振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷代謝及相關(guān)基因表達(dá)的影響

韓延超,陳慧芝,2,牛 犇,2,張小栓,韓樹人,王曉艷,王冠楠,劉瑞玲,郜海燕,

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所,全省生鮮食品智慧物流與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310021; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310021; 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院,北京 100083; 4.鮮豐水果股份有限公司,浙江 杭州 310000)

藍(lán)莓中花青素含量較高且種類豐富,有研究表明藍(lán)莓中的花青素含量是所有蔬菜和水果中最高的,主要集中在其紫色果皮部位[1]。藍(lán)莓花色苷具有抗氧化、改善視力等功能特性,深受消費(fèi)者喜愛[2]。隨著我國(guó)果蔬電商物流產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展,藍(lán)莓遠(yuǎn)距離銷售的需求迅速增加,但是物流過程中振動(dòng)易造成藍(lán)莓腐敗、衰老等現(xiàn)象,外在因素的變化極易導(dǎo)致花色苷降解,影響藍(lán)莓果實(shí)的貯藏品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。藍(lán)莓在物流過程中容易遭受振動(dòng)脅迫,花色苷積累加速,振動(dòng)時(shí)間越久,達(dá)到峰值的時(shí)間越短,隨后降解速度也越快[3]。

花色苷是天然水溶性色素,廣泛存在于植物的花、果實(shí)、種子和葉片中,屬黃酮多酚類化合物。它主要是通過苯丙烷類代謝和類黃酮途徑進(jìn)行生物合成,合成過程中重要酶有苯丙氨酸解氨酶(PAL)、二氫黃酮醇還原酶(DFR)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)等,而參與花色苷降解的酶有花色苷-β-糖苷酶、多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)[4]。果蔬花色苷的代謝與基因表達(dá)有關(guān),通過促進(jìn)或抑制花色苷合成和降解基因的表達(dá)能夠延緩貯藏過程中花色苷的降解。在葡萄[5]、無花果[6]、藍(lán)莓[7]等果實(shí)中研究發(fā)現(xiàn),PAL、UFGT、DFR等基因表達(dá)與花色苷的合成密切相關(guān),說明花色苷積累與苯丙烷代謝和類黃酮合成途徑中的酶活性密切相關(guān)。Li等[8]研究也發(fā)現(xiàn),黃酮醇和原花青素的合成在草莓成熟過程中受抑制,而蔗糖處理上調(diào)了除FaF3′H之外的類黃酮途徑相關(guān)基因表達(dá),加快花青素積累。POD、PPO和花色苷-β-糖苷酶是花色苷降解過程中的重要酶,可以抑制降解酶基因的表達(dá),延緩果蔬花色苷的降解。Fang等[9]研究表明,熱處理引發(fā)荔枝果實(shí)快速褐變和花青素?fù)p失,而熱酸處理通過降低花青素降解酶活性及LcPOD基因表達(dá),使荔枝果皮酸化從而達(dá)到護(hù)色目的。

本文主要研究物流振動(dòng)對(duì)藍(lán)莓花色苷組分和花色苷代謝相關(guān)酶活性的影響,并探究振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓貯藏過程中花色苷合成和降解相關(guān)基因表達(dá)的影響,闡明物流振動(dòng)對(duì)花色苷的作用機(jī)理,為后續(xù)研發(fā)藍(lán)莓物流過程中的花色苷等品質(zhì)保持技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

本文采用的實(shí)驗(yàn)原料為藍(lán)美人品種藍(lán)莓,采摘于浙江新昌兆豐生態(tài)園。果實(shí)于溫度較低的清晨采摘,挑選大小均勻、成熟度一致、無機(jī)械損傷的藍(lán)莓果實(shí)30 kg,置于4 ℃保鮮庫(kù)預(yù)冷待用。

試劑:乙醇、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、氯化鐵、福林酚、濃鹽酸、抗壞血酸、磷酸、碳酸鈉、沒食子酸、氫氧化鈉、硝酸鈉、硝酸鋁、氯化鉀、醋酸鈉、冰醋酸,所有試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀,美國(guó)WATERS公司;SpectraMax M2酶標(biāo)分析儀,美國(guó)Molecular Devices公司; BioSpec-nano超微量分光光度計(jì),日本島津;Mastercycler nexus恒溫?cái)U(kuò)增PCR儀,Eppendorf生命科技有限公司;StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,美國(guó)Thermo Fisher Science公司。

1.3 振動(dòng)實(shí)驗(yàn)

模擬車輛高速路面行駛,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中大部分藍(lán)莓有輕微振動(dòng)現(xiàn)象,設(shè)置振動(dòng)頻率4 Hz,物流振動(dòng)中藍(lán)莓最大可承受時(shí)間18 h為振動(dòng)組,未振動(dòng)脅迫為對(duì)照組。樣品貯藏在4 ℃恒溫箱中,每4 d取樣一次,貯藏期24 d。

1.4 花色苷組分及含量測(cè)定

參考Hutabarat等[10]的方法,通過HPLC分析花色苷組分。稱取1 g藍(lán)莓果實(shí)樣品,以料液比1∶20加入含0.2% HCl的60%乙醇溶液,離心取上清,過濾后用于HPLC分析。C18反相色譜柱,柱溫:25 ℃,流速:0.6 mL·min-1,進(jìn)樣體積:10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng):520 nm,流動(dòng)相A:1%磷酸溶液,流動(dòng)相B:100%乙腈。

1.5 花色苷代謝相關(guān)酶活性測(cè)定

PAL活性測(cè)定:稱取5 g藍(lán)莓樣品,加5 mL提取緩沖液(40 g·L-1PVP、2 mmol·L-1EDTA、5 mmol·L-1β巰基乙醇),離心后上清液低溫保存,取2支試管加入3 mL 50 mmol·L-1pH 8.8硼酸緩沖液和0.5 mL苯丙氨酸溶液,分別加入0.5 mL酶提取液和煮沸5 min失活的酶液,37 ℃保溫60 min,結(jié)束后加入0.1 mL 6 mmol·L-1HCl終止反應(yīng),290 nm處測(cè)定吸光度值。以每克藍(lán)莓鮮樣每分鐘吸光度值增加0.01為一個(gè)活性單位U,單位用U·g-1表示。CHI、DFR、UFGT和花色苷-β-糖苷酶活性測(cè)定:分別使用CHI、DFR、UFGT酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒測(cè)定。POD、PPO活性測(cè)定:參考曹建康等[11]、黃欣莉等[12]、嚴(yán)銳等[13]的方并略作改動(dòng)。POD活性測(cè)定具體方法如下: 取 1.0 g 藍(lán)莓果品樣品于 10 mL 離心管,加 入5 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(Solabio),12 000 r·min-1離心25 min,取上清液(粗酶液)。 反應(yīng)體系:0.3 mL粗酶液,0.3 mL 6 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚,2.4 mL 5 mmol·L-1H2O2。反應(yīng) 15 s 后,測(cè)定470 nm 處 3 min 內(nèi)的吸光度值變化。PPO活性測(cè)定具體方法如下:取1 g藍(lán)莓果實(shí),充分研磨,加入5 mL 0.1 mol·L-1磷酸鈉緩沖液,混勻,12 000 r·min-1離心20 min,收集上清液(粗酶液)。采用1.0 mL 0.05 mol·L-1鄰苯二酚、4.0 mL磷酸鈉緩沖液和200 μL粗酶液,混勻,于25 ℃水浴30 s,以磷酸鈉緩沖液為空白對(duì)照,測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處的吸光度,每30 s記錄1 次。以每克樣品在每分鐘吸光度變化0.01為1個(gè)酶活力單位(U),單位為U·g-1,重復(fù)3 次。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)

本實(shí)驗(yàn)選擇已知的歐洲越橘GAPDH(VcGAPDH)作為內(nèi)參基因,通過Primer 5.0設(shè)計(jì)藍(lán)莓花色苷代謝相關(guān)酶基因引物,杭州有康生物科技有限公司進(jìn)行引物合成(表1)。對(duì)合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳檢測(cè),條帶清晰單一且無二聚體,可進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn),檢驗(yàn)引物熔解曲線單一(無特異性產(chǎn)物)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)具體參考我們前面的方法[14-15]。反應(yīng)體系(20 μL):SYBR Green PCR Supermix 10 μL,5 μmol·L-1上游和下游熒光定量引物 各1 μL,cDNA 模板 1 μL,加 ddH2O到20 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性 4 min,然后進(jìn)行如下循環(huán):94 ℃變性 5 s,55 ℃退火 10 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Fluorescent quantitative PCR primer sequence

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析,采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行Duncan顯著性分析(P<0.01,表示差異極顯著;P<0.05,表示差異顯著)。使用Graphpad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷組分及含量的影響

如表2所示,各單體花色苷含量隨貯藏時(shí)間呈先上升后下降的趨勢(shì),振動(dòng)脅迫組各單體花色苷含量大部分在貯藏8 d時(shí)達(dá)到峰值,而對(duì)照組則大部分在貯藏16 d時(shí)花色苷積累量最多,因此振動(dòng)脅迫能夠加速各花色苷單體含量峰值的到達(dá),貯藏后期振動(dòng)脅迫組各組分含量顯著低于對(duì)照組,貯藏24 d時(shí),各花色苷組分含量最低。藍(lán)莓貯藏過程中錦葵色苷含量最高,其中錦葵素-3-阿拉伯糖苷含量最高,對(duì)照組和振動(dòng)組中其含量分別在16 d和8 d達(dá)到最高值8 719.88 μg·g-1和10 746.69 μg·g-1,分別占總量的72.67%和76.49%,而芍藥素-3-葡萄糖苷含量最少,其對(duì)照組和振動(dòng)組分別在貯藏24 d和8 d達(dá)到最高點(diǎn),含量?jī)H22.25 μg·g-1和25.66 μg·g-1,僅占總量的0.51%和1.82%。

通過HPLC分析共檢測(cè)出10種花色苷單體,使用SMICA-P 14.1軟件對(duì)花色苷組分進(jìn)行PCA主成分分析,如圖1所示,第一主成分和第二主成分貢獻(xiàn)率分別為70.6%和10.4%。對(duì)照組多分布在第三、四象限而振動(dòng)脅迫組主要分布在第一和第二象限,說明振動(dòng)對(duì)花色苷組分具有一定的影響。

圖1 對(duì)照和振動(dòng)脅迫藍(lán)莓花色苷組分變化的PCA得分圖Fig.1 PCA score diagram of anthocyanin components of blueberry under control and vibration stress

2.2 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷合成相關(guān)酶活性的影響

如圖2所示,藍(lán)莓采后貯藏過程中PAL活性呈先升后降趨勢(shì),對(duì)照組在貯藏20 d時(shí),PAL活性達(dá)到最高,為162.30 U·g-1,振動(dòng)組在貯藏4 d時(shí),PAL活性達(dá)到最高(170.05 U·g-1)。貯藏后期,振動(dòng)組PAL活性顯著低于對(duì)照組,貯藏24 d時(shí),PAL活性最低,僅141.68 U·g-1。藍(lán)莓CHI活性隨貯藏時(shí)間整體呈先上升后下降的趨勢(shì),對(duì)照組在貯藏16 d時(shí),CHI活性最高8.69 U·g-1,隨后開始下降,24 d時(shí)活性僅6.74 U·g-1;振動(dòng)脅迫組在貯藏第8 d時(shí),CHI活性達(dá)到最高點(diǎn)(8.92 U·g-1),24 d時(shí)活性下降為5.56 U·g-1。藍(lán)莓貯藏過程中DFR活性先上升后下降,貯藏16 d以前, DFR活性變化較為平緩,貯藏16 d時(shí)達(dá)到最大值,隨后迅速下降,至24 d時(shí),對(duì)照組和振動(dòng)組DFR活性分別為98.81 U·g-1和75.34 U·g-1,相比最高點(diǎn)下降了33.28%和49.87%。貯藏后期,振動(dòng)脅迫極顯著抑制了藍(lán)莓DFR活性。藍(lán)莓UFGT活性隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì),貯藏8 d時(shí),振動(dòng)組活性達(dá)到最高,為20.03 U·g-1,顯著高于對(duì)照組,隨后開始下降,貯藏20 d時(shí),活性最低,為16.24 U·g-1,相比最高點(diǎn)下降了11.98%;而貯藏后期對(duì)照組UFGT活性極顯著高于振動(dòng)組,貯藏20 d時(shí),對(duì)照組活性最高為18.85 U·g-1,比貯藏0 d上升了7.48%。

*或**分別表示與對(duì)照相比差異達(dá)顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平。下同。* or ** represents the significant (P<0.05) or very significant(P<0.01) difference compared with the control. The same as below.圖2 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷合成相關(guān)酶活性的影響Fig.2 Effect of vibration stress on anthocyanin synthesis related enzymes activity of blueberry

2.3 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷降解相關(guān)酶活性的影響

如圖3所示,在藍(lán)莓貯藏過程中,對(duì)照組花色苷-β-糖苷酶活性整體呈下降趨勢(shì),貯藏24 d時(shí)活性為4.08 U·mg-1,相比0 d下降了33.87%;而振動(dòng)脅迫組花色苷-β-糖苷酶活性整體呈先上升后下降趨勢(shì),貯藏4 d時(shí)活性達(dá)到最高點(diǎn)6.58 U·mg-1,極顯著高于對(duì)照組,隨后迅速下降,貯藏24 d時(shí)活性下降為3.60 U·mg-1,比對(duì)照組低11.76%。藍(lán)莓貯藏過程中,POD活性隨藍(lán)莓果實(shí)成熟衰老,不斷下降。貯藏0 d時(shí),振動(dòng)組POD活性為8.89 U·g-1,為對(duì)照組的1.4倍,貯藏前4 d,振動(dòng)組POD活性極顯著高于對(duì)照組,隨后振動(dòng)組POD活性迅速下降至貯藏8 d的4.56 U·g-1,之后其活性變化趨于平緩;而對(duì)照組在整個(gè)貯藏過程POD活性極顯著低于振動(dòng)組,貯藏24 d時(shí)其活性最低僅0.94 U·g-1,比振動(dòng)組低2.66 U·g-1。在藍(lán)莓果實(shí)貯藏期間,PPO活性呈下降趨勢(shì),振動(dòng)組PPO活性顯著高于對(duì)照組,貯藏0 d時(shí),振動(dòng)組和對(duì)照組PPO活性分別為8.35 U·g-1和5.41 U·g-1;貯藏前期振動(dòng)組PPO活性下降趨勢(shì)較為明顯,12 d時(shí),其活性為4.32 U·g-1,下降48.26%,12 d以后趨于平緩;而對(duì)照組整個(gè)貯藏過程PPO活性下降趨勢(shì)較為平緩,0 d到24 d活性下降了41.22%。與對(duì)照組相比,振動(dòng)脅迫組PPO活性較高,能夠加速花色苷降解。

圖3 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷降解相關(guān)酶活性的影響Fig.3 Effect of vibration stress on to anthocyanin degradation related enzymes activity of blueberry

2.4 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷合成相關(guān)酶基因表達(dá)的影響

藍(lán)莓花色苷合成相關(guān)基因VcPAL1和VcPAL2在貯藏過程中的表達(dá)情況如圖4所示,隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)藍(lán)莓VcPAL1和VcPAL2基因表達(dá)變化趨勢(shì)一致,相對(duì)于貯藏初期出現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨向,其中對(duì)照組VcPAL1和VcPAL2基因相對(duì)表達(dá)量分別在12 d和16 d最高,而振動(dòng)組藍(lán)莓VcPAL1和VcPAL2基因則均在8 d時(shí)達(dá)到最高點(diǎn),貯藏后期振動(dòng)組VcPAL1和VcPAL2基因相對(duì)表達(dá)量逐漸下降且極顯著低于對(duì)照組。

圖4 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷合成相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of vibration stress on relative expression of anthocyanin synthesis enzymes related genes in blueberry

由圖4可知,對(duì)照組藍(lán)莓在貯藏期間VcDFR1、VcDFR2和VcDFR3基因相對(duì)表達(dá)量均呈先上升后下降趨向,均在貯藏16 d時(shí)表達(dá)量最高。振動(dòng)組VcDFR1和VcDFR2基因相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)與對(duì)照組一致,在貯藏前8 d時(shí)相對(duì)表達(dá)量上升達(dá)到最高值,隨后開始下降,貯藏16 d到24 d振動(dòng)組VcDFR1和VcDFR2基因相對(duì)表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組。而振動(dòng)組VcDFR3基因相對(duì)表達(dá)量相對(duì)于貯藏初期逐漸上調(diào),貯藏8 d開始其VcDFR3基因相對(duì)表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組,振動(dòng)脅迫顯著抑制貯藏后期VcDFR基因的表達(dá)。

藍(lán)莓貯藏過程中VcCHI1和VcCHI2基因表達(dá)量的變化如圖4所示,對(duì)照組VcCHI1基因相對(duì)表達(dá)量逐漸上調(diào),而振動(dòng)組VcCHI1基因表達(dá)量在貯藏前12 d上調(diào)且其表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組,貯藏后期振動(dòng)組VcCHI1基因表達(dá)逐漸下調(diào)且極顯著低于對(duì)照組。對(duì)照組和振動(dòng)脅迫組VcCHI2基因表達(dá)量變化趨勢(shì)一致,均隨貯藏時(shí)間逐漸上升,但是貯藏后期振動(dòng)組VcCHI2基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。振動(dòng)誘導(dǎo)了貯藏前期VcCHI1基因的表達(dá),也抑制了貯藏后期VcCHI1和VcCHI2基因的表達(dá)。

VcUFGT表達(dá)量在對(duì)照和振動(dòng)脅迫組中變化一致,均呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì),分別在貯藏16 d和8 d最高,與初始值相比分別上調(diào)了74.42和67.53%。在貯藏前期4～8 d振動(dòng)組VcUFGT基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.01),16 d和20 d表達(dá)量下降且極顯著低于對(duì)照組。振動(dòng)脅迫誘導(dǎo)貯藏前期VcUFGT基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào),加速貯藏前期花色苷的積累。

2.5 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷降解相關(guān)酶基因表達(dá)的影響

振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓貯藏期間VcPOD1、VcPOD2、VcPOD3基因相對(duì)表達(dá)量的影響如圖5所示,對(duì)照和振動(dòng)脅迫組VcPOD2表達(dá)量均呈現(xiàn)先升后降趨向,在貯藏8 d達(dá)到最高峰;而VcPOD1和VcPOD3表達(dá)量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而降低,VcPOD1基因在貯藏20 d和24 d時(shí)的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,VcPOD3表達(dá)量從8 d開始極顯著高于對(duì)照組。對(duì)照組VcPPO1表達(dá)量隨貯藏時(shí)間逐漸下降,而振動(dòng)脅迫組VcPPO1呈先上調(diào)后下調(diào)趨勢(shì),貯藏8 d表達(dá)量最高。VcPPO2在藍(lán)莓貯藏過程中的表達(dá)量呈先升后降趨勢(shì),但是與對(duì)照組相比,振動(dòng)組極顯著抑制了VcPPO2基因的表達(dá)。

圖5 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷降解相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of vibration stress on relative expression of anthocyanin degradation enzymes related genes in blueberry

3 討論

藍(lán)莓果實(shí)采后貯藏過程中,隨著果實(shí)的成熟,藍(lán)莓花色苷含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),但其花色苷種類沒有明顯的變化。在本實(shí)驗(yàn)所用藍(lán)美人品種藍(lán)莓果實(shí)中共檢測(cè)到5種花青素,其中以錦葵色素為主,芍藥色素含量最少。此結(jié)果與南京市種植的兔眼藍(lán)莓中測(cè)到的花青素種類相似[10]?；ㄉ罩饕怯苫ㄇ嗨睾蛦翁擎I合而成,本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的花青素主要被葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖糖基化形成10種花色苷單體,其中錦葵素-3-阿拉伯糖苷含量最高。Li等[16]通過對(duì)藍(lán)莓中花青素的HPLC和主成分分析發(fā)現(xiàn),17種不同品種花色苷?qǐng)D譜相似,但其占比取決于種類,而檢測(cè)到的花色苷主要有錦葵苷、飛燕草苷和矮牽牛苷,分別占比41.0%、33.1%、17.3%,占總花色苷含量的90%以上。在貯藏過程中藍(lán)莓花色苷含量呈先上升后下降的趨勢(shì),對(duì)照組和振動(dòng)脅迫組花色苷總量分別在16 d和8 d時(shí)達(dá)到峰值,各組分含量也隨之發(fā)生變化,振動(dòng)組處理加速了花色苷含量峰值的到達(dá),隨后下降過程中,其含量顯著低于對(duì)照組。

PAL是花色苷生物合成途徑的第一個(gè)酶。王惠聰?shù)萚17]發(fā)現(xiàn),荔枝果皮中花色苷含量與PAL活性沒有相關(guān)性;邱雪[4]和黎歡歡等[18]研究表明,PAL活性與花色苷含量變化呈顯著正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PAL活性與花色苷含量變化相似,均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),貯藏前期活性較高,藍(lán)莓果實(shí)開始大量合成類黃酮類物質(zhì),貯藏后期振動(dòng)組PAL活性下降迅速,振動(dòng)脅迫加快了花色苷的合成進(jìn)程,后期花色苷分解加快花色苷含量逐漸下降,PAL活性隨之下降,說明PAL是花色苷合成途徑的重要酶。Feng等[19]研究表明,CHI與花青素的合成密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中,花色苷含量呈先上升后下降的趨勢(shì),而CHI、DFR、UFGT活性變化與花色苷含量變化相似,振動(dòng)脅迫組PAL、CHI、DFR、UFGT活性在貯藏8 d左右達(dá)到最高點(diǎn),隨后開始下降,貯藏后期振動(dòng)組花色苷合成酶活性顯著低于對(duì)照組。因此,CHI、DFR、UFGT可能都是花色苷合成途徑的重要酶。Lister等[20]研究發(fā)現(xiàn),在蘋果生長(zhǎng)發(fā)育過程中,CHI僅在蘋果果皮發(fā)生轉(zhuǎn)色時(shí),其活性與花色苷變化協(xié)同。王惠聰?shù)萚17]通過研究荔枝果皮中花色苷含量以及PAL、DFR、CHI、UFGT等活性變化發(fā)現(xiàn),僅有UFGT活性變化與花色苷合成趨勢(shì)相吻合。劉曉靜[21]和王慶菊等[22]也研究發(fā)現(xiàn),DFR活性變化與花色苷含量呈正相關(guān),說明DFR能夠加速花色苷的合成。

花色苷不能直接作為PPO和POD的底物,必須在兒茶酚等酚類物質(zhì)以及過氧化氫的存在下,花青素才能被PPO和POD降解[23-24]。在藍(lán)莓貯藏過程中對(duì)照組和振動(dòng)組PPO、POD和花色苷-β-糖苷酶活性隨貯藏時(shí)間逐漸下降,且振動(dòng)組PPO和POD活性顯著高于對(duì)照組,說明振動(dòng)脅迫加速了花色苷降解。Fang等[9]通過研究荔枝果皮中花色苷降解發(fā)現(xiàn),貯藏過程中荔枝果皮POD、PPO和花色苷-β-糖苷酶活性逐漸下降,熱酸處理與對(duì)照相比顯著降低了降解酶活性,保護(hù)了荔枝果皮顏色。

花色苷是在植物次生代謝過程中通過苯丙烷代謝和類黃酮合成途徑產(chǎn)生,花色苷的生物合成涉及到多種結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因[25]。本實(shí)驗(yàn)探究了花色苷合成和降解相關(guān)13種結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)大部分基因表達(dá)與相關(guān)酶活性變化相對(duì)應(yīng)。在藍(lán)莓貯藏過程中花色苷合成相關(guān)VcPAL1、VcPAL2、VcDFR1、VcDFR2、VcCHI1、VcUFGT等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)均呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì),與對(duì)照組相比振動(dòng)脅迫誘導(dǎo)了藍(lán)莓貯藏前期各結(jié)構(gòu)基因表達(dá),從而調(diào)控相關(guān)酶活性上升,加速貯藏前期花色苷積累。貯藏16 d開始到貯藏結(jié)束,振動(dòng)脅迫組VcPAL1、VcPAL2、VcDFR1、VcDFR2、VcDFR3、VcCHI1、VcCHI2以及VcUFGT等基因表達(dá)下調(diào)且顯著低于對(duì)照組,對(duì)應(yīng)相關(guān)酶活性下降,花色苷合成減弱。在貯藏過程中花色苷合成相關(guān)酶基因表達(dá)量變化差異較大則說明VcPAL、VcDFR、VcCHI以及VcUFGT等基因在花色苷合成過程中發(fā)揮重要作用,調(diào)控花色苷的合成并具有一定的特異性[26-27]。花色苷生物合成相關(guān)基因的表達(dá)通常需要上游轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控[28]。Yang等[29]研究發(fā)現(xiàn),VuCHS、VuDFR、VuUFGT等花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá),在白色漿果中顯著下調(diào),與花青素合成密切相關(guān)。Liu等[30]發(fā)現(xiàn),光敏轉(zhuǎn)錄因子PybZIPa通過識(shí)別G-box基序,結(jié)合并激活PyUFGT表達(dá),從而調(diào)控梨皮中花青素的積累。

振動(dòng)脅迫使藍(lán)莓貯藏后期花色苷合成減弱,加速花色苷的降解。目前花色苷降解途徑并不明確,但是有研究表明花色苷-β-糖苷酶、PPO和POD這3種酶能夠參與花色苷降解,可通過抑制酶活性減少花青素?fù)p失[9,31]。我們通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了VcPOD1、VcPOD2、VcPOD3、VcPPO1和VcPPO2基因的表達(dá)量,結(jié)果表明,振動(dòng)脅迫組VcPOD1、VcPOD2、VcPOD3、VcPPO1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,抑制花色苷降解酶POD、PPO活性下降,加速花色苷降解。

4 結(jié)論

我們的研究發(fā)現(xiàn),藍(lán)莓果實(shí)中有10種花色苷單體,其中錦葵素-3-阿拉伯糖苷含量最高。在藍(lán)莓貯藏前期,振動(dòng)脅迫加速了花色苷的積累,顯著提高了PAL和UFGT活性;而貯藏后期,振動(dòng)組PAL、CHI、DFR、UFGT活性均顯著低于對(duì)照組,同時(shí)振動(dòng)脅迫延緩了花色苷降解相關(guān)的POD、PPO和花色苷-β-糖苷酶活性的下降。振動(dòng)脅迫誘導(dǎo)了藍(lán)莓貯藏前期花色苷合成相關(guān)基因VcPAL1、VcDFR2、VcCHI1、VcUFGT的表達(dá),提前了基因表達(dá)量峰值的到達(dá),在貯藏后期顯著下調(diào)了花色苷合成相關(guān)酶基因的表達(dá);振動(dòng)脅迫顯著促進(jìn)了藍(lán)莓貯藏過程中花色苷降解相關(guān)VcPOD1、VcPOD2、VcPOD3和VcPPO1等的基因表達(dá)。