MicroRNA調(diào)節(jié)免疫性血小板減少癥CD4+T細(xì)胞亞群免疫功能的研究進(jìn)展

宋輝 郭一慧 許家威 曾清，2 程緯民，2

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧 530222； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，南寧 530023）

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是因血小板免疫性破壞增加與生成受阻，導(dǎo)致血小板減少的出血性疾病，以皮膚、黏膜及內(nèi)臟出血等為特征，是一種自身免疫性疾病［1］。ITP在成人中通常是慢性過程，而在兒童中，大多數(shù)患者呈急性發(fā)展，但病程較短，自然緩解發(fā)生在6個(gè)月內(nèi)。糖皮質(zhì)激素是ITP的一線治療用藥，部分對(duì)激素治療敏感性低的ITP患者，存在IL-10的相對(duì)減少和致病性IL-17的持續(xù)性表達(dá)，這與CD4+T細(xì)胞亞群的免疫功能異常有關(guān)［2］。隨著對(duì)ITP發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，LIN等［3］發(fā)現(xiàn)趨化因子誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞（helper T cells，Th）的免疫失衡和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）的免疫功能缺陷，可能參與ITP的發(fā)病機(jī)制。微小RNA（microRNA，miRNA）是由20～24個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，通過識(shí)別同源mRNA序列和干擾轉(zhuǎn)錄、翻譯過程來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［4］。研究表明，miRNA可能是ITP中CD4+T細(xì)胞亞群免疫耐受失常的重要調(diào)節(jié)因子［5］。因此，本文重點(diǎn)討論ITP中miRNA調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞1（Th1）/輔助性T細(xì)胞2（Th2）失衡、輔助性T細(xì)胞17（Th17）/Treg失衡和濾泡輔助性T細(xì)胞（thymusdependent lymphocyte，TFH）的作用機(jī)制，探索miRNA參與ITP發(fā)生發(fā)展的相關(guān)免疫機(jī)制，為ITP免疫靶向治療提供新的啟發(fā)。

1 miRNA的調(diào)控機(jī)制

miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，廣泛參與多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞分化、發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)和生存等［6］。miRNA的轉(zhuǎn)錄是一個(gè)復(fù)雜的過程，在細(xì)胞核中miRNA基因片段由RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，Pol Ⅱ）轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA），經(jīng)過Drosha酶切割形成60～70 nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，即miRNA前體（pre-miRNA）。然后，pre-miRNA通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Exportin-5）進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)Dicer酶切割莖環(huán)產(chǎn)生雙鏈小RNA，隨后雙鏈RNA解體，形成成熟的miRNA。成熟的miRNA與argonaute-2蛋白結(jié)合，裝配形成miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（miRNAinduced silencing complex，miRISC）。此時(shí)，激活的miRISC通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則識(shí)別mRNA的3'-UTR（3'-untranslated region，3'-UTR），促進(jìn)mRNA的翻譯抑制或降解［7］。miRNA特有的調(diào)節(jié)形式，已經(jīng)被證明與CD4+T細(xì)胞亞群免疫功能的正常執(zhí)行有關(guān)，并且ITP患者存在miRNA的異常表達(dá)，提示miRNA可能是ITP發(fā)病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［8-9］。

2 miRNA調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞亞群

CD4+T細(xì)胞識(shí)別主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類抗原（major histocompatibility complex class Ⅱ，MHC Ⅱ）后被激活，在特定的細(xì)胞因子（IL-12、IL-25、IL-33、IL-6、TGF-β、ICOS）驅(qū)動(dòng)下，分化為Th1、Th2、Th17、Treg和TFH等亞群，參與ITP的免疫功能調(diào)節(jié)［10-11］。CD4+T細(xì)胞分化過程中阻斷miRNA的轉(zhuǎn)錄程序，可直接導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞亞群分化障礙和細(xì)胞因子產(chǎn)生異常：①Dicer酶缺失的Th細(xì)胞受到T細(xì)胞受體信號(hào)的刺激減弱，增殖功能降低，并且表現(xiàn)為干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）的優(yōu)先表達(dá)；②Argonaute 2蛋白缺乏時(shí)Th細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子增多，表明部分miRNA下調(diào)后，減弱了抑制Th分化基因的表達(dá)；③miRNA的調(diào)控機(jī)制對(duì)Treg及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3發(fā)育具有重要作用，如Dicer酶或Drosha酶特異性缺失的條件下，Treg的免疫抑制功能會(huì)受損；④miRNA對(duì)TFH發(fā)育成熟的關(guān)鍵因子B細(xì)胞淋巴瘤-6（B cell lymphoma 6，BCL-6）和C-X-C型趨化因子受體-5（C-X-C chemokine receptor 5，CXCR5）具有靶向調(diào)節(jié)作用［12］。miRNA調(diào)控ITP中CD4+T細(xì)胞亞群的免疫機(jī)制復(fù)雜多樣，基于現(xiàn)有研究基礎(chǔ)總結(jié)如下：

2.1 miRNA調(diào)節(jié) Th1/Th2失衡 Th1/Th2免疫功能失衡是ITP發(fā)病的重要因素，Th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答異常占主導(dǎo)地位，通過分泌不同的細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［13］。Th1由轉(zhuǎn)錄因子T-bet特異性調(diào)控，主要產(chǎn)生IL-2、TNF-α和IFN-γ，而Th2由GATA結(jié)合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）特異性調(diào)控，主要產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-10，這些細(xì)胞因子的異常表達(dá)與ITP免疫調(diào)節(jié)紊亂密切相關(guān)［14］。

ITP患者血液中IL-18與靶細(xì)胞表面的IL-18受體（IL-18R）結(jié)合，促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，增強(qiáng)Th1的免疫應(yīng)答，抑制Th2的免疫反應(yīng)［15-16］。ZHAO等［17］發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）來源的miRNA-130a表達(dá)下調(diào)，能夠增強(qiáng)IL-18的表達(dá)，使得Th1免疫應(yīng)答增強(qiáng)，導(dǎo)致生成IFN-γ和TNF-α超過閾值引起ITP的發(fā)生發(fā)展。miRNA-130a對(duì)IL-18的靶向調(diào)節(jié)機(jī)制，一定程度上解釋了ITP患者IL-18升高和Th1/Th2免疫功能失衡的原因。ITP患兒PBMCs中miRNA-15a的表達(dá)明顯下調(diào)，并且與IL-2、IFN-γ的含量成反比，與IL-4、IL-10的含量成正比，提示miRNA-15a可能是導(dǎo)致Th1/Th2免疫功能失衡的原因之一［18］。此外，WU等［19］發(fā)現(xiàn)miRNA-15a通過靶向調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子-3（signaling transcription activator-3，STAT3），抑制STAT3信號(hào)通路的激活，促使Th1分泌的IFN-γ和TNF-α表達(dá)水平降低，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)。因此，miRNA-15a可能通過靶向調(diào)節(jié)STAT3，從而減弱ITP患者Th1的免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)Th1/Th2的免疫功能失衡。ITP患者PBMCs中的miRNA-107、miRNA-205-5p、miRNA-138-5p、miRNA-326、miRNA-1827和miRNA-185-5p表達(dá)下調(diào)，并且能與T-bet和GATA3 mRNA的3'-UTR結(jié)合，參與Th1/Th2免疫功能失衡的調(diào)節(jié)［20］。

2.2 miRNA調(diào)節(jié)Th17/Treg失衡 Th17/Treg免疫功能失衡是引起ITP的重要機(jī)制，Treg通過產(chǎn)生IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）抑制CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞的過度激活和增殖，從而維持機(jī)體免疫功能平衡；Th17分泌的IL-17與靶細(xì)胞表面的IL-17受體（IL-17R）結(jié)合，導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子的釋放增加，二者共同參與ITP的發(fā)生與發(fā)展［21］。

研究證明，活動(dòng)期ITP患者CD4+T細(xì)胞中的程序性死亡受體-1（programmed cell death 1，PD-1）表達(dá)增強(qiáng)，而樹突狀細(xì)胞中的細(xì)胞程序性死亡配體-1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）表達(dá)減弱［22］。此外，ITP患者中分泌型PD-1（sPD-1）表達(dá)增加，與PD-L1結(jié)合阻斷PD-1/PD-L1通路，導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)減少，同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了分泌型PD-L1（sPD-L1）激活PD-1/PD-L1通路后PBMCs中IFN-γ、IL-17水平降低，IL-4和TGF-β水平升高，可改善ITP患者Th17/Treg的免疫失衡［23-24］。ITP患者中PD-1/PD-L1通路的激活或抑制對(duì)于血小板水平的恢復(fù)和Th17/Treg免疫功能的調(diào)節(jié)具有重要作用。CHANG等［25］發(fā)現(xiàn)ITP患者PBMCs中miRNA-155-5p表達(dá)上調(diào)，并且抑制miRNA-155-5p能激活PD-1/PD-L1通路介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2極化和恢復(fù)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）的表達(dá)，從而抑制ITP疾病的發(fā)生或進(jìn)展。此外，GUAN等［26］發(fā)現(xiàn)SOCS1通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和視黃酸受體相關(guān)孤兒受體γt（retinoic acid receptor-related orphan receptors γt，RORγt）影響Th17/Treg的免疫平衡。因此，miRNA-155-5p介導(dǎo)PD-1/PD-L1通路和靶向調(diào)節(jié)SOCS1的作用機(jī)制，對(duì)于ITP患者Th17/Treg的免疫功能平衡具有重要作用，有可能成為新的治療靶點(diǎn)。

ITP患者CD4+T細(xì)胞中的miRNA-99a表達(dá)下調(diào)，而miRNA-182-5p、miRNA-183-5p表達(dá)上調(diào)，同時(shí)miRNA-99a調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的免疫功能，參與IL-10的表達(dá)；miRNA-182-5p、miRNA-183-5p調(diào)控Th17細(xì)胞的免疫功能，而miRNA-183-5p與血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)［27］。miRNA-99a通過靶向調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞中的雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖并抑制Th17的分化［28］。ITP患者miRNA-99a可能通過調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路影響Th17/Treg的免疫功能失衡，而miRNA-182-5p和miRNA-183-5p參與Th17/Treg免疫失衡機(jī)制尚未明確。LI等［29］發(fā)現(xiàn)，ITP患者PBMCs中的miRNA-106b-5p表達(dá)上調(diào)，通過靶向抑制核受體亞家族4-A族成員-3（nuclear receptor subfamily 4 group A member 3，NR4A3）的轉(zhuǎn)錄活性，引起Foxp3的表達(dá)下調(diào)，從而減弱Treg的分化，導(dǎo)致Th17/Treg的免疫功能失衡。ITP中抑制miRNA-106b-5p的表達(dá)，恢復(fù)NR4A3的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)Foxp3的表達(dá)，對(duì)于Treg免疫抑制功能的正常執(zhí)行具有重要意義。

ITP患者CD4+T細(xì)胞中母系表達(dá)基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）抑制miRNA-125a-5p的表達(dá)，導(dǎo)致Foxp3表達(dá)降低和RORγt表達(dá)增加，提示miRNA-125a-5p可能通過干擾Th17/Treg的免疫功能參與ITP發(fā)病［30］。因此，進(jìn)一步探討MEG3對(duì)miRNA-125a-5p的調(diào)節(jié)機(jī)制，可能是揭示ITP患者Th17/Treg免疫功能失衡的重要途徑之一。HE等［31］研究發(fā)現(xiàn)ITP患者CD4+T細(xì)胞中的IL-1R相關(guān)激酶-1（IL-1R-associated kinase-1，IRAK1）表達(dá)增加，使得Treg細(xì)胞比例減少和Th17比例升高，導(dǎo)致Th17/Treg免疫功能異常。此外，該項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，ITP患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）來源的miRNA-146a-5p，通過靶向抑制IRAK1的表達(dá)，從而恢復(fù)Th17/Treg的免疫平衡。miRNA-146a-5p與IRAK1的相互作用，對(duì)ITP患者維持Th17/Treg免疫平衡具有重要意義，有可能成為未來治療ITP的新靶點(diǎn)。

2.3 miRNA調(diào)節(jié)TFH細(xì)胞 TFH細(xì)胞是生發(fā)中心的CD4+T細(xì)胞亞群，能夠協(xié)助B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體，并且在ITP中表達(dá)增加，提示TFH可能參與ITP免疫發(fā)病機(jī)制［32］。XIE等［33］發(fā)現(xiàn)，ITP患者中TFH與血小板膜糖蛋白Ibα（glycoprotein Ibα，GPIbα）抗體表達(dá)量呈正相關(guān)，提示TFH可能通過誘導(dǎo)血小板抗體的產(chǎn)生，參與血小板破壞。已有研究證明，miRNA通過特定的細(xì)胞因子或通路，如CXCR5、E3泛素蛋白連接酶1（pellino E3 ubiquitin protein ligase 1，Peli1）、可誘導(dǎo)性共刺激因子（inducible co-stimulator，ICOS）和磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）-蛋白酶B（AKT）信號(hào)通路等，調(diào)節(jié)TFH的分化和功能［34］。

Peli1調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）信號(hào)促進(jìn)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，LI等［35］發(fā)現(xiàn)miRNA-153-3p能夠調(diào)節(jié)Peli1的表達(dá)，從而減弱臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC）介導(dǎo)的TFH細(xì)胞減少和Treg細(xì)胞增加。此外，Peli1的缺乏促進(jìn)了C-rel原癌基因介導(dǎo)的ICOS表達(dá)，使得PI3K-AKT信號(hào)通路被激活，從而抑制了下游的krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2（krüppel-like factor 2，KLF2）表達(dá)，并且KLF2能抑制TFH的分化［36］。TFH的異常表達(dá)是ITP血小板破壞增加的因素之一，miRNA-153-3p調(diào)節(jié)Peli1/C-rel/KLF2軸控制TFH的分化，有可能揭示ITP的發(fā)病機(jī)制。ITP患者中BCL-6表達(dá)增加，從而促進(jìn)TFH的分化［33］。CXCR5是TFH分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，YU等［37］發(fā)現(xiàn)miRNA-17～92簇抑制了CXCR5的表達(dá)，然而BCL-6又能夠抑制miRNA-17～92簇的表達(dá)，正向引導(dǎo)TFH的分化。因此，BCL-6、miRNA-17～92簇、CXCR5之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系，可能解釋了ITP中TFH表達(dá)上調(diào)的原因，為ITP的免疫靶向治療提供啟發(fā)。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

ITP的發(fā)病機(jī)制與CD4+T細(xì)胞亞群分泌的細(xì)胞因子失衡密切相關(guān)，而細(xì)胞因子的分泌失衡是ITP中CD4+T細(xì)胞亞群免疫功能紊亂的原因之一。近年來，隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miRNA通過不同的靶點(diǎn)或信號(hào)通路干擾Th1/Th2、Th17/Treg和TFH的免疫功能，導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌失衡參與ITP的發(fā)病機(jī)制（圖1）。但miRNA在ITP患者CD4+T細(xì)胞亞群中的表達(dá)情況與調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞亞群免疫功能的機(jī)制目前尚未完全闡明。因此，探索miRNA對(duì)ITP中CD4+T細(xì)胞亞群的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，有助于更深入地闡明ITP的免疫發(fā)病機(jī)制并為開發(fā)ITP的免疫靶向藥物提供依據(jù)。

圖1 miRNA調(diào)節(jié)ITP中CD4+T細(xì)胞亞群的免疫機(jī)制Fig.1 Immune mechanism of miRNA regulating CD4+T cells subsets in ITP