基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桂枝-甘草藥對治療竇性心動過緩的作用機(jī)制

杜欣桐，張世亮

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南 250014）

竇性心動過緩（sinus bradycardia，SB）是緩慢性心律失常疾病的一種，當(dāng)竇房結(jié)自律性降低時，由竇房結(jié)產(chǎn)生的沖動低于正常的范圍，即低于60次／分。心率減慢是正常衰老和疾病進(jìn)展的一部分，因此SB在老年人中更為常見［1］。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對SB缺乏有效的治療手段，一般通過異丙腎上腺素、氨茶堿、阿托品等藥物提高心室率［2］。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，長期服用這些抗心律失常的藥物，可能會導(dǎo)致其他心律失常。近年來，隨著醫(yī)療與科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，植入心臟起搏器作為一種新興的治療手段，已經(jīng)成為治療緩慢性心律失常的重要方式，在改善心功能、降低心源性猝死率、提高生活質(zhì)量方面起到積極作用，但其長期療效依然有待進(jìn)一步研究。此外，受植入起搏器的手術(shù)風(fēng)險、術(shù)后并發(fā)癥及患者經(jīng)濟(jì)實力等因素的影響，起搏器在臨床上的應(yīng)用受到限制［3］。中醫(yī)從整體角度出發(fā)，以辨證論治為原則，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)辨識SB，并在治療上取得了顯著療效。趙曉敏等［4］通過分析近20年中醫(yī)治療緩慢性心律失常的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)心腎陽虛證和心陽虧虛證為心律失常的常見證型。郭艷瓊等［5］通過聚類分析發(fā)現(xiàn)治療SB的中藥中使用頻率較高的前兩味中藥分別是甘草、桂枝?，F(xiàn)代研究表明，甘草、桂枝中的部分成分在抗心律失常、擴(kuò)張血管等方面發(fā)揮作用［6-7］。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“藥物-靶點-基因-疾病”的相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析、預(yù)測多種藥物成分共同治療疾病的機(jī)制，其系統(tǒng)性與中醫(yī)學(xué)的整體辨治觀念，以及中藥及其方劑的多成分、多途徑、多靶點協(xié)同作用于人體的原理不謀而合［8］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，通過對藥物的化學(xué)成分、作用靶點和信號通路進(jìn)行分析，探究桂枝-甘草藥對干預(yù)SB的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 桂枝、甘草化學(xué)成分及靶點獲取 以“桂枝”“甘草”為關(guān)鍵詞，檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：／／tcmspw.com／tcmsp.php），以口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，獲得桂枝、甘草的活性成分，并通過挖掘文獻(xiàn)對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證和補(bǔ)充。利用本草組鑒平臺（HERB，http：／／herb.ac.cn／）進(jìn)行藥物成分靶點預(yù)測。

1.2 SB疾病靶點獲取 以“sinus bradycardia”為關(guān)鍵詞，檢索HERB數(shù)據(jù)庫，匯總整理后得到SB疾病的相關(guān)靶點。

1.3 桂枝-甘草藥對預(yù)測靶點與SB疾病靶點的交集靶點篩選 將桂枝、甘草藥物成分預(yù)測靶點和SB疾病靶點導(dǎo)入InteractiVenn（http：／／www.interactivenn.net／），并繪制Venn圖。

1.4 桂枝、甘草成分預(yù)測靶點與SB靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為闡明靶點蛋白之間的相互作用，將藥物成分預(yù)測靶點和SB疾病靶點上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫（https：／／string-db.org），限制物種為“homo sapiens”，設(shè)置靶點置信度分值為0.40，隱藏?zé)o相互作用關(guān)系的靶點后，以TSV 格式將靶點互作數(shù)據(jù)導(dǎo)出，導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件中，繪制蛋白與蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，并對其進(jìn)行分析。

1.5 交集靶點富集分析 將交集靶點導(dǎo)入Metascape平臺（https：／／metascape.org／gp／index.html），限制物種為“homo sapiens”，進(jìn)行基因本體（GO）富集分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。其中，GO 富集分析由生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）3個部分組成。以P＜0.01為篩選條件，選取符合條件的前20 條數(shù)據(jù)，利用微生信平臺（http：／／www.bioinformatics.com.cn／）對其進(jìn)行可視化處理。

1.6 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將桂枝、甘草藥對化學(xué)成分與交集靶點對應(yīng)關(guān)系、交集靶點與KEGG通路對應(yīng)關(guān)系進(jìn)行映射，導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件繪制桂枝-甘草藥對有效成分-SB疾病靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape 3.9.1 內(nèi)置的Network Analyzer功能，分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，獲得節(jié)點的連接度、介度、緊密度相關(guān)信息，并判斷核心靶點及干預(yù)SB的主要活性成分。

2 結(jié)果

2.1 桂枝、甘草化學(xué)成分收集和成分靶點預(yù)測 經(jīng)檢索和篩選，獲得桂枝化學(xué)成分7 種，甘草化學(xué)成分92種。其中，谷甾醇（sitosterol）為兩者共同包含的化合物。預(yù)測桂枝對應(yīng)的成分靶點88個，預(yù)測甘草對應(yīng)的成分靶點1 756個，將兩者靶點合并且去重后獲得245個成分靶點。

2.2 SB疾病靶點 檢索HERB數(shù)據(jù)庫后共獲得SB疾病相關(guān)靶點570個。

2.3 桂枝、甘草成分靶點與SB靶點的交集靶點 將245個成分靶點與570個SB疾病靶點導(dǎo)入Interacti Venn后，共獲得交集靶點52個。見圖1（掃描標(biāo)題右側(cè)二維碼查看圖片）。

2.4 交集靶點的蛋白與蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將52個交集靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)信息，并利用Cytoscape 3.9.1軟件優(yōu)化靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2（掃描標(biāo)題右側(cè)二維碼查看圖片）。圖2提示IL6、TNF、IL1B、CXCL8、MMP9、CCL2、EGF等靶點可能為桂枝-甘草藥對治療SB 的潛在核心靶點。

2.5 交集靶點富集分析結(jié)果 通過Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，篩選后共獲得BP 20項，主要與血液循環(huán)、系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞脂質(zhì)的反應(yīng)等相關(guān)；CC 11項，涉及膜筏、突觸后膜、過氧化物酶體等；MF 12項，包含細(xì)胞因子受體結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、血紅素結(jié)合等。與SB相關(guān)的KEGG 通路主要涉及流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、癌癥途徑、鈣信號通路、HIF-1信號通路、Fox O 信號通路等。利用微生信平臺對GO和KEGG富集分析結(jié)果進(jìn)行處理，分別得到GO 富集分析圖（見圖3，掃描標(biāo)題右側(cè)二維碼查看圖片）和KEGG通路富集分析氣泡圖（見圖4，掃描標(biāo)題右側(cè)二維碼查看圖片）。

2.6 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運用Cytoscape 3.9.1構(gòu)建“桂枝-甘草藥對成分-交集靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，并通過其內(nèi)置工具分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，得到核心成分（槲皮素、山柰酚等）及核心作用靶點（ESRI、AR、NOS2、CALM3、ACN5A等）。桂枝、甘草與竇性心動過緩成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖見圖5（掃描標(biāo)題右側(cè)二維碼查看圖片）。桂枝、甘草與竇性心動過緩成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)中成分節(jié)點參數(shù)見表1。桂枝、甘草與竇性心動過緩成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)中重要靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點參數(shù)見表2。

表1 桂枝、甘草活性成分-竇性心動過緩疾病靶點-通路網(wǎng)絡(luò)中成分節(jié)點參數(shù)

表2 桂枝、甘草活性成分-竇性心動過緩疾病靶點-通路網(wǎng)絡(luò)中重要靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點參數(shù)

3 討論

中醫(yī)將SB歸于“心悸”“遲脈證”“怔忡”等范疇，認(rèn)為該病多因體虛勞倦、情志失調(diào)、外邪所傷及藥食不當(dāng)?shù)葘?dǎo)致氣血陰陽不足，心失濡養(yǎng)，或邪滯心脈，擾亂心神而發(fā)；病機(jī)以陽虛為主，此外亦有血瘀、痰濁、氣滯等，總屬本虛標(biāo)實之證；臨床用藥以補(bǔ)氣、溫通為主要方法。桂枝、甘草為臨床常用的藥對，如在《傷寒論》治療心悸的炙甘草湯、桂枝甘草湯中就有應(yīng)用。甘草味甘，性平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，可補(bǔ)心益氣、復(fù)脈定悸，尤擅治療因心氣虛導(dǎo)致的心悸氣短、脈結(jié)代。桂枝味辛甘，性溫，歸心、肺、膀胱經(jīng)，可溫通心脈，補(bǔ)助胸陽，止悸?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，甘草中含有的甘草次酸及黃酮類成分可以降低心律失常的發(fā)生風(fēng)險［9］；桂枝中的部分成分能夠有效改善冠狀動脈血流循環(huán)、增加心肌營養(yǎng)，為抗心律失常作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)［10］。

本研究結(jié)果推測，桂枝、甘草治療SB的活性成分為槲皮素、山柰酚、金雀花堿、紫檀素等。槲皮素可能通過抑制鈉離子（Na＋）、鈣離子（Ca2＋）內(nèi)流，促進(jìn)鉀離子（K＋）外流，保護(hù)心肌細(xì)胞膜上Na＋-K＋-ATP酶的功能等多種途徑對抗心律失常［11］。山柰酚可通過抑制核因子κB（NF-κB）從而抑制炎癥因子、趨化因子和酶的表達(dá)，同時可以通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，引起動靜脈血管擴(kuò)張，并起到抗血小板聚集和抗血栓形成的作用［12］。金雀花堿在阻止動脈粥樣硬化形成、減少血栓發(fā)生、增加組織血流量等心血管疾病方面均有積極作用［13］。

桂枝、甘草治療SB的核心靶點主要包括ESR1、AR、NOS2、CALM3、SCN5A。雌激素受體1（ESR1）的主要核受體為ERα，廣泛分布于心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，基本作用包括調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗炎、抗動脈粥樣硬化、改善心血管病變［14］。雄激素受體（AR）在心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，因此與心血管相關(guān)疾病關(guān)系密切。AR 通過與雄激素相結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，雄激素可直接作用于心室肌細(xì)胞，改變心室肌細(xì)胞膜的通透性，影響K＋外流，從而調(diào)節(jié)心室肌復(fù)極化，故雄激素水平的改變可以導(dǎo)致心血管不良事件的發(fā)生［15］。一氧化氮合酶（NOS）2屬于NOS家族。當(dāng)NOS被激活時，一氧化氮（NO）合成增加，NO 作為細(xì)胞之間的通訊物質(zhì)，在細(xì)胞免疫、調(diào)節(jié)血管功能和神經(jīng)信號的傳導(dǎo)等生理過程中充當(dāng)重要的信使分子，促進(jìn)多種細(xì)胞的協(xié)同工作［16］；當(dāng)NOS被抑制時，可能導(dǎo)致缺血再灌注損傷，心肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）含量降低，會增加心律失常的可能。當(dāng)心肌缺血時，鈣泵活性降低，細(xì)胞膜上的Na＋-Ca2＋交換增多，胞內(nèi)Ca2＋濃度升高甚至超載，這被廣泛認(rèn)為是心律失常的機(jī)制之一。鈣調(diào)蛋白3（CALM3）通過調(diào)控Ca2＋通道，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)外的Ca2＋濃度，防止Ca2＋超載，發(fā)揮抗心律失常的作用［17］。鈉電壓門控通道α亞基5（SCN5A）為全身鈉通道的一種。Na＋通道在工作時有靜息態(tài)、激活態(tài)和失活態(tài)3種狀態(tài)。在靜息態(tài)時，Na＋通道受到超過閾值的電刺激，使心肌細(xì)胞興奮并產(chǎn)生動作電位，同時幫助傳導(dǎo)，隨后Na＋通道失活，通道重新進(jìn)入靜息態(tài)。藥物和基因突變等多種因素會影響通道構(gòu)象的改變，進(jìn)而影響其功能，導(dǎo)致心律失常的發(fā)生［18］。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，桂枝、甘草作用于SB主要涉及流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、鈣信號通路、HIF-1信號通路、Fox O 信號通路等多種信號通路，可能具有影響血管內(nèi)皮功能、抗細(xì)胞缺氧損傷能力等。切應(yīng)力通過細(xì)胞膜上的受體、胞間連接信號、基底黏著斑蛋白參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等生物過程，可以影響與促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊生成有關(guān)的基因的表達(dá)。低切應(yīng)力能增強(qiáng)NF-κB的活性，增加鈣化基因、炎癥細(xì)胞因子等基因的表達(dá)，抑制eNOS基因，導(dǎo)致NO的產(chǎn)生減少，從而引發(fā)內(nèi)皮功能障礙［19］。缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）是缺氧過程中的重要分子，能夠促進(jìn)血管生成、重建細(xì)胞代謝途徑等，使組織細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境。機(jī)體處于缺氧時，HIF-1能促進(jìn)NOS基因表達(dá)，減少心肌細(xì)胞的凋亡，降低心肌損傷［20］。因此，HIF-1在缺血性疾病中起到至關(guān)重要的作用。Fox O通路參與細(xì)胞凋亡、周期調(diào)控等多種細(xì)胞生物過程，可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并有抗老化的作用，F(xiàn)ox O 蛋白活性增加會產(chǎn)生氧化應(yīng)激抵抗，減少細(xì)胞凋亡，降低心血管疾病的發(fā)病率［21］。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索桂枝-甘草藥對治療SB的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)桂枝-甘草藥對中有多種活性成分作用于疾病靶點，并參與多種信號通路的調(diào)控。然而，依靠上述方法探究藥物作用機(jī)制仍然需要思考一些問題，如中藥配伍時劑量不同，其所含單體成分濃度亦有差異，進(jìn)而導(dǎo)致不同的藥效，且多數(shù)中藥的藥效成分及起效形式等尚未明確，不同成分之間還存在協(xié)同、拮抗作用，難以全部納入分析。現(xiàn)有研究大多以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行有效成分篩選，然而將OB及DL作為評判成分活性程度的唯一指標(biāo)過于絕對，如甘草中的主要成分甘草酸（OB＝19.62%，DL＝0.11）、桂枝中的主要成分桂皮醛（OB＝31.99%，DL＝0.02）無法被上述策略篩選，普遍存在于各種中藥中的槲皮素、山柰酚等成分卻因為具有良好的OB、DL值，被推測為重要成分。此外，中藥也可以改變腸道菌群。腸道微生物能通過生物轉(zhuǎn)化將中藥成分代謝為其他活性物質(zhì)，在藥物代謝動力學(xué)和藥物效應(yīng)動力學(xué)方面起重要作用，如甘草酸因分子量較大，口服后不易通過腸道屏障進(jìn)入血液發(fā)揮效用，但經(jīng)腸道菌群轉(zhuǎn)化后，其代謝產(chǎn)物甘草次酸的生物利用度更高［22］。這種動態(tài)關(guān)聯(lián)在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“成分-靶點-疾病”的靜態(tài)網(wǎng)絡(luò)中難以體現(xiàn)?，F(xiàn)階段網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為研究中醫(yī)藥藥理基礎(chǔ)與作用機(jī)制的熱門工具，為臨床藥物優(yōu)化提供支持，但由于自身局限性，仍需要通過動物實驗、現(xiàn)代基礎(chǔ)研究等方式驗證和豐富其合理性，減少同質(zhì)化。