基于非靶向代謝組學(xué)的信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程非揮發(fā)物代謝輪廓分析

孔亞帥，陳凌芝，成 恩，朱 堯，王晶晶，王 曉，王子浩，陳 義，尹 鵬,*，郭桂義,,*

（1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院茶學(xué)院，河南省豫南茶樹資源綜合開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽(yáng) 464000；2.信陽(yáng)市文新茶葉有限責(zé)任公司，河南 信陽(yáng) 464000）

綠茶是我國(guó)六大茶類之一，因其滋味鮮爽和香氣濃郁而廣受消費(fèi)者的喜愛。綠茶中含有豐富的茶多酚、咖啡堿、茶氨酸、黃酮、茶多糖等天然成分，這些成分不僅構(gòu)成茶葉豐富的滋味口感，還具有抗癌、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、降低血壓等藥理活性[1-2]。綠茶的基本工藝主要包括殺青、揉捻和干燥。根據(jù)綠茶加工工藝，可以把綠茶分為炒青綠茶、烘青綠茶、曬青綠茶和蒸青綠茶[3]。茶樹鮮葉原料的優(yōu)劣是決定綠茶品質(zhì)的基礎(chǔ)，茶樹品種、生產(chǎn)季節(jié)、氣候條件、生長(zhǎng)環(huán)境、原料等級(jí)都會(huì)影響制茶鮮葉原料內(nèi)含物質(zhì)的構(gòu)成，從而間接影響所制綠茶的風(fēng)味和功效[4-6]；加工技術(shù)是決定茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵，Gui Anhui等[7]基于代謝組學(xué)分析了蒸青綠茶加工過(guò)程中非揮發(fā)性代謝物的變化，發(fā)現(xiàn)非揮發(fā)性代謝物的變化主要發(fā)生在蒸汽殺青階段，其次是做形和干燥階段；蒸汽殺青導(dǎo)致大部分氨基酸及其肽、酚酸、有機(jī)酸、核苷酸及其衍生物以及一些黃酮類化合物的水平顯著增加，而大多數(shù)脂質(zhì)和一些黃酮類化合物的水平顯著降低。Li Jia等[8]通過(guò)非靶向脂質(zhì)組學(xué)研究綠茶脂質(zhì)及其代謝的變化，發(fā)現(xiàn)殺青階段脂質(zhì)發(fā)生了顯著的變化，這主要與葉綠素分解、磷脂酸還原和糖脂降解有關(guān)，此反應(yīng)可能有助于綠茶色澤和香氣的形成。在綠茶的加工過(guò)程中，兒茶素、游離氨基酸、黃酮苷、糖、生物堿和脂質(zhì)等化合物會(huì)發(fā)生水解、異構(gòu)、氧化等一系列生化反應(yīng)，有利于綠茶滋味品質(zhì)形成[9-11]。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后的一種新興科學(xué)技術(shù)，一般來(lái)說(shuō)，研究的對(duì)象是相對(duì)分子質(zhì)量在1000以下的小分子化合物，研究手段涵蓋了核磁共振技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)和液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用技術(shù)。對(duì)于非揮發(fā)性代謝物分析，高效精準(zhǔn)的LC-MS技術(shù)被廣泛應(yīng)用，根據(jù)研究對(duì)象和目的不同，可以將代謝產(chǎn)物分析分為靶向代謝組學(xué)分析和非靶向代謝組學(xué)分析，非靶向代謝組學(xué)分析能夠全面反映所研究對(duì)象的整體代謝輪廓[12-13]。目前非靶向代謝組學(xué)被廣泛應(yīng)用到茶葉的研究中，為全面深入地了解茶葉提供了有力幫助。Cui Jilai等[14]利用頂空固相微萃取法結(jié)合GC-MS技術(shù)對(duì)信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程樣品進(jìn)行定性和定量分析，探究信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程中關(guān)鍵香氣物質(zhì)基礎(chǔ)和變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)殺青工序是形成信陽(yáng)毛尖茶香氣的最重要的過(guò)程。Yin Peng等[15]采用頂空固相微萃取法結(jié)合GC-MS技術(shù)對(duì)比春秋兩季信陽(yáng)毛尖茶的主要非揮發(fā)性代謝物和關(guān)鍵氣味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)春季信陽(yáng)毛尖茶氨基酸含量顯著高于秋季，而咖啡堿含量則相反；信陽(yáng)毛尖茶關(guān)鍵香氣成分也表現(xiàn)為春季含量顯著高于秋季。組學(xué)技術(shù)在信陽(yáng)毛尖茶揮發(fā)性成分上應(yīng)用較多，也可以應(yīng)用于信陽(yáng)毛尖茶的產(chǎn)地溯源、海拔以及不同加工工藝對(duì)信陽(yáng)毛尖茶非揮發(fā)性代謝物化學(xué)輪廓的影響等方面[16-17]。

信陽(yáng)毛尖茶具有“細(xì)圓緊直多白毫，香高味濃湯色綠”的品質(zhì)特征，屬于名優(yōu)炒青綠茶的代表產(chǎn)品，優(yōu)越的地理位置、適宜生態(tài)環(huán)境以及優(yōu)良的茶樹品種和獨(dú)特的加工技藝決定了其獨(dú)特的風(fēng)味和功效[3,18-19]。本研究以信陽(yáng)毛尖茶為對(duì)象，利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程中的非揮發(fā)性代謝物進(jìn)行研究，以探明信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程中的關(guān)鍵代謝物，為進(jìn)一步完善信陽(yáng)毛尖茶品質(zhì)形成機(jī)理及其調(diào)控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品選取信陽(yáng)群體種為原料，以一芽一葉為采摘標(biāo)準(zhǔn)，于信陽(yáng)市浉河區(qū)遇鑒有機(jī)茶葉專業(yè)合作社（113.9°E、31.9°N）加工完成。采摘日期為2021年4月8日，當(dāng)天采摘的鮮葉當(dāng)天制作完畢。如圖1所示，其加工工藝為鮮葉→攤放（室溫，4～6 h）→滾筒殺青（前200 ℃、后120 ℃，120 s）→揉捻（室溫，40 min）→排把（85 ℃，15 min）→理?xiàng)l（115 ℃，6 min）→干燥（80 ℃，18 min）。每個(gè)階段的加工樣品冷卻后立即用液氮保存，然后運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行冷凍干燥，鋁箔袋密封后置于-40 ℃低溫保存。

圖1 信陽(yáng)毛尖茶加工流程與工藝參數(shù)Fig.1 Flow chart and process parameters of Xinyang Maojian tea processing

水（ddH2O）屈臣氏集團(tuán)（香港）有限公司；甲醇和乙腈（質(zhì)譜級(jí)）德國(guó)CNW公司；乙酸銨（質(zhì)譜級(jí)）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙酸（質(zhì)譜級(jí)）美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6CST-80D滾筒殺青機(jī)、6CR-45茶葉揉捻機(jī)、6CCGK-7D茶葉排把炒干機(jī) 信陽(yáng)一鼎茶葉科技有限公司；6CL-80/16D茶葉理?xiàng)l機(jī) 衢州市華麟機(jī)械有限公司；CS-6CHZ-9長(zhǎng)盛牌烘焙機(jī) 泉州長(zhǎng)盛茶業(yè)機(jī)械有限公司；Vanquish超高液相色譜儀、Q Exactive HFX高分辨質(zhì)譜儀、Heraeus Fresco17離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；BSA124S-CW電子分析天平德國(guó)Sartorius公司；JXFSTPRP-24研磨儀 上海凈信科技有限公司；PS-60AL超聲儀 深圳市雷德邦電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 代謝物提取

稱取20 mg茶葉樣品，加入1000 μL甲醇水提取液（3∶1，V/V，含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物），研磨儀35 Hz研磨處理4 min，超聲5 min（冰水?。貜?fù)3 次；將在-40 ℃環(huán)境靜置1 h的樣品以4 ℃、12000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min；取上清于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)；所有樣品另取等量上清混合成質(zhì)量控制樣品上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 LC-MS/MS分析

本研究使用Vanquish超高效液相色譜儀，通過(guò)Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4 ℃；進(jìn)樣量為3 μL；流動(dòng)相A含5 mmol/L乙酸銨和5 mmol/L乙酸的水溶液；流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫程序：0～0.7 min，99% A、1% B；0.7～9.5 min，99%～1% A、1%～99% B；9.5～11.8 min，1% A、99% B；11.8～12.0 min，1%～99% A、99%～1% B；12.0～14.8 min，99% A、1% B。

Thermo Q Exactive HFX質(zhì)譜儀在正離子模式下進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。詳細(xì)參數(shù)如下：鞘氣流速30 arb，輔助氣體流速10 arb，毛細(xì)管溫度350 ℃，全掃分辨率60000，二級(jí)質(zhì)譜分辨率7500，碰撞能量10/30/60 eV，噴霧電壓4.0 kV。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包（內(nèi)核為XCMS）進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊和積分等處理，然后與BiotreeDB（V 2.1）自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff值設(shè)為0.3。

β-多樣性分析基于Bray-Curtis距離計(jì)算方法計(jì)算，利用主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）以及R語(yǔ)言vegan包的層級(jí)聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）進(jìn)行可視化，同時(shí)使用PERMANOVA檢驗(yàn)樣品間分組的可靠性（R2和P值，前者代表了該因素對(duì)分組的解釋程度，后者是對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的評(píng)估）?；赗語(yǔ)言ggplot2以及ggrepel包進(jìn)行所鑒定全部化合物差異性分析，利用火山圖進(jìn)行差異化合物展示。通過(guò)R語(yǔ)言ropls包做正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）進(jìn)行樣本組間差異化合物的篩選，篩選出來(lái)的差異化合物使用R語(yǔ)言ComplexHeatmap包實(shí)現(xiàn)熱圖可視化，直觀地反映信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程中化合物相對(duì)含量的變化規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程中整體非揮發(fā)性代謝物輪廓分析

在正離子模式下共檢測(cè)并比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定到1000 種代謝物，為更好地了解信陽(yáng)毛尖茶在加工過(guò)程中代謝物的變化，基于Bray-Curtis算法對(duì)正離子模式下采集到的代謝物進(jìn)行PCoA和HCA，如圖2所示，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，顏色由深到淺表示信陽(yáng)毛尖茶加工工藝流程，節(jié)點(diǎn)的大小代表不同分組；信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程樣品以殺青工藝為界限分為兩組，一組為殺青前（Cluster-1，酶促反應(yīng)階段），包括茶鮮葉樣品和攤放后樣品；另一組為殺青后（Cluster-2，非酶促反應(yīng)階段），包括殺青后樣品、揉捻后樣品、排把后樣品、理?xiàng)l后樣品以及干燥后樣品。根據(jù)無(wú)監(jiān)督下分組結(jié)果，經(jīng)R語(yǔ)言vegan包PERMANOVA驗(yàn)證（R2＝33.6%，P＜0.01），證明分組結(jié)果合理，兩組樣品有顯著性差異。

圖2 信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程非揮發(fā)性代謝物PCoA（a）和HCA（b）Fig.2 Principal coordinate analysis (a) and hierarchical clustering analysis (b) of non-volatile metabolites during Xinyang Maojian tea processing

2.2 信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程中非揮發(fā)性代謝物變化規(guī)律

針對(duì)檢測(cè)鑒定到的1000 種代謝物，分析它們?cè)谛抨?yáng)毛尖茶加工過(guò)程中的變化規(guī)律，得到代謝物的火山圖（圖3）。圖中節(jié)點(diǎn)的大小代表了OPLS-DA結(jié)果變量重要性投影分析值（variable importance in projection，VIP）的大小，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)、紅色節(jié)點(diǎn)和灰色節(jié)點(diǎn)分別代表殺青后相對(duì)含量顯著上升（P＜0.05且差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C≥2））、顯著下降（P＜0.05且FC≤0.5）以及無(wú)顯著變化的化合物。信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程中殺青工序?qū)е?47 個(gè)化合物發(fā)生顯著變化（101 個(gè)顯著上升，46 個(gè)顯著下降）；攤放、揉捻、排把、理?xiàng)l、干燥工序分別導(dǎo)致16（4 個(gè)顯著上升，12 個(gè)顯著下降）、13（均顯著下降）、16（均顯著上升）、2（均顯著上升）、8 個(gè)（2 個(gè)顯著上升，6 個(gè)顯著下降）化合物發(fā)生顯著變化；相較于信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程中的其他工序，非揮發(fā)性代謝物的變化主要發(fā)生在殺青工序中，這表明殺青對(duì)于高品質(zhì)綠茶的形成至關(guān)重要。

圖3 信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程組間火山圖Fig.3 Intergroup volcano plots of Xinyang Maojian tea during processing

2.3 信陽(yáng)毛尖茶殺青前后差異化合物分析

根據(jù)信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程整體化合物PCoA和HCA結(jié)合加工過(guò)程各工序間代謝物變化規(guī)律，將信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程樣品分為兩大組（Cluster-1和Cluster-2）。為了更加準(zhǔn)確地反映兩組樣品間非揮發(fā)性代謝物的差異，依據(jù)VIP＞1.5且P＜0.05，共篩選出53 種差異化合物（表1），這些差異化合物在信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程中相對(duì)含量的變化規(guī)律如圖4所示，其中包括6 種氨基酸及其衍生物類化合物、6 種黃酮苷類化合物、5 種類黃酮化合物、10 種脂類化合物、3 種有機(jī)酸及其衍生物類化合物、8 種嘌呤核苷酸類化合物、4 種甾體及其衍生物類化合物、2 種萜類化合物、4 種雜環(huán)類化合物以及5 種其他類化合物。

表1 差異化合物信息Table 1 Information of differential compounds

圖4 兩組間差異化合物熱圖Fig.4 Heatmap of differential compounds between two groups

2.3.1 氨基酸及其衍生物

氨基酸是綠茶重要的品質(zhì)化學(xué)成分，在綠茶加工過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列的生化反應(yīng)，不僅參與茶葉滋味的形成，也能夠影響茶葉香氣的形成。從圖4可以看出，L-谷氨酸（ID：50）的相對(duì)含量在殺青后顯著降低；L-酪氨酸（ID：212）和L-苯丙氨酸（ID：43）在殺青后其相對(duì)含量顯著上升；另外還有3 個(gè)氨基酸衍生物包括甜菜堿（ID：7）、β-尿嘧啶-3-丙氨酸（ID：353）和葡萄糖半乳糖苷羥基賴氨酸（ID：45）的相對(duì)含量在在殺青后也顯著上升。前期研究表明在殺青后L-焦谷氨酸和一些氨基酸糖苷的含量顯著上升，本研究中L-谷氨酸相對(duì)含量的顯著下降可能與此有關(guān)[10]。茶葉中的苯丙氨酸可以通過(guò)氧化脫氨和脫羧轉(zhuǎn)化為具有玫瑰花香味的香氣成分苯乙醛和苯乙醇，殺青后L-苯丙氨酸的積累可能為后續(xù)綠茶香氣的形成提供前體物質(zhì)[20]。

2.3.2 黃酮糖苷類化合物

黃酮類化合物是決定綠茶湯色和滋味的重要組分，在茶葉中主要以糖苷的形式存在，根據(jù)構(gòu)成黃酮苷的糖類區(qū)分有單糖苷、雙糖苷、三糖苷和酰化糖苷，具有抗氧化、抗炎等功效[21-23]。如圖5所示，本研究篩選出的6 個(gè)黃酮糖苷類差異化合物均為黃酮氧糖苷，包括3 個(gè)?；S酮糖苷、1 個(gè)山柰酚三糖苷、1 個(gè)槲皮素單糖苷以及1 個(gè)甲基化槲皮素糖醛酸苷。目前關(guān)于茶葉中的黃酮碳糖苷的數(shù)據(jù)不多，可能是黃酮碳糖苷比氧糖苷更穩(wěn)定[24]。結(jié)合圖4可知，甲基化槲皮素糖醛酸苷（ID：866）和山柰酚三糖苷（ID：239）在殺青后其相對(duì)含量顯著下降；而槲皮素沒(méi)食子酰糖苷（ID：525）、楊梅素沒(méi)食子酰糖苷（ID：449）和山柰酚咖啡酰糖苷（ID：1049）以及槲皮素單糖苷（ID：1127）的相對(duì)含量在殺青后有明顯上升的趨勢(shì)。本研究黃酮糖苷的變化規(guī)律與前人的研究的結(jié)果相對(duì)一致[7]，可能是由于黃酮和黃酮醇苷在高溫加工過(guò)程發(fā)生異構(gòu)、水解和部分氧化聚合的結(jié)果。黃酮和黃酮醇苷有助于茶的澀味和茶湯顏色，其含量的變化會(huì)影響綠茶的品質(zhì)[11]。

圖5 6 個(gè)黃酮糖苷類差異化合物結(jié)構(gòu)Fig.5 Structures of six different flavonoid glycosides

2.3.3 類黃酮化合物

類黃酮化合物是一種具有2-苯基苯并吡喃（C6—C3—C6）結(jié)構(gòu)且對(duì)茶湯滋味有重要影響的化合物，主要包括黃酮類、黃酮醇類、黃烷酮類、黃烷醇類、花青素類以及生物類黃酮和部分兒茶素氧化產(chǎn)物茶黃素等，具有抗腫瘤、抗氧化、消炎、預(yù)防心血管疾病等健康功效[25-26]。篩選出2 個(gè)黃烷-3-醇類，包括EGC（ID：110）和ECG（ID：173），二者的相對(duì)含量在殺青后都顯著上升；表兒茶素-(4β-＞8)-表沒(méi)食子兒茶素3-O-沒(méi)食子酸酯（ID：1059）在殺青后相對(duì)含量也有明顯增加；另外1 個(gè)黃酮醇類化合物山柰酚（ID：17）和1 個(gè)簡(jiǎn)單茶黃素（ID：314）的相對(duì)含量在殺青后卻呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)。有研究發(fā)現(xiàn)在蒸青綠茶和炒青綠茶加工過(guò)程中兒茶素保持相對(duì)穩(wěn)定[7,10]，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與前期研究存在差異的原因可能是由于兒茶素類化合物在熱處理過(guò)程中同時(shí)存在異構(gòu)化反應(yīng)，部分兒茶素的變化影響了信陽(yáng)毛尖茶的苦澀口感[27]。

2.3.4 脂類化合物

脂質(zhì)是茶葉的重要成分之一，約占干茶質(zhì)量的8%，與茶葉的感官品質(zhì)有關(guān)，而且脂質(zhì)降解被認(rèn)為是茶香氣形成的主要途徑之一[28-29]。10 個(gè)脂類差異化合物中有1 個(gè)脂肪酰類（ID：806），其在綠茶殺青后相對(duì)含量呈顯著上升的趨勢(shì)；2 個(gè)甘油酯類分別是甘油二酯（ID：919）和單甘油酯（ID：970），二者相對(duì)含量在殺青后均顯著下降；其他7 個(gè)為甘油磷脂類化合物，包括2 個(gè)溶血磷脂酰膽堿（ID：833和ID：879）、1 個(gè)溶血磷脂酰乙醇胺（ID：127）、1 個(gè)磷脂酰甘油（ID：1033），相對(duì)含量均在殺青后顯著上升，另外1 個(gè)磷脂酸（ID：1028）、1 個(gè)溶血磷脂酸（ID：1032）、1 個(gè)磷脂酰膽堿（ID：783）的相對(duì)含量在殺青后顯著下降。在綠茶加工過(guò)程中脂質(zhì)類物質(zhì)顯著變化，特別是在殺青階段，應(yīng)該是與磷脂類化合物糖脂的降解有關(guān)，這可能有助于茶葉色澤和香氣的形成[8,30]。

2.3.5 嘌呤核苷酸類化合物

嘌呤核苷酸類化合物在茶葉中普遍被認(rèn)為是合成嘌呤生物堿的前體物質(zhì)，對(duì)茶葉的風(fēng)味和功效具有重要作用[31]；而且一些嘌呤核苷及其衍生物因其結(jié)構(gòu)易改造具有抗癌、抗病毒、降血壓等功效，多用作抗病毒類藥物[32-33]。本研究中篩選出的8 個(gè)嘌呤核苷酸類化合物包括腺嘌呤核苷（ID：11）、磷酸腺苷（ID：65）、鳥嘌呤（ID：27）、鳥嘌呤核苷（ID：24）、環(huán)腺苷酸（ID：70）、環(huán)磷鳥苷（ID：117）以及2 個(gè)腺苷酸衍生物（ID：89和ID：638）。這些嘌呤核苷酸類化合物在信陽(yáng)毛尖茶殺青后其相對(duì)含量均顯著增加，可能對(duì)信陽(yáng)毛尖茶抗腫瘤、抗病毒等生理活性有重要貢獻(xiàn)。有研究表明呈味核苷酸雖然自身的鮮味微弱，但它們對(duì)鮮味及甜味有增效作用，對(duì)酸味、苦味、腥味和焦味等不良風(fēng)味有消除或抑制作用，也參與了綠茶風(fēng)味的形成[34-35]。

2.3.6 有機(jī)酸及其衍生物

茶葉中的有機(jī)酸約占其干物質(zhì)量的3%，對(duì)茶湯的酸味、鮮味、甜味等都有貢獻(xiàn)，同時(shí)也具有抗炎、抗氧化等活性，是一類對(duì)茶葉品質(zhì)至關(guān)重要的化合物[36-38]。篩選出的3 個(gè)有機(jī)酸類差異化合物分別是VB5（ID：126）、咖啡酰蘋果酸（ID：1125）和三羥基苯甲酸（ID：651），其中VB5在殺青后其相對(duì)含量顯著上升，而咖啡酰蘋果酸和三羥基苯甲酸變化趨勢(shì)與之相反。VB5的相對(duì)含量隨著綠茶加工過(guò)程的進(jìn)行而升高，其抗炎和抗腫瘤等活性對(duì)綠茶的活性也有潛在貢獻(xiàn)[39]。

2.4 差異化合物京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路分析

對(duì)信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程殺青前后樣品差異化合物的KEGG注釋結(jié)果進(jìn)行KEGG通路富集分析[40]。如圖6所示，圖中每一個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)KEGG通路，點(diǎn)的大小代表該通路富集差異化合物的數(shù)量，點(diǎn)的顏色代表富集顯著性，橫坐標(biāo)為富集因子，縱坐標(biāo)軸為通路名稱。20 條代謝通路分別為丙烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，嘌呤代謝，磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)，苯丙素的生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，泛酸鹽和輔酶A生物合成，代謝途徑，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，甘油磷脂代謝，甘油脂代謝，芥子油苷生物合成，類黃酮生物合成，黃酮和黃酮醇的生物合成，油菜素甾醇生物合成，莽草酸途徑衍生生物堿的生物合成，鳥氨酸、賴氨酸和煙酸衍生生物堿的生物合成，β-丙氨酸代謝，氨?；?tRNA生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。差異化合物數(shù)量較多的富集代謝途徑是代謝途徑（18 個(gè)，78.26%）、嘌呤代謝（5 個(gè)，21.74%）以及氨酰基-tRNA生物合成（3 個(gè)，13.04%）、甘油磷脂代謝（3 個(gè)，13.04%）、苯丙氨酸代謝（3 個(gè)，13.04%）。

圖6 兩組間差異化合物KEGG富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of differential compounds between two groups

3 討論

殺青工藝被認(rèn)為是綠茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序[41]。研究表明，炒青綠茶的加工過(guò)程中相比較于揉捻和干燥工序，非揮發(fā)性代謝物的變化主要發(fā)生在殺青工序中[9]，這與本研究的結(jié)果一致。殺青過(guò)程由于高溫濕熱作用，蛋白質(zhì)大量水解，促進(jìn)了部分氨基酸的積累，但同時(shí)氨基酸又會(huì)發(fā)生氧化和糖基化反應(yīng)，導(dǎo)致一些氨基酸衍生物的生成，比如L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和雙糖羥基賴氨酸相對(duì)含量的增加。綠茶加工過(guò)程中黃酮糖苷總量會(huì)有所下降，但變化不顯著，可能是由于高溫殺青的原因[42]。因此，結(jié)合本研究所得結(jié)果，黃酮多糖苷在高溫殺青條件下可水解為黃酮二糖苷或者單糖苷，黃酮糖苷之間的相互轉(zhuǎn)化處于動(dòng)態(tài)平衡；而部分黃酮糖苷經(jīng)高溫殺青和一些酚酸類化合物發(fā)生?；磻?yīng)可能是綠茶加工過(guò)程黃酮糖苷總量輕微下降的主要原因。?；S酮糖苷可能是影響綠茶滋味或功效的潛在化合物，但目前對(duì)其研究較少[43]。大部分溶血磷脂類化合物相對(duì)含量的上升以及磷脂類化合物相對(duì)含量的下降可能與殺青高溫條件下的二者間的轉(zhuǎn)化有關(guān)[9]。另有研究表明，磷脂酰類化合物在加熱下可降解，形成一些醛酮類的芳香物質(zhì)，從而表明磷脂降解與綠茶香氣的形成密切相關(guān)[29]。本研究中，咖啡堿、可可堿以及茶葉堿等茶葉中主要的嘌呤生物堿的相對(duì)含量在殺青后并未發(fā)生顯著變化，可能與它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)，在綠茶加工過(guò)程中變化不明顯，而大量的嘌呤核苷類化合物在綠茶殺青后相對(duì)含量呈顯著上升的趨勢(shì)，表明殺青工藝是提高大多數(shù)核苷酸及其衍生物水平的關(guān)鍵，前期的研究中也證實(shí)了這一點(diǎn)[7,10]。KEGG代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)，信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程中甘油磷脂、氨基酸以及嘌呤核苷酸類物質(zhì)代謝水平具有顯著差異（P＜0.05），說(shuō)明與這些物質(zhì)相關(guān)的代謝通路對(duì)信陽(yáng)毛尖茶的滋味品質(zhì)有著重要影響。

4 結(jié)論

本研究基于非靶向代謝組學(xué)的方法對(duì)信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程中非揮發(fā)性代謝物進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，在正離子模式下共檢測(cè)并比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定到1000 種化合物，這些化合物的變化主要發(fā)生在殺青步驟中，共有147 種代謝物發(fā)生顯著變化，殺青對(duì)信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程非揮發(fā)性代謝物的影響大于其他工序。多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示信陽(yáng)毛尖茶整個(gè)加工過(guò)程可以分為兩個(gè)階段，即殺青前（酶促反應(yīng)階段）和殺青后（非酶促反應(yīng)階段），兩組之間共篩選出53 個(gè)差異化合物，包括氨基酸、兒茶素、黃酮糖苷、脂質(zhì)、嘌呤核苷、有機(jī)酸等；其中?；S酮糖苷、溶血磷脂酰類、嘌呤核苷類化合物在殺青后相對(duì)含量顯著提升，可能是信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程中的標(biāo)志化合物，這進(jìn)一步挖掘了影響信陽(yáng)毛尖茶品質(zhì)和功效的主要代謝物。非靶向代謝組學(xué)分析技術(shù)更加全面細(xì)致地揭示了信陽(yáng)毛尖茶加工過(guò)程中代謝物整體特征，進(jìn)一步加深了對(duì)信陽(yáng)毛尖茶品質(zhì)和風(fēng)味成分的了解，在將來(lái)的工作中有必要對(duì)代謝組學(xué)分析出的差異化合物進(jìn)行更深一步的定量分析，探究其與品質(zhì)和風(fēng)味的相關(guān)性，為深刻揭示信陽(yáng)毛尖茶風(fēng)味和品質(zhì)形成機(jī)制提供依據(jù)和參考。