鳶尾黃素通過調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路改善血管性癡呆大鼠認知缺陷

丁旭 鄧祥敏 殷紫 劉旭 譚東明 尹紅英 （.江蘇護理職業(yè)學院中醫(yī)藥學院，淮安 3005； .江蘇護理職業(yè)學院附屬淮安市淮陰醫(yī)院腫瘤科，淮安 300）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）又稱腦梗后癡呆，指大腦因缺血、缺氧等原因造成神經(jīng)功能異常，引發(fā)機體記憶、認知功能及行為障礙的神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］。VD發(fā)病原因眾多，是老年癡呆常見病因之一，主要與腦血管因素有關。VD患病率越來越高，且趨于年輕化，臨床主要表現(xiàn)為認知障礙，且隨時間推移逐漸加重，嚴重時影響患者生活和社交［2-3］。VD發(fā)病機制尚不明確，迄今為止未發(fā)現(xiàn)可有效改善認知障礙癥狀的抗精神病藥物。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）作為病原體主要受體，可激活機體固有免疫應答，在天然免疫應答中起關鍵作用［4］。核因子κB（nuclear factor-κB，NFκB）是B細胞中存在的主要核轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種炎癥細胞因子、免疫應答等多種生物學過程。髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是TLR信號通路關鍵連接蛋白，可激活NFκB，參與炎癥反應，在多種非髓樣組織中表達［5］。多項研究均表明TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在免疫及炎癥機制中發(fā)揮作用［6］。研究顯示芹菜素可能通過抑制NF-κB表達改善動脈粥樣硬化大鼠病情發(fā)展［7］。射干是一種常見中藥材，具有清熱解毒、化痰散結(jié)功效。鳶尾黃素是存在于中藥材射干中具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥物活性的異黃酮類化合物。研究顯示鳶尾黃素可減輕糖尿病腎病大鼠腎臟損傷，發(fā)揮腎功能保護作用，可能通過調(diào)節(jié)NF-κB途徑發(fā)揮作用，但尚無研究報道鳶尾黃素在VD中的作用［8］。本研究旨在分析鳶尾黃素對VD大鼠認知缺陷的影響，并初步探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 鳶尾黃素購于北京華威銳科化工有限公司（純度＞98%）；吡拉西坦片購于百正藥業(yè)股份有限公司（批準文號：國藥準字H4102-2772，規(guī)格：0.4 g×100片）；戊巴比妥鈉購于上海氟德化工有限公司；動物用青霉素鈉購于寧海源泰獸藥有限公司；小動物磁共振成像儀購于上海玉研科學儀器有限公司；MT-200 Morris水迷宮購于北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、高親和力受體酪氨酸激酶（phosphorylated tyrosine kinase receptor b，TrkB）、磷酸化TrkB（p-TrkB）、TLR4、MyD88、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB p65和β-actin抗體及相應二抗購于美國ABsci公司。

1.1.2 實驗動物 SPF級健康Wistar大鼠72只，6～8周齡，體質(zhì)量（280±18） g，雌雄各半，購自揚州大學，許可證號：SCXK（蘇）2017-0007。所有大鼠均飼養(yǎng)于標準環(huán)境，光照/黑暗各12 h，溫度（25±5） ℃，濕度45%，自由飲水采食，適應性喂養(yǎng)7 d后構(gòu)建VD大鼠模型。本研究經(jīng)淮安市第一人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 建模和分組［9］將72只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、鳶尾黃素低、中、高劑量組和陽性對照組，每組12只。所有大鼠建模前禁食1 d后稱重。所有大鼠采用戊巴比妥鈉麻醉后于鎖骨上緣至頜下局部區(qū)域消毒，剔毛備皮。模型大鼠沿正中線切開，分離雙側(cè)頸總動脈，采用雙側(cè)頸動脈結(jié)扎法建立VD模型。假手術(shù)組大鼠僅分離雙側(cè)頸總動脈后縫合。整個手術(shù)過程取暖保證大鼠體溫，確保存活率。以造模大鼠新物體偏愛系數(shù)降低為造模成功標準［10］。除去建模過程中死亡大鼠，保證每組應有數(shù)量。

1.2.2 給藥方式 術(shù)后2周，鳶尾黃素低、中、高劑量組分別灌胃25、50、100 mg/kg鳶尾黃素，陽性對照組大鼠灌胃324 mg/kg吡拉西坦。假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等劑量生理鹽水，1次/d，連續(xù)28 d。

1.2.3 Morris水迷宮實驗 灌胃給藥結(jié)束后，各組大鼠進行Morris水迷宮實驗，1～5 d每天上午進行認知功能檢測：空間探索實驗及定位航行試驗。測量目標區(qū)域停留時間及穿越平臺次數(shù)，檢測大鼠學習記憶能力。

1.2.4 樣本采集 麻醉大鼠，采用微透析探針采集大鼠海馬組織間液35 μl，-80 ℃保存，用于大鼠海馬組織間液神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測。大鼠麻醉后手術(shù)剝離腦組織并分離雙側(cè)海馬組織，-80 ℃保存，用于大鼠海馬組織BDNF、TrkB水平檢測。

1.2.5 高效液相色譜-電化學檢測大鼠海馬組織間液神經(jīng)遞質(zhì)水平 高效液相色譜-電化學檢測海馬組織間液去甲腎上腺素（noradrenaline，NE）、多巴胺（dopamine，DA）、5-羥色胺（serotonin，5-HT）和5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA）水平。

1.2.6 RT-qPCR檢測大鼠海馬組織BDNF、TrkB表達 取海馬組織，Trizol法提取大鼠海馬組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度。按TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明以RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA并于4 ℃保存，置于RT-PCR儀進行PCR擴增，反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火35 s，65 ℃延伸 30 s，擴增35個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，引物序列BDNF F：5′-AGGGGCATAGACAATCG-3′，R：5′-TTCCCCTTGATAATGGTC-3′；TrkB F：5′-AGTCGTCGAGACATGTC-3′，R：5′-CTGAAGACGACTGTTG-3′；β-actin F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCt方法統(tǒng)計BDNF和TrkB mRNA相對表達。

1.2.7 Western blot檢測海馬組織蛋白表達 取出海馬組織，加入RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。沸水浴中煮沸10 min，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入一抗（1∶5 000）4 ℃孵育過夜。次日PBS洗滌3次，加入相應二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，ECL發(fā)光液進行顯色，內(nèi)參選擇β-actin。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS22.0軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料±s行t檢驗比較兩組間差異，單因素方差分析多組間差異。檢驗水準為α=0.05，雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據(jù)均采用Graph Pad Prism 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠逃避潛伏期比較 模型組大鼠1～5 d逃避潛伏期均長于假手術(shù)組（P＜0.05）。與模型組相比，鳶尾黃素中、高劑量組和陽性對照組大鼠1～5 d逃避潛伏期均下降（P＜0.05）。模型組和鳶尾黃素低劑量組大鼠1～5 d逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。鳶尾黃素高劑量組和陽性對照組大鼠1～5 d逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較（±s，n=12，s）Tab.1 Comparison of escape latency in each group （±s， n=12，s）

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較（±s，n=12，s）Tab.1 Comparison of escape latency in each group （±s， n=12，s）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05.

Groups1 d2 d3 d4 d5 d am operation72.56±15.5239.07±10.0626.70±10.5316.77±5.2110.84±3.48 Model94.47±15.901）74.58±11.381）51.82±9.761）41.91±7.851）31.98±6.631）23.56±7.33 19.03±4.032）15.13±2.972）13.99±2.042）Sh Low-dose tectorigenin Medium-dose tectorigenin High-dose tectorigenin Positive control 83.22±19.63 76.84±18.002）74.98±16.612）73.41±16.012）60.56±17.54 53.94±15.182）49.11±16.662）44.37±11.952）41.40±12.05 34.77±8.422）31.73±10.042）29.65±8.912）31.84±10.79 28.54±8.222）25.72±6.432）22.55±5.462）

2.2 各組大鼠目標區(qū)域停留時間、穿越平臺次數(shù)模型組大鼠目標區(qū)域停留時間和穿越平臺次數(shù)小于假手術(shù)組（P＜0.05）。與模型組相比，鳶尾黃素中、高劑量組和陽性對照組大鼠目標區(qū)域停留時間和穿越平臺次數(shù)增加（P＜0.05）。模型組和鳶尾黃素低劑量組目標區(qū)域停留時間和穿越平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。鳶尾黃素高劑量組和陽性對照組目標區(qū)域停留時間和穿越平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 各組大鼠目標區(qū)域停留時間和穿越平臺次數(shù)比較（±s，n=12）Tab.2 Comparison on stay time in target area and times of crossing platform in each group （±s，n=12）

表2 各組大鼠目標區(qū)域停留時間和穿越平臺次數(shù)比較（±s，n=12）Tab.2 Comparison on stay time in target area and times of crossing platform in each group （±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05.

Times of crossing platform/times 6.43±1.57 2.48±1.451）3.87±1.37 4.85±1.322）5.19±1.712）5.47±1.652）Groups Sham operation Model Low-dose tectorigenin Medium-dose tectorigenin High-dose tectorigenin Positive control Stay time in target area/s 39.52±7.61 19.31±6.711）27.45±6.92 29.38±6.892）33.63±6.712）35.42±6.742）

2.3 各組大鼠海馬組織間液NE、DA、5-HT和5-HIAA水平比較 模型組大鼠海馬組織間液NE、DA、5-HT和5-HIAA水平均低于假手術(shù)組（P＜0.05）；與模型組相比，鳶尾黃素中、高劑量組和陽性對照組大鼠海馬組織間液NE、DA、5-HT和5-HIAA水平均升高（P＜0.05）；模型組和鳶尾黃素低劑量組大鼠海馬組織間液神經(jīng)遞質(zhì)水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。鳶尾黃素高劑量組和陽性對照組大鼠海馬組織間液神經(jīng)遞質(zhì)水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表3）。

表3 各組大鼠海馬組織間液神經(jīng)遞質(zhì)水平比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison on levels of neurotransmitters in hippocampus interstitial fluid in each group （±s，n=12）

表3 各組大鼠海馬組織間液神經(jīng)遞質(zhì)水平比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison on levels of neurotransmitters in hippocampus interstitial fluid in each group （±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05.

5-HIAA/（ng·ml-1）28.39±3.64 15.67±2.271）17.45±2.82 22.99±2.752）25.00±3.492）27.67±3.552）Groups Sham operation Model Low-dose tectorigenin Medium-dose tectorigenin High-dose tectorigenin Positive control NE/（ng·ml-1）41.76±6.79 23.23±4.211）24.96±3.73 31.51±3.822）34.84±4.282）36.96±6.552）DA/（ng·μl-1）38.20±3.13 15.43±1.661）28.94±3.54 31.24±3.482）35.46±4.412）36.74±2.462）5-HT/（ng·ml-1）60.41±6.13 34.88±4.341）37.11±3.38 43.66±3.242）50.77±3.712）58.29±2.402）

2.4 各組大鼠海馬區(qū)組織BDNF、TrkB mRNA水平比較 模型組大鼠海馬區(qū)組織BDNF、TrkB mRNA水平明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）；鳶尾黃素中、高劑量組和陽性對照組大鼠海馬區(qū)組織BDNF、TrkB mRNA水平明顯高于模型組（P＜0.05）。模型組和鳶尾黃素低劑量組大鼠海馬區(qū)組織BDNF、TrkB mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。鳶尾黃素高劑量組和陽性對照組大鼠海馬區(qū)組織BDNF、TrkB mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表4）。

表4 各組大鼠海馬組織BDNF、TrkB mRNA水平比較（±s，n=12）Tab.4 Comparison on mRNA levels of BDNF and TrkB in hippocampus in each group （±s，n=12）

表4 各組大鼠海馬組織BDNF、TrkB mRNA水平比較（±s，n=12）Tab.4 Comparison on mRNA levels of BDNF and TrkB in hippocampus in each group （±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05.

TrkB mRNA level 1.30±0.27 0.35±0.151）0.49±0.21 0.92±0.212）1.15±0.312）1.23±0.262）Groups Sham operation Model Low-dose tectorigenin Medium-dose tectorigenin High-dose tectorigenin Positive control BDNF mRNA level 2.41±0.42 0.51±0.181）0.66±0.27 1.46±0.352）1.78±0.362）2.12±0.372）

2.5 各組大鼠海馬組織BDNF、TrkB 蛋白水平比較 模型組大鼠海馬組織BDNF、p-TrkB /TrkB蛋白水平明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）；鳶尾黃素中、高劑量組和陽性對照組大鼠海馬組織BDNF、p-TrkB/TrkB蛋白水平明顯高于模型組（P＜0.05）。模型組和鳶尾黃素低劑量組大鼠海馬組織BDNF、p-TrkB/TrkB蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。鳶尾黃素高劑量組和陽性對照組大鼠海馬組織BDNF、p-TrkB/TrkB蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表5、圖1）。

圖1 各組大鼠海馬組織BDNF、TrkB 蛋白水平比較Fig.1 Comparison on BDNF and TrkB proteins levels in hippocampus in each group

表5 各組大鼠海馬組織BDNF、TrkB蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.5 Comparison on BDNF and TrkB proteins levels in hippocampus in each group （±s，n=12）

表5 各組大鼠海馬組織BDNF、TrkB蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.5 Comparison on BDNF and TrkB proteins levels in hippocampus in each group （±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05.

p-TrkB/TrkB 1.18±0.37 0.28±0.091）0.38±0.18 0.72±0.252）0.86±0.362）1.02±0.332）Groups Sham operation Model Low-dose tectorigenin Medium-dose tectorigenin High-dose tectorigenin Positive control BDNF 1.29±0.49 0.28±0.101）0.33±0.14 0.90±0.372）1.13±0.442）1.18±0.512）

2.6 各組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平比較 模型組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）；與模型組相比，鳶尾黃素中、高劑量組和陽性對照組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。模型組和鳶尾黃素低劑量組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。鳶尾黃素高劑量組和陽性對照組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表6、圖2）。

圖2 各組大鼠TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平Fig.2 TLR4，MyD88 and p-NF-κB p65/NF-κB p65 protein levels in hippocampus in each group

表6 各組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NFκB p65 蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.6 Comparison on of TLR4， MyD88 and p-NF-κB p65/NF-κB p65 proteins levels in hippocampus in each group （±s，n=12）

表6 各組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NFκB p65 蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.6 Comparison on of TLR4， MyD88 and p-NF-κB p65/NF-κB p65 proteins levels in hippocampus in each group （±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05.

p-NF-κB p65/NF-κB p65 Groups TLR4 MyD88 0.10±0.02 0.45±0.131）0.41±0.11 0.20±0.072）0.15±0.032）0.12±0.032）Sham operation Model Low-dose tectorigenin Medium-dose tectorigenin High-dose tectorigenin Positive control 0.09±0.02 0.30±0.051）0.27±0.06 0.17±0.042）0.14±0.032）0.11±0.032）0.09±0.03 0.41±0.061）0.38±0.06 0.18±0.042）0.13±0.022）0.11±0.032）

3 討論

VD是腦血管病變所致智力障礙，與多種危險因素有關。盡管該病具有早期可預防性，但患病率和致死率常年居高不下［11-12］。本研究發(fā)現(xiàn)VD模型大鼠記憶能力明顯受損，經(jīng)不同劑量鳶尾黃素干預后，大鼠空間學習記憶能力提高，說明鳶尾黃素在Morris水迷宮實驗中提高了VD模型大鼠學習記憶能力，對大腦神經(jīng)有保護作用，有望成為改善認知缺陷的潛在治療藥物。

本研究中，模型組大鼠海馬組織間液NE、DA、5-HT和5-HIAA水平明顯低于假手術(shù)組，經(jīng)不同劑量鳶尾黃素干預后，大鼠海馬組織間液NE、DA、5-HT和5-HIAA水平明顯升高。神經(jīng)遞質(zhì)是大腦中樞中存在的一類活性化學物質(zhì)，主要抑制大腦清醒興奮，控制肌肉收縮、命令指令［13-14］。NE神經(jīng)元是最主要的交感神經(jīng)突觸遞質(zhì)，參與中樞系統(tǒng)記憶學習［15］；DA屬于兒茶酚胺類物質(zhì)，用于傳遞脈沖，調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)［16］；5-HT是一種單胺神經(jīng)遞質(zhì)，屬于抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其水平變化與人體記憶、睡眠及情緒有關［17］。研究顯示益腎調(diào)氣法可提高VD大鼠右側(cè)海馬、前額葉皮質(zhì)5-HT、NE、DA含量，改善大鼠學習記憶能力［18］。本研究顯示，鳶尾黃素干預VD大鼠可提高海馬組織間液NE、DA、5-HT和5-HIAA水平，說明鳶尾黃素可改善VD大鼠大腦海馬區(qū)域神經(jīng)遞質(zhì)減少情況，提高記憶能力。

海馬結(jié)構(gòu)主司大腦記憶和認知，其結(jié)構(gòu)破壞可影響大腦記憶功能，嚴重時可誘發(fā)VD。本研究中，模型組大鼠海馬組織BDNF、TrkB mRNA和蛋白水平明顯低于假手術(shù)組；VD模型大鼠給予不同劑量鳶尾黃素干預后，海馬組織BDNF、TrkB mRNA和蛋白水平明顯升高。BDNF主要存在于大腦皮質(zhì)、海馬體，是一種具有生物學功能的神經(jīng)營養(yǎng)因子，支持大腦缺血后中樞和周圍神經(jīng)元存活［19］。已有研究證實BDNF與神經(jīng)存活、學習、記憶、突觸活動等行為有關，通過與受體TrkB結(jié)合改善大腦學習記憶功能［20］。大腦細胞因缺氧、缺血等因素受損傷時，腦組織BDNF、TrkB水平顯著下降，學習記憶衰減。研究顯示VD大鼠海馬區(qū)組織BDNF、TrkB蛋白表達明顯下降，經(jīng)滋腎活血方干預后提高VD大鼠海馬組織BDNF、TrkB蛋白表達，改善VD大鼠學習記憶能力［21］。本研究表明，鳶尾黃素干預VD模型大鼠可提高BDNF、TrkB表達，有效刺激下游因子，修復受損海馬神經(jīng)元，最終提高VD大鼠學習、記憶能力。

本研究中，VD模型大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平較假手術(shù)組大鼠明顯升高，經(jīng)不同濃度鳶尾黃素干預28 d，大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平較VD模型大鼠明顯下調(diào)，且鳶尾黃素高劑量組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平下降最為顯著。NF-κB是一種能調(diào)節(jié)多種炎癥反應的核轉(zhuǎn)錄因子，能夠介導多種炎癥介質(zhì)和生長因子轉(zhuǎn)錄和表達［22-23］。MyD88是TLR4通路重要的銜接分子，NF-κB作為重要的多向性核轉(zhuǎn)錄因子，位于TLR4通路下游中心位置參與免疫應答［24］。研究顯示肌肽可通過抑制NF-κB信號通路提高對VD大鼠的神經(jīng)保護作用［25］。本研究表明VD模型大鼠腦組織海馬區(qū)TLR4/MyD88/NFκB信號通路被激活，鳶尾黃素干預后TLR4/MyD88/NF-κB信號通路明顯受抑制。

綜上，本研究證實鳶尾黃素可能通過調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路改善VD大鼠認知功能障礙，為腦健康領域研究提供了依據(jù)，但仍存在不足，鳶尾黃素能否通過調(diào)控其他信號通路改善VD大鼠認知缺陷尚未進行深入研究，也是今后研究方向。