黃芪多糖通過減輕免疫炎癥抑制病毒性肝炎小鼠肝損傷

陳辰 胡麗霞 （武漢市第一醫(yī)院，武漢 430000）

病毒性肝炎是指由肝炎病毒感染引起的肝臟病變，是臨床上常見的傳染病。流行病學(xué)資料顯示，我國常見的病毒性肝炎病毒類型有甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒，其中乙型肝炎病毒最為常見，其發(fā)病率約為81.54/100 000，病死率約為0.05/100 000［1］。另有資料指出，病毒性肝炎是肝癌的危險(xiǎn)因素，其中慢性乙型肝炎患者罹患肝癌的概率約是健康人群的200倍，可見其危害極為嚴(yán)重［2］。目前臨床上針對病毒性肝炎患者主要采用抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保肝、控制并發(fā)癥等方案治療，但仍有部分患者效果不佳［3-4］。黃芪多糖是中藥材黃芪的有效成分，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，且具有抗病毒、抗炎等作用，且有研究證實(shí)黃芪多糖注射液可保護(hù)乙肝患者的肝功能，但其具體作用機(jī)制有待深入探討［5］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域1（NOD1）是一類胞漿內(nèi)受體，對細(xì)胞內(nèi)的病原體有特異性的識別作用，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)侵入病原體后NOD1表達(dá)升高，可激活其下游的受體相互作用蛋白2（RIP2），進(jìn)而上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65（NF-κB p65），促進(jìn)NF-κB p65磷酸化（p-NF-κB p65）參與免疫炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)組織損害［6-7］。有研究證實(shí)在病毒性肝炎發(fā)生及發(fā)展過程中NOD1/RIP2/NF-κB通路被激活，而阻斷該通路信號傳導(dǎo)有助于減輕免疫炎癥反應(yīng)，抵抗肝損傷［8］。然而黃芪多糖是否可通過該途徑保護(hù)病毒性肝炎的肝組織結(jié)構(gòu)和肝功能尚不清楚。為探討該問題，本研究取60只雌性C3H/HeJ小鼠建立病毒性肝炎模型開展動物實(shí)驗(yàn)，旨在為黃芪多糖在病毒性肝炎患者中的推廣使用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞 60只雌性C3H/HeJ小鼠，無特定病原體級，6～8周齡，體質(zhì)量（21±2） g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK（滬）2020-0001，飼養(yǎng)于小鼠標(biāo)準(zhǔn)代謝籠中，溫度21～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗，自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。L2細(xì)胞株（貨號：G10561）購自中國上海拜利生物科技有限公司。本研究經(jīng)武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心倫理委員會審批通過,審批號：WDRM動(福)第20200607號。

1.1.2 藥物與試劑 黃芪多糖凍干（北京愛迪森生物科技公司，批號：2006134）；胸腺肽-α1（上海豐壽生物科技公司，批號：2004128）；3型鼠肝炎病毒（MHV-3）（上海雅吉公司，貨號：14-36430）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、甲基纖維素、二甲苯溶液、細(xì)胞裂解液（美國Sigma公司，批號：200413、200711、200116、200518）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（Solarbio中國公司，批號：2007135）；結(jié)晶紫染色試劑盒、鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）檢測試劑盒、鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-8檢測試劑盒（上海歌凡生物，批號：2003169、2004155、2003128、2006196、2007102、2005119、2005203）；最小必需培養(yǎng)基-2（MEM-2）（美國Cellgro公司，貨號：G1002159）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司，貨號：15896075）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Qiagen公司，貨號：208132）；NOD1、RIP2、NF-κB p65與內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物序列（參照Gene bank信息，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，委托深圳晶美生物科技有限公司合成并驗(yàn)證）；二甲喹啉法（BCA）蛋白定量試劑盒（美國Sigma公司，批號：200716）；兔抗鼠NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65單克隆抗體工作液，羊抗兔NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65多克隆抗體工作液（Abcam中國公司，批號：RS02507A、RS02611C、RS02718A、RS02756A、RM02619B、RM02723B、RM02804A、RM03108C）。

1.1.3 儀器 RM5220型小鼠標(biāo)準(zhǔn)代謝籠（上海玉研生物科技）；OptiMair型超凈工作臺（新加坡易思高）；TP-114型電子天平（美國Denver公司）；AllegraX-5型臺式離心機(jī)（美國Beckman coulter公司）；MDF-U32V型超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；IN55型CO2培養(yǎng)箱（德國Memmert公司）；TONE96型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（德國Jena公司）；NSW-20PHC型光學(xué)顯微鏡（日本Carton公司）；AU480型全自動生化分析儀（美國Beckman coulter公司）；Trans-Blot Turbo型轉(zhuǎn)膜儀、PowerPacTM型凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模、分組與給藥方法 將60只雌性C3H/HeJ小鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為建模組（50只）和正常組（10只）。建模組采用MHV-3腹腔注射建立病毒性肝炎小鼠模型［9］，取0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）對MHV-3進(jìn)行稀釋，純化后取10 pfu/200 μl腹腔注射，每只200 μl，正常組同步腹腔注射等量無菌PBS。2周后建模組和正常組中各隨機(jī)取1只小鼠斷頭法處死，迅速剝離肝組織，HE染色觀察肝組織病理改變；檢測肝組織病毒空斑數(shù)［10］，計(jì)數(shù)病毒空斑（同1.2.3）。驗(yàn)證建模成功后，將建模組存活小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、胸腺肽組、黃芪多糖低、中、高劑量組。胸腺肽組腹腔注射胸腺肽-α1 10 μg，黃芪多糖低、中、高劑量組腹腔注射100、200、400 mg/kg黃芪多糖凍干溶于1 ml/100 g體質(zhì)量的生理鹽水中腹腔注射（相當(dāng)于臨床等效劑量、2倍臨床等效劑量、4倍臨床等效劑量），模型組和正常組予以等量生理鹽水腹腔注射，各組均每天給藥1次，連續(xù)1個月。

1.2.2 肝臟指數(shù)、肝功能指標(biāo)及炎癥因子水平檢測 各組小鼠均于干預(yù)后采用斷頭法處死，電子天平稱取體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量，肝臟指數(shù)（%）=體質(zhì)量/肝臟質(zhì)量×100%。另摘取小鼠眼球取外周血，3 500 r/min離心，取上清液采用全自動生化分析儀測定各組肝功能指標(biāo)（ALT、AST、TBIL）和炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-8）水平。

1.2.3 肝組織HE染色和病毒滴度檢測 剝離各組小鼠肝組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片，烤片，二甲苯15 min脫蠟2次，梯度乙醇水化（無水乙醇、95%、85%、75%乙醇各3 min），蒸餾水水化3 min。蘇木素染色10 min，流水沖洗后鹽酸乙醇分化，流水藍(lán)化，伊紅復(fù)染1 min，梯度乙醇脫水（75%、85%、95%乙醇和無水乙醇各1 min），二甲苯透明后封固，觀察肝組織病理變化。檢測肝組織病毒空斑數(shù)［10］，取肝組織勻漿，用MEM-2培養(yǎng)基梯度稀釋上清液做滴度分析，另于24孔板內(nèi)培養(yǎng)基培養(yǎng)L2細(xì)胞至匯合率達(dá)90%。將L2細(xì)胞陳舊培養(yǎng)基棄去，用PBS洗滌，將50 μl稀釋好的肝臟組織上清液均勻鋪于細(xì)胞層，室溫下無菌操作臺內(nèi)每10～15 min混合1次，共3次，促使細(xì)胞與病毒充分接觸。將2%甲基纖維素取出與培養(yǎng)液等體積比例混合，500 μl/孔細(xì)胞均勻鋪在被病毒感染的細(xì)胞層，待其凝固后轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)板至CO2培養(yǎng)箱中37 ℃ 16～20 h，取出細(xì)胞并將上層甲基纖維素-培養(yǎng)層挑出，結(jié)晶紫染色，5 min后自來水沖洗，計(jì)數(shù)病毒空斑。

1.2.4 肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達(dá) 采用實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測肝組織上述基因表達(dá)。將肝組織液氮研磨，加入1 ml 預(yù)冷Trizol試劑混勻后提取RNA，調(diào)整濃度為0.5 μg/μl，合成互補(bǔ)的DNA。設(shè)計(jì)并合成PCR反應(yīng)引物，其中NOD1正向引物：5'-GAACTCGAGAATGAAATGAAATTAAATATGG-3'，反向引物：5'-GAACCGCGGACTCATTCATTCAGGGAAACTGG-3'，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度186 bp；RIP2：正向引物：5'-CTGAATATCCTGATGTTGCTTGGC-3'，反向引物：5'-TTGCTACTTCGTGACTGTGAGAG-3'，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度198 bp；NF-κB p65：正向引物：5'-AGTTGAGGGGACTTCCCAGG-3'，反向引物：5'-CCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3'，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度210 bp；GAPDH：正向引物：5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，反向引物：5'-ACGCCTGCTTCACCACCTT-3'，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度140 bp。擴(kuò)增反應(yīng)：94 ℃5 min，40次循環(huán)，94 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s，54 ℃ 10 min。設(shè)置陰性對照，即加入不含擴(kuò)增基因的模板PCR反應(yīng)。60 ℃測定熒光值繪制熔解曲線，2-ΔΔCt計(jì)算。

1.2.5 肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65水平 采用免疫印跡法檢測肝組織上述蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65水平。取100 mg肝臟組織勻漿后加入細(xì)胞裂解液1 ml，提取總蛋白后定量。凝膠分離50 μg蛋白的抽提物，電泳后將其轉(zhuǎn)膜，并于洗膜后加入兔抗鼠單克隆抗體（稀釋比例1∶1 000），4 ℃過夜。再次洗膜后加入酶標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體工作液（稀釋比例1∶2 500），37 ℃ 2 h。再次洗膜后壓片，以Quantity one軟件分析目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值，計(jì)算二者的比值；免疫組化法檢測肝組織上述蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65水平，取100 mg肝臟組織，經(jīng)0.1 mol/L甲醛溶液浸泡24 h固定。石蠟包埋、修整，梯度濃度乙醇脫水（70%乙醇溶液6 h→80%乙醇溶液6 h→95%乙醇溶液Ⅰ12 h→95%乙醇溶液Ⅱ 12 h→100%乙醇Ⅰ1.5 h→100%乙醇Ⅱ 1.5 h）。檸檬酸0.1 g+檸檬酸三鈉0.75 g+200 ml蒸餾水對組織塊進(jìn)行抗原熱修復(fù)，連續(xù)切片（層厚4 μm），65 ℃、24 h烤片。二甲苯15 min 3次，乙醇水化，沖洗5 min，3%過氧化氫溶液孵育（室溫15 min）。37 ℃封閉孵育0.5 h，滴加一抗，沖洗5 min 3次，滴加二抗（1∶2 000），沖洗5 min×3次。二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，樹膠封片。Image J軟件分析各蛋白的積分光密度（IOD）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，采用±s描述，并用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，兩樣本比較采用成組t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型驗(yàn)證及各組樣本量、結(jié)局情況 正常組和建模組小鼠肝組織HE染色顯示，正常組肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心向四周放射，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞聯(lián)系緊密且核大、核圓，核仁明顯，胞質(zhì)豐富，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰；建模組肝細(xì)胞明顯腫脹，且有水樣變性，胞質(zhì)疏松，有散在點(diǎn)狀壞死和淋巴細(xì)胞浸潤，見圖1。

圖1 正常組與建模組小鼠肝組織病理改變（HE染色，×200）Fig.1 Pathological changes of liver tissue in normal group and modeling group （HE staining， ×200）

正常組小鼠肝組織病毒空斑數(shù)為0，建模組為4.20×104個/g），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=148.975，P＜0.001）。根據(jù)HE染色和肝組織病毒空斑數(shù)對比結(jié)果證實(shí)建模組模型建立成功，其中正常組余9只小鼠，建模組有49只存活小鼠，將其采用隨機(jī)數(shù)字表分為模型組（10只）、胸腺肽組（9只）、黃芪多糖低、中、高劑量組（各10只），給藥期間均無小鼠死亡。

2.2 干預(yù)后各組小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST和TBIL水平比較 干預(yù)后各組小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST和TBIL水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組肝臟指數(shù)、血清ALT、AST和TBIL水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，胸腺肽組、黃芪多糖各劑量組肝臟指數(shù)、血清ALT、AST和TBIL水平均降低（P＜0.05）；與胸腺肽組比較，黃芪多糖低劑量組肝臟指數(shù)、血清ALT、AST和TBIL水平均升高（P＜0.05），黃芪多糖高劑量組肝臟指數(shù)、血清ALT、AST和TBIL水平均降低（P＜0.05），見表1。

表1 干預(yù)后各組小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST和TBIL水平比較（±s）Tab.1 Comparison of liver indexes， serum ALT， AST and TBIL levels of mice in each group after intervention （±s）

表1 干預(yù)后各組小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST和TBIL水平比較（±s）Tab.1 Comparison of liver indexes， serum ALT， AST and TBIL levels of mice in each group after intervention （±s）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05；compared with thymosin group， 3）P＜0.05.

TBIL/（μmol·L-1）31.22±6.01 104.25±22.711）64.25±15.402）88.46±20.352）3）62.37±13.282）52.55±10.472）3）34.752＜0.001 Groups Normal （n=9）Model （n=10）Thymosin （n=9）Astragalus polysaccharide low dose （n=10）Astragalus polysaccharide middle dose （n=10）Astragalus polysaccharide high dose （n=10）F P Liver index/%3.55±0.50 5.63±0.891）4.01±0.522）4.32±0.642）3）3.97±0.562）3.71±0.532）3）13.298＜0.001 ALT/（U·L-1）19.25±3.16 178.59±24.671）81.69±17.542）111.22±21.022）3）83.20±16.322）50.17±9.382）3）29.315＜0.001 AST/（U·L-1）87.05±17.20 165.21±24.351）102.04±20.252）140.30±21.782）3）101.91±19.792）93.18±19.602）3）40.068＜0.001

2.3 干預(yù)后各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平比較 干預(yù)后各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，胸腺肽組、黃芪多糖各劑量組血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平均降低（P＜0.05）；與胸腺肽組比較，黃芪多糖低劑量組血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平均升高（P＜0.05），黃芪多糖高劑量組血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平均降低（P＜0.05），見表2。

表2 干預(yù)后各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平比較（±s）Tab.2 Serum TNF-α， IL-1β and IL-8 levels of mice in each group after intervention （±s）

表2 干預(yù)后各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平比較（±s）Tab.2 Serum TNF-α， IL-1β and IL-8 levels of mice in each group after intervention （±s）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with thymosin group， 3）P＜0.05.

IL-8/（mg·L-1）25.45±5.33 786.97±104.551）325.15±60.082）502.13±85.422）3）327.85±61.572）104.86±20.092）3）69.189＜0.001 Groups Normal （n=9）Model （n=10）Thymosin（n=9）Astragalus polysaccharide low dose （n=10）Astragalus polysaccharide middle dose （n=10）Astragalus polysaccharide high dose （n=10）F P TNF-α/（ng·L-1）16.83±3.02 51.52±10.381）34.25±6.822）42.04±7.632）3）32.96±7.012）24.67±5.222）3）31.675＜0.001 IL-1β/（ng·L-1）9.02±1.79 20.30±4.581）14.02±3.042）16.31±3.752）3）13.98±3.012）11.22±2.752）3）42.453＜0.001

2.4 干預(yù)后各組小鼠肝組織病理改變比較 干預(yù)后正常組小鼠肝組織HE染色表現(xiàn)同2.1；模型組肝細(xì)胞有嚴(yán)重水腫，且可見大量點(diǎn)狀壞死灶，有嚴(yán)重肝索排列紊亂、肝竇擠壓變窄、炎癥浸潤等表現(xiàn)；黃芪多糖低劑量組肝細(xì)胞有明顯水腫，有部分點(diǎn)狀壞死灶，肝索排列紊亂、肝竇擠壓變窄等表現(xiàn)；黃芪多糖中劑量組和胸腺肽組肝細(xì)胞有水腫，可見少部分點(diǎn)狀壞死灶，有輕微肝索排列紊亂、肝竇擠壓變窄等表現(xiàn)；黃芪多糖高劑量組少部分肝細(xì)胞水腫，極少壞死，肝細(xì)胞基本聯(lián)系緊密且胞質(zhì)豐富，見圖2。

圖2 干預(yù)后各組小鼠肝組織病理改變（HE染色，×200）Fig.2 Pathological changes of liver tissue of mice in each group after intervention （HE staining， ×200）

2.5 干預(yù)后各組小鼠肝組織病毒空斑數(shù)比較 干預(yù)后各組小鼠肝組織病毒空斑數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組肝組織病毒空斑數(shù)增多（P＜0.05）；與模型組比較，胸腺肽組、黃芪多糖劑量組肝組織病毒空斑數(shù)均降低（P＜0.05）；與胸腺肽組比較，黃芪多糖低劑量組肝組織病毒空斑數(shù)增多（P＜0.05），黃芪多糖高劑量組肝組織病毒空斑數(shù)減少（P＜0.05），見表3。

表3 干預(yù)后各組小鼠肝組織病毒空斑數(shù)比較（±s，1×104個/g）Tab.3 Comparison of viral plaque number in liver tissue of mice in each group after intervention （±s，1×104/g）

表3 干預(yù)后各組小鼠肝組織病毒空斑數(shù)比較（±s，1×104個/g）Tab.3 Comparison of viral plaque number in liver tissue of mice in each group after intervention （±s，1×104/g）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05；compared with thymosin group， 3）P＜0.05.

Groups Virus plaque number Normal （n=9）Model （n=10）Thymosin （n=9）Astragalus polysaccharide low dose （n=10）Astragalus polysaccharide middle dose （n=10）Astragalus polysaccharide high dose （n=10）0 7.10±1.251）3.01±0.542）4.63±0.722）3）2.96±0.522）2.18±0.372）3）47.865＜0.001 F P

2.6 干預(yù)后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較 干預(yù)后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達(dá)均升高（P＜0.05）；與模型組比較，胸腺肽組、黃芪多糖劑量組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達(dá)均降低（P＜0.05）；與胸腺肽組比較，黃芪多糖低劑量組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達(dá)均升高（P＜0.05），黃芪多糖高劑量組肝組織NOD1、RIP2、NFκB p65 mRNA表達(dá)均降低（P＜0.05），見表4。

表4 干預(yù)后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of NOD1，RIP2 and NF-κB p65 in liver tissues of mice in each group after intervention （xˉ±s）

表4 干預(yù)后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of NOD1，RIP2 and NF-κB p65 in liver tissues of mice in each group after intervention （xˉ±s）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05；compared with thymosin group， 3）P＜0.05.

Groups Normal（n=9）Model （n=10）Thymosin （n=9）Astragalus polysaccharide low dose （n=10）Astragalus polysaccharide middle dose（n=10）Astragalus polysaccharide high dose （n=10）NOD1 0.47±0.06 1.38±0.241）0.71±0.122）0.97±0.152）3）RIP2 0.32±0.05 1.55±0.291）0.76±0.092）1.04±0.182）3）NF-κB p65 0.65±0.08 1.46±0.351）0.83±0.072）0.99±0.092）3）0.73±0.102）0.74±0.102）0.85±0.082）0.71±0.102）3）29.256＜0.001 F P 0.60±0.082）3）32.074＜0.001 0.59±0.082）3）29.653＜0.001

2.7 干預(yù)后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65水平比較 干預(yù)后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，胸腺肽組、黃芪多糖劑量組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65水平均降低（P＜0.05）；與胸腺肽組比較，黃芪多糖低劑量組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65水平均升高（P＜0.05），黃芪多糖高劑量組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65水平均降低（P＜0.05），見圖3、圖4、表5、表6。

表5 干預(yù)后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65水平比較（±s）Tab.5 Comparison of NOD1， RIP2 and NF-κB p65 protein expressions and p-NF-κB p65 levels in liver tissue of mice in each group after intervention （±s）

表5 干預(yù)后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65水平比較（±s）Tab.5 Comparison of NOD1， RIP2 and NF-κB p65 protein expressions and p-NF-κB p65 levels in liver tissue of mice in each group after intervention （±s）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05；compared with thymosin group， 3）P＜0.05.

Groups Normal （n=9）Model （n=10）Thymosin （n=9）Astragalus polysaccharide low dose （n=10）Astragalus polysaccharide middle dose （n=10）Astragalus polysaccharide high dose （n=10）NF-κB p65 p-NF-κB p65 0.09±0.03 0.98±0.141）0.34±0.052）0.56±0.092）3）0.32±0.042）0.18±0.032）3）35.433＜0.001 F P NOD1 0.85±0.17 1.69±0.301）1.08±0.172）1.24±0.202）3）1.06±0.152）0.97±0.122）3）30.383＜0.001 RIP2 0.50±0.08 1.36±0.241）0.81±0.132）0.99±0.172）3）0.80±0.112）0.68±0.072）3）37.602＜0.001 0.76±0.12 1.88±0.371）1.05±0.222）1.32±0.252）3）1.02±0.212）0.87±0.172）3）31.245＜0.001

表6 干預(yù)后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白、p-NF-κB p65水平IOD比較（±s）Tab.6 Comparison of IOD of NOD1， RIP2 and NF-κB p65 protein comparisons and p-NF-κB p65 levels in liver tissue of mice in each group after intervention （±s）

表6 干預(yù)后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白、p-NF-κB p65水平IOD比較（±s）Tab.6 Comparison of IOD of NOD1， RIP2 and NF-κB p65 protein comparisons and p-NF-κB p65 levels in liver tissue of mice in each group after intervention （±s）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05；compared with thymosin group， 3）P＜0.05.

p-NF-κB p65 Groups NOD1 RIP2 NF-κB p65 655.54±103.62 1 948.79±429.611）1 043.14±195.852）1 388.60±255.962）3）1 030.36±191.242）841.35±163.772）3）48.819＜0.001 Normal （n=9）Model （n=10）Thymosin （n=9）Astragalus polysaccharide low dose （n=10）Astragalus polysaccharide middle dose （n=10）Astragalus polysaccharide high dose （n=10）F P 1 852.86±315.47 3 796.54±642.831）2 420.53±428.792）2 798.66±504.972）3）2 436.78±435.892）2 169.78±518.772）3）41.527＜0.001 1 231.04±226.97 3 359.95±671.551）1 994.57±302.312）2 586.53±478.062）3）1 971.83±312.542）1 657.52±244.952）3）50.076＜0.001 897.52±143.00 2 218.53±547.051）1 239.51±196.992）1 557.64±301.352）3）1 247.68±201.522）1 026.37±189.662）3）44.784＜0.001

圖3 干預(yù)后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65水平檢測Fig.3 Detection of NOD1， RIP2 and NF-κB p65 protein expressions and p-NF-κB p65 levels in liver tissues of mice in each group after intervention

圖4 干預(yù)后各組小鼠肝組織NOD1、NF-κB p65、RIP2蛋白及p-NF-κB p65水平檢測（免疫組化法，×100）Fig.4 Detection of NOD1 protein，NF-κB p65 protein，RIP2 protein and p-NF-κB p65 levels in liver tissue of mice in each group after intervention （immunohistochemical method， ×100）

3 討論

病毒性肝炎不僅可導(dǎo)致肝組織炎癥損傷，還可發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭甚至是肝細(xì)胞癌。然而目前常用的抗病毒藥物雖然能抑制或殺滅病毒、減輕對肝組織造成的損傷，但其效果仍有改進(jìn)空間。黃芪多糖是中藥材黃芪提取物的主要成分，具有抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、保護(hù)肝臟等作用［11-12］，因此本研究重點(diǎn)探討該藥物對病毒性肝炎小鼠的作用及分子機(jī)制。

當(dāng)病毒侵入機(jī)體后，巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞等可快速識別病原微生物并吞噬、消滅，并且同時可產(chǎn)生干擾素及相關(guān)的細(xì)胞因子，將病毒信息加工處理后傳遞給淋巴細(xì)胞，進(jìn)而激活免疫應(yīng)答，增強(qiáng)對病毒的抵抗作用［13］。然而在病毒感染情況下免疫細(xì)胞可產(chǎn)生干擾素和炎癥細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-1β和IL-8等促炎癥因子，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，若免疫激活狀態(tài)失控則可產(chǎn)生大量的干擾素和炎癥細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥性組織損害。有報(bào)道指出，在病毒性肝炎小鼠可見肝組織炎癥浸潤和點(diǎn)狀壞死灶，且肝細(xì)胞有腫脹、變性表現(xiàn)［14］，本研究結(jié)果與該報(bào)道相符，證實(shí)病毒感染可導(dǎo)致肝組織炎癥損傷，也提示抑制免疫炎癥反應(yīng)是減輕病毒性肝炎肝損傷的重要途徑。

MHV-3腹腔注射是常用的病毒性肝炎建模方法，該病毒株穩(wěn)定，毒力強(qiáng)，可引起小鼠病毒性肝炎炎癥損傷［15］。C3H/HeJ小鼠存在Toll樣受體4（TLR4）基因自發(fā)性突變，對脂多糖無反應(yīng)［16］。而TLR4可與肝炎病毒相互作用引起組織炎癥，因此本研究選用MHV-3腹腔注射方法對C3H/HeJ雌鼠建立病毒性肝炎模型，且獲得了與吳婷等［17］學(xué)者一致的結(jié)果，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利開展奠定了基礎(chǔ)。

本研究中干預(yù)后模型組小鼠肝臟指數(shù)、肝功能、炎癥因子水平和肝組織病毒空斑數(shù)均高于正常組，證實(shí)病毒性肝炎小鼠建模成功，肝組織中有大量MHV-3病毒，且可造成炎癥反應(yīng)并引起肝功能損害，模型組肝組織病理較正常組嚴(yán)重改變，表明該建模方法可導(dǎo)致肝組織損害。此外，本研究中胸腺肽組和黃芪多糖劑量組肝臟指數(shù)、肝功能、炎癥因子水平和肝組織病毒空斑數(shù)均低于模型組，肝組織病理也較模型組減輕，且黃芪多糖高劑量組的效果與作用均最佳，可知胸腺肽和黃芪多糖均可保護(hù)病毒性肝炎小鼠的肝功能，減輕炎癥反應(yīng)和肝組織病理改變，推測與肝組織中病毒感染和復(fù)制受到抑制有直接關(guān)系。黃芪多糖增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗病毒的作用已經(jīng)得到既往報(bào)道的認(rèn)可［18-20］。有研究指出，黃芪多糖可誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，促進(jìn)抗體形成，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能［21］；另有報(bào)道表明，黃芪多糖主要是通過提高非特異性抗體水平增強(qiáng)機(jī)體免疫力從而發(fā)揮抗病毒作用，這表明黃芪多糖很可能通過抑制病毒性肝炎小鼠免疫激活導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)減輕肝組織損傷［22］。既往報(bào)道顯示，黃芪多糖可降低免疫性肝損傷小鼠血清炎癥因子TNF-α水平并改善肝功能指標(biāo)，本研究與該報(bào)道相符［23］；另有研究顯示，黃芪多糖能夠通過調(diào)節(jié)免疫性肝損傷小鼠脾臟淋巴細(xì)胞表面CD28、CD80表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能［24］。本研究在此基礎(chǔ)上探討了黃芪多糖對病毒性肝炎小鼠可能的免疫效應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制，具有一定的創(chuàng)新性。另外胸腺肽屬于胸腺組織分泌的具有生理活性的多肽，也是目前常用的免疫調(diào)節(jié)劑，有報(bào)道證實(shí)胸腺肽-α1可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，并改善慢性乙型肝炎患者的肝功能，推測該藥物很可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕肝損傷發(fā)揮改善肝功能的作用［25］。故而本研究選用胸腺肽-α1作為陽性對照藥物。

病毒感染所致的免疫激活進(jìn)而引發(fā)肝組織炎癥損傷是一個十分復(fù)雜的病理過程，其中NOD1/RIP2/NF-κB通路參與并發(fā)揮重要作用。NODs的寡聚化被認(rèn)為是受體激活與信號傳遞的表現(xiàn)，無論是直接識別病毒感染或病毒感染間接導(dǎo)致的NOD1被激活均可引起免疫炎癥反應(yīng)。煙曲霉菌感染可激活NOD1，進(jìn)而引起氣管上皮和肺組織上皮炎癥浸潤與組織損害，本研究也發(fā)現(xiàn)MHV-3感染可導(dǎo)致肝組織NOD1表達(dá)上調(diào)。RIP2位于NOD1的下游，屬于一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，對半胱氨酸蛋白酶有募集作用，并且能夠與NF-κB通路相互介導(dǎo)，參與細(xì)胞變性、凋亡等［26-27］。有報(bào)道證實(shí)，敲除小鼠胚胎纖維原細(xì)胞中RIP2，NOD1激動劑并不能激活NF-κB，這就說明RIP2是NOD1和NF-κB的橋梁，也是NOD1信號通路中信息轉(zhuǎn)入的關(guān)鍵分子［28］。RIP2被激活后可對IκB激酶家族產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，上調(diào)NF-κB表達(dá)，以NF-κB p65為代表的分子大量活化，p-NF-κB p65水平升高，啟動相關(guān)炎癥基因的表達(dá)，抵御致病微生物。然而NF-κB持續(xù)激活同時也會誘導(dǎo)機(jī)體釋放大量的TNF-α、IL-1β和IL-8等因子，導(dǎo)致組織炎癥浸潤和功能損傷，有研究證實(shí)NF-κB表達(dá)升高甚至可導(dǎo)致器官衰竭，且與炎癥反應(yīng)有緊密關(guān)系［29］。因此在病毒性肝炎治療時抑制NOD1/RIP2/NF-κB通路的信號傳導(dǎo)有利于減輕免疫激活所致的炎癥反應(yīng)引發(fā)的肝組織損傷。本研究結(jié)果中胸腺肽組和黃芪多糖劑量組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA與蛋白表達(dá)，p-NF-κB p65水平均低于模型組，而模型組則均高于正常組，與上述分析一致，推測可能因?yàn)辄S芪多糖是通過抑制NOD1/RIP2/NFκB通路減輕病毒性肝炎小鼠肝損傷的，且高劑量的黃芪多糖效果更理想，提示該藥物在此方面有理想的開發(fā)價(jià)值。

對C3H/HeJ雌鼠采用MHV-3腹腔注射法可建立病毒性肝炎模型，且可見肝組織病理改變和病毒侵害；胸腺肽和黃芪多糖均可降低肝臟指數(shù)，改善肝功能，減輕炎癥反應(yīng)和肝損傷，減少病毒空斑數(shù)；胸腺肽和黃芪多糖可能通過抑制NOD1/RIP2/NF-κB通路減輕病毒性肝炎小鼠肝損傷；黃芪多糖的作用呈劑量依賴性，中劑量黃芪多糖作用與胸腺肽相當(dāng)，而高劑量黃芪多糖作用更理想。