

討 論

由于胰腺癌隱匿的臨床病程和不明確的癥狀,診斷通常較晚。一項(xiàng)多中心研究表明,通過早期篩查檢測到的胰腺癌患者5年生存率為73.3%、中位生存時間為9.8年,而非篩查發(fā)現(xiàn)的胰腺癌患者的生存率為1.5年[10]。有研究發(fā)現(xiàn),約5%～10%的胰腺癌是由已知基因突變或具有家族聚集引起的[11]。本研究從胰腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制出發(fā),探討ST7L對胰腺癌細(xì)胞增殖及凋亡能力的影響,以期為胰腺癌的治療提供新思路。

近年來ST7L被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào),包括肺癌[12]、乳腺癌[13]和肝細(xì)胞癌[14],提示ST7L在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。我們前期研究發(fā)現(xiàn)ST7L作為微小RNA(miRNA)-331-3p的新型靶基因,可減弱miR-331-3p誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)移[15]。然而,ST7L對胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響及作用機(jī)制仍未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)ST7L在胰腺癌患者血漿、組織及胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯降低,由于ST7L在PANC-1和PaCa-2中的表達(dá)明顯降低,且兩者均為高侵襲性人胰腺癌細(xì)胞系,因此我們選擇兩者作進(jìn)一步研究,結(jié)果表明ST7L可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步探討ST7L發(fā)揮作用的分子機(jī)制,我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ST7L可抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活,而抑制ST7L的表達(dá)可激活Wnt/β-catenin信號通路。Wnt/β-catenin信號通路是一種高度保守的進(jìn)化途徑,參與調(diào)節(jié)關(guān)鍵的細(xì)胞功能,越來越被認(rèn)為是抗癌治療的潛在重要靶點(diǎn)[16-17]。Wnt通路的異常激活是不同類型惡性腫瘤的基礎(chǔ),包括結(jié)直腸癌[18]、乳腺癌[19]和肝癌[20]等。研究表明miR-489-3p可通過靶向PR結(jié)構(gòu)域蛋白5抑制Wnt/β-catenin信號通路,調(diào)控人急性髓系白血病細(xì)胞系U937的遷移和侵襲[21]。當(dāng)Wnt通路被激活時,β-catenin磷酸化被抑制導(dǎo)致細(xì)胞中β-catenin增加并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中,促進(jìn)癌基因如c-Myc、Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄,最終促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和遷移等基因的表達(dá)[22]。為了探討ST7L對Wnt/β-catenin信號通路的作用,我們檢測了其主要成分β-catenin及關(guān)鍵下游效應(yīng)分子c-Myc和Cyclin D1的表達(dá),結(jié)果表明ST7L可減弱β-catenin、c-Myc和Cyclin D1的表達(dá),提示ST7L在胰腺癌細(xì)胞中可能通過降低Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)來發(fā)揮抑癌作用。然而ST7L抑制胰腺癌細(xì)胞生長的具體機(jī)制,干預(yù)其表達(dá)能否影響胰腺癌的發(fā)展并應(yīng)用于臨床等問題還需進(jìn)一步研究。

綜上,本研究表明ST7L在胰腺癌中低表達(dá),可能通過降低Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)來發(fā)揮抑癌作用,基于ST7L/Wnt/β-catenin信號軸的干預(yù)可能為胰腺癌的臨床治療提供分子基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。