芳樟醇對生姜枯萎病菌的抑制作用

周麗榮，張玲玲，熊詩潔，馬佳偉，朱永興，孫 沖，朱學(xué)棟，劉奕清,*

（1.長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.重慶文理學(xué)院園林與生命科學(xué)學(xué)院（特色植物研究院），重慶 402160；3.重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 408000）

生姜枯萎病是生姜種植過程的重大病害之一，給生姜種植農(nóng)戶造成重大經(jīng)濟損失，通常達30%～50%，甚至減產(chǎn)絕收[1]。生姜枯萎病的病原菌是尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum），它會危害棉花、果樹、中藥材等多種經(jīng)濟作物，引起植物發(fā)黃、枯萎甚至死亡[2-3]。尖孢鐮刀菌以休眠的卵孢子、游動孢子和孢子囊的形式在土壤中長時間存在，在雨水和灌溉條件下，它可通過游動孢子、菌絲碎片等方式逐漸傳播到鄰近的田塊[4]。生姜枯萎病常用化學(xué)殺菌劑防治，會造成農(nóng)藥污染以及食品安全問題等[5]。因此，亟需開發(fā)環(huán)境生態(tài)友好和經(jīng)濟上可行的替代生物抑菌劑，如植物提取物、揮發(fā)性有機化合物、樹脂等作為殺菌劑的替代品治療枯萎病[6-9]。

植物源提取物殺菌劑的研發(fā)是綠色防控蔬菜病蟲害關(guān)注熱點與發(fā)展方向。有研究表明，從植物中提取的萜烯類、酚類、生物堿、類黃酮、多糖和甾體等天然化學(xué)物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、殺蟲等特性[10]。劉耀華等[11]研究發(fā)現(xiàn)，香茅精油對番茄早疫病菌有很好的抑制效果，并有開發(fā)為新型植物源殺菌劑的潛力。芳樟醇是一種典型的揮發(fā)性有機化合物，對抑制致病菌起著重要作用[12-13]。在農(nóng)作物生產(chǎn)領(lǐng)域，芳樟醇對多種病原微生物的抑菌作用已經(jīng)被證實。高文騰[14]研究發(fā)現(xiàn)，芳樟醇對辣椒疫霉菌、煙草疫霉菌、大豆疫霉菌均有較好的抑制效果。王啟方等[10]研究發(fā)現(xiàn)，芳樟醇可直接抑制灰葡萄孢生長，并誘導(dǎo)植株的防御反應(yīng)。然而，目前有關(guān)芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的抑菌效果鮮見報道，其抑菌機理尚不明確。為明確芳樟醇對生姜枯萎病菌的抑制作用，本實驗以芳樟醇和生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌為對象，從芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲生長、孢子濃度、孢子萌發(fā)率、菌絲體細胞膜完整性的影響及生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌致病力變化等方面，探究芳樟醇抑制生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌生長發(fā)育的作用機制。旨在為利用芳樟醇作為植物源殺菌劑防控生姜枯萎病提供理論依據(jù)，同時為生姜枯萎病的生物防控提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試病原菌：生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌株（F.oxysporumFOX-1）由重慶文理學(xué)院園林與生命科學(xué)學(xué)院（特色植物研究院）提供[15]。在PDA培養(yǎng)基上活化后用于后續(xù)實驗。供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂18 g/L）、PDB培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L）。生姜購自荊州區(qū)南湖批發(fā)市場，選取生長一致、無病蟲害、機械損傷的嫩姜，用體積分?jǐn)?shù)2%的次氯酸鈉進行表面消毒，使用前用無菌蒸餾水洗滌。

芳樟醇（純度＞98%）上海麥克林生化科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、碘化吡啶（pyridine iodide，PI）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-100（THZ-98B）恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SPX-250BII生化培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；MHIF2000熒光顯微鏡 廣州市明慧科技有限公司；HUAXI-1B-80冷凍干燥機 上海華璽科學(xué)儀器有限公司；SD-3000離子噴金儀 北京博遠微納科技有限公司；JSM-IT200掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）北京創(chuàng)誠致佳科技有限公司；UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌孢子懸浮液的配制

生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌活化培養(yǎng)5 d后，用打孔器在菌落邊緣打出6 mm的菌餅，將菌餅接種至PDB，在28 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)搖床遮光振蕩培養(yǎng)3 d，紗布過濾，制成生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌孢子懸浮液（濃度為1×106spores/mL），以備后續(xù)實驗使用。

1.3.2 芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲生長影響分析

參考王江來等[16]的方法，采用菌絲生長速率法、十字交叉法和半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）法檢測芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的抑菌效果。用PDA培養(yǎng)基將芳樟醇分別配制為質(zhì)量濃度0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 g/L，倒入直徑為90 mm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)基的溶液體積為10 mL。以不做任何處理的PDA平板（0 g/L芳樟醇）為空白對照，以加入體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液的PDA平板為陰性對照，以添加質(zhì)量濃度為8 g/L百菌清的PDA平板為陽性對照[17]。待平板冷凝后，將生長5 d的生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌餅反接于含藥平板中央，倒置培養(yǎng)于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔24 h，用十字交叉法測量各處理菌落直徑，共培養(yǎng)5 d。將48 h內(nèi)完全無菌絲生長的質(zhì)量濃度作為最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）[18]。每組處理設(shè)置5 個重復(fù)。根據(jù)生物統(tǒng)計法對病原菌生長抑制率與芳樟醇質(zhì)量濃度進行毒力分析，以各處理組芳樟醇質(zhì)量濃度對數(shù)為x軸、菌絲生長抑制率為y軸進行回歸分析，求出毒力回歸曲線方程、決定系數(shù)（R2）和EC50。

1.3.3 芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲體形態(tài)影響分析

將1×106spores/mL尖孢鐮刀菌孢子懸浮液加入50 mL PDB培養(yǎng)基中，添加芳樟醇，使其終濃度分別為0、1/2 MIC、MIC，在28 ℃、150 r/min恒溫搖床遮光振蕩培養(yǎng)3 d，收集菌絲。每組處理設(shè)5 個重復(fù)，參考文獻[19]的方法制備樣品，樣品固定后通過真空冷凍干燥機干燥，離子濺射鍍膜機鍍膜120 s，所有樣品均用SEM觀察并拍照。

1.3.4 芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)與活力影響分析

參考孫迪等[20]的方法，將濃度為1×104spores/mL尖孢鐮刀菌孢子懸浮液，添加芳樟醇，使其終濃度分別為0、1/2 MIC和MIC，以不做任何處理的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液（0 g/L芳樟醇）為空白對照，以加入體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液為陰性對照，以添加質(zhì)量濃度為8 g/L百菌清[17]的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液為陽性對照。于28 ℃黑暗培養(yǎng)6 h，使用血球計數(shù)板計數(shù)統(tǒng)計卵孢子數(shù)量。12 h后在熒光顯微鏡進行觀察，以芽管長于孢子直徑一半視為萌發(fā)，統(tǒng)計孢子萌發(fā)數(shù)。每組處理設(shè)5 個重復(fù)。

菌絲收集方法同1.3.3節(jié)，將少量菌絲體放入2 mL的離心管中，加入500 μL PI染色液，在37 ℃的水浴鍋中進行10 min遮光染色，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）漂洗3 次，每組處理設(shè)5 個重復(fù)，在熒光顯微鏡下進行觀察并拍照。

1.3.5 芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌細胞膜完整性影響分析

1.3.5.1 相對電導(dǎo)率測定

參考翁甜等[18]的方法測定生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的胞外電導(dǎo)率。菌絲收集方法同1.3.3節(jié)，稱取1 g濕菌絲于50 mL離心管中，加入30 mL去離子水重懸浮菌絲，添加芳樟醇使其終濃度為0、1/2 MIC、MIC，使用便攜式電導(dǎo)率儀測定0、2、4、6、8、10、12 h生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的胞外電導(dǎo)率L，最后將其煮沸處理10 min后冷卻至室溫，再次測定電導(dǎo)率L′，初始電導(dǎo)率為L0。每組處理設(shè)5 個重復(fù)。按式（1）計算相對電導(dǎo)率：

1.3.5.2 MDA含量測定

菌絲處理方法同1.3.5.1節(jié)，分別于處理0、3、6、9、12 h后收集不同處理組和對照組的菌絲體，加入提取液，充分研磨，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液，根據(jù)MDA試劑盒提供的方法測定生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲體內(nèi)MDA的含量。每組處理設(shè)5 個重復(fù)。

1.3.5.3 核酸泄漏量測定

參考翁甜等[18]的方法測定生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的核酸外泄情況。菌絲處理方法同1.3.5.1節(jié)，分別于0、2、4、6、8、10、12 h取上清液于12 000 r/min離心10 min后，用紫外分光光度計測定260 nm波長處的吸光度，測定菌絲體核酸的泄漏情況。每組處理設(shè)5 個重復(fù)。

1.3.6 麥角固醇含量的測定

參考王江來等[16]方法，測定芳樟醇處理后生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌細胞膜上麥角固醇含量。菌絲收集方法同1.3.3節(jié)，用無菌水洗滌2 次，記錄菌絲凈濕質(zhì)量，每組處理設(shè)5 個重復(fù)。在85 ℃條件下加入5 mL新鮮制備的質(zhì)量分?jǐn)?shù)25% KOH-乙醇混合液，皂化菌體4 h。皂化完畢冷卻至室溫，加入5 mL正庚烷溶液用于提取固醇，劇烈渦旋15 min，并于室溫靜置分層1 h。上層混合物用于紫外分光光度計檢測。每個處理組重復(fù)3 次。麥角固醇和固醇中間體24,28-脫氫麥角固醇在230 nm和282 nm波長處會生成特征吸收曲線，按式（2）計算麥角固醇含量：

1.3.7 芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的致病力影響分析

濃度為0、1/2 MIC、MIC芳樟醇溶液噴灑在生姜姜塊（3 cm×4 cm×1 cm）上。將姜塊分為4 個處理組，分別為陽性對照組（不做任何處理）、陰性對照組（只接種病原菌）、精油治療組、精油預(yù)防組。先接種病原菌（直徑為6 mm的生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌餅），24 h后再噴灑芳樟醇，即為精油治療組；先噴灑芳樟醇溶液，24 h后再接種病原菌，即為精油預(yù)防組。每個處理設(shè)15 個重復(fù)。在28 ℃光照培養(yǎng)箱（12 h光照、12 h黑暗）保濕培養(yǎng)3 d后測量姜塊病斑面積并拍照。防治效果按式（3）計算：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2003和SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan法進行方差分析和多重比較（α＝0.05）。利用Origin 2018軟件作圖。數(shù)據(jù)以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲體生長的影響

如圖1所示，對照組菌絲在整個培育期間都在持續(xù)生長，但芳樟醇含量的增加有效抑制了這種生長現(xiàn)象。8 g/L的百菌清完全抑制了生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的生長。

圖1 不同質(zhì)量濃度芳樟醇處理5 d對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制效果Fig.1 Inhibitory effects of linalool treatments at different concentrations on mycelium growth of F.oxysporum FOX-1 cultured for up to 5 days

由表1可知，生長2 d的生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌，芳樟醇處理的MIC為2.0 g/L，EC50為1.183 g/L。用0.125～0.5 g/L芳樟醇處理的菌落直徑與對照組相比差異不明顯，處理5 d后，抑菌率為（11.33±1.86）%～（18.00±4.51）%，當(dāng)處理質(zhì)量濃度提高到1～4 g/L 時，抑菌率達到（49.33±5.40）%～（100.00±0.00）%。結(jié)果表明，芳樟醇的抑菌活性與其有效濃度呈正相關(guān)。為了消除乙醇的影響，研究了體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌落生長的影響。結(jié)果表明，30%乙醇溶液對菌落生長幾乎沒有影響（P＞0.05）。

表1 芳樟醇處理5 d對尖孢鐮刀菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effects of linalool treatment for 5 days on F.oxysporum FOX-1

2.2 芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲體形態(tài)的影響

如圖2所示，經(jīng)芳樟醇處理3 d后的生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲體形態(tài)發(fā)生了巨大的變化。對照處理組的菌絲豐滿、結(jié)構(gòu)完整、表面光滑；1/2 MIC處理組菌絲表面出現(xiàn)了輕微的皺紋和凹陷；MIC處理組菌絲表面出現(xiàn)了明顯的皺紋和凹陷。這些結(jié)果表明，芳樟醇影響了生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲的形態(tài)，破壞了其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，這很可能是抑制菌絲生長的原因。

圖2 芳樟醇處理3 d后生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲形態(tài)的掃描電鏡觀察Fig.2 SEM observation of the mycelial morphology of F.oxysporum FOX-1 after 3 days of linalool treatment

2.3 芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)和孢子活力的影響

由圖3可知，隨著芳樟醇質(zhì)量濃度的提高，生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)受到顯著抑制，8 g/L的百菌清與MIC芳樟醇的孢子濃度與孢子萌發(fā)率均無顯著差異。1/2 MIC與MIC芳樟醇處理生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌6 h其孢子濃度分別為（2.69±0.17）×104spores/mL和（1.43±0.12）×104spores/mL，顯著低于對照組（（5.79±0.19）×104spores/mL）；1/2 MIC與MIC芳樟醇處理枯孢鐮刀菌12 h其孢子萌發(fā)率分別為（17.21±4.14）%和（5.83±2.16）%，顯著低于對照組（95.12±3.78）%。PI是一種熒光染料，不能穿透完整的細胞膜，但可進入受損細胞，與核酸結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光。對照組的菌絲未出現(xiàn)紅色熒光，而處理組（1/2 MIC、MIC）的熒光信號以芳樟醇質(zhì)量濃度依賴性的方式逐漸增加（圖4），說明芳樟醇破壞了細胞膜，進一步驗證了芳樟醇處理后生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌分生孢子的活力明顯降低。

圖3 不同質(zhì)量濃度芳樟醇處理12 h對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響Fig.3 Effects of linalool treatments at different concentrations for 12 h on spore germination of F.oxysporum FOX-1

圖4 芳樟醇處理6 h后生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌熒光顯微觀察表型Fig.4 Phenotype of F.oxysporum FOX-1 after 6 h linalool treatment observed by fluorescence microscope

2.4 芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲體細胞膜完整性的影響

通過分析相對電導(dǎo)率、核酸含量（OD260nm）、MDA濃度、麥角固醇含量，確定生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌細胞膜的完整性。如圖5A所示，CK組電導(dǎo)率在整個處理期都保持在較低水平，而芳樟醇處理組電導(dǎo)率隨著時間的延長與質(zhì)量濃度的增加而提高；芳樟醇處理12 h后，與CK組相比，1/2 MIC與MIC芳樟醇使菌液電導(dǎo)率分別提高了2.3 倍與2.8 倍。細胞滲漏是判斷細胞膜損傷的重要指標(biāo)，CK組核酸含量與MDA濃度幾乎沒有變化，但是芳樟醇處理后生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲的滲漏明顯增加（圖5B、C）。芳樟醇處理12 h后，與CK組相比，1/2 MIC與MIC芳樟醇使核酸泄漏量分別提高了3.7 倍與5.7 倍，MDA濃度分別提高了1.3 倍與1.9 倍。麥角固醇是絲狀真菌細胞膜的主要固醇成分，其含量的減少也可證實細胞膜受到損傷。與CK組相比，隨著芳樟醇質(zhì)量濃度的增加，麥角固醇含量顯著降低（圖5D）。芳樟醇處理12 h后，與CK組相比，1/2 MIC與MIC芳樟醇使麥角固醇含量分別降低了9.1%與28.6%。因此，本研究推斷芳樟醇誘導(dǎo)菌絲內(nèi)物質(zhì)代謝異常，從而阻礙菌絲的生長。

圖5 不同質(zhì)量濃度芳樟醇處理對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌細胞完整性的影響Fig.5 Effects of linalool treatments at different concentrations on cell membrane permeability of F.oxysporum FOX-1

2.5 芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌致病力的影響

如圖6所示，接種3 d后芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的生長具有較好的防治效果。其中，陰性對照無菌絲生長，陽性對照的生姜塊上出現(xiàn)明顯的菌絲生長，病斑面積為（5.50±0.11）cm2，1/2 MIC芳樟醇處理的生姜塊上也有明顯的菌絲生長，但與陽性對照組相比，治療組與預(yù)防組的菌絲生長面積分別下降49.6%和67.3%（表2），然而，無論是治療組還是預(yù)防組，經(jīng)MIC芳樟醇處理后的生姜塊上均無菌絲生長（圖6），表明高濃度芳樟醇處理顯著減弱了生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的致病力。

表2 芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的致病力影響Table 2 Effect of linalool on the pathogenicity of F.oxysporum FOX-1

圖6 不同質(zhì)量濃度芳樟醇處理3 d后生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌致病力的變化Fig.6 Changes in pathogenicity of F.oxysporum FOX-1 after 3 d linalool treatment at different concentrations

3 討論

為了測定芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的抑制作用是否依賴于其直接的抑菌活性，本研究首先評估了芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲生長的影響。芳樟醇在質(zhì)量濃度為0.125～4 g/L之間對尖孢鐮刀菌菌絲生長具有不同程度的抑制作用，MIC為2 g/L。宿主植物的二次感染多由分生孢子引起，因此，理論上任何可以抑制孢子產(chǎn)生和孢子萌發(fā)的殺菌劑都有助于減少病害的發(fā)生[21]。故本研究進一步測定了芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，在2 g/L芳樟醇處理下生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率僅為（5.83±2.16）%，基本抑制了生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌孢子的萌發(fā)。這與芳樟醇對其他病原菌的抑制作用相似，例如2 mL/L的芳樟醇基本抑制了灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）菌絲生長與孢子萌發(fā)[10]；1.5 mL/L芳樟醇對莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）具有較強的抑制作用，芳樟醇能破壞莓實假單胞菌細胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)和細胞膜的完整性[22]。Liu Xue等[23]研究表明，431 μg/mL芳樟醇處理銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）16 h后，大部分細菌細胞發(fā)生彎曲、凹陷，細胞表面出現(xiàn)粗糙不均勻和細胞破裂等形變現(xiàn)象。本研究SEM結(jié)果顯示，2 g/L芳樟醇處理后，生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲同樣發(fā)生褶皺、扭曲、斷裂等形變現(xiàn)象。綜上，推測芳樟醇通過直接抑制病原菌的營養(yǎng)生長和生殖生長，破壞病原菌細胞結(jié)構(gòu)，從而達到減輕病害發(fā)生的目的。

細胞膜是真菌組織結(jié)構(gòu)的一部分，能夠維持真菌正常的生理結(jié)構(gòu)，是細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要通道，能夠有效調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定，保障真菌的正常生命活動[20]。PI是一種不可進入活細胞的熒光染料，其熒光結(jié)果通常反映了細胞凋亡狀況[24]。芳樟醇處理組的PI染色熒光強度明顯高于CK組。活細胞具有完整的細胞膜，會阻礙PI染色液與細胞內(nèi)DNA結(jié)合，導(dǎo)致熒光強度較弱。因此，熒光效應(yīng)的差異也表明芳樟醇具有破壞細胞膜結(jié)構(gòu)和改變其通透性的能力，這與芳樟醇對索氏志賀氏菌的PI染色結(jié)果[25]一致。細胞膜的損傷通常會出現(xiàn)細胞內(nèi)大物質(zhì)泄漏現(xiàn)象[26-27]。經(jīng)1 g/L與2 g/L芳樟醇處理的生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌細胞內(nèi)容物有明顯的泄漏。隨著芳樟醇處理濃度的增加和處理時間的延長，尖孢鐮刀菌菌絲的相對電導(dǎo)率、核酸含量呈明顯的上升趨勢。細胞膜是一些植物精油的常見靶標(biāo)，例如，Li Xiuming等[28]發(fā)現(xiàn)芳樟醇通過對番茄尖孢鐮刀菌細胞膜的破壞，有效控制了番茄枯萎病的發(fā)生。芳樟醇通過熏蒸破壞灰葡萄孢細胞膜的完整性，從而減輕灰霉病的癥狀[10]。

麥角固醇是真菌細胞膜中最豐富和主要的固醇成分，參與細胞膜通透性和流動性、整體膜蛋白的調(diào)節(jié)[29]。因此，它是細胞膜結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵，麥角固醇含量的降低會導(dǎo)致細胞膜被破壞[30]。MDA含量是細胞膜脂過氧化的指標(biāo)，它反映了膜脂過氧化和細胞膜損傷程度[31]。許多合成殺菌劑，如咪鮮胺（C15H16Cl3N3O2）和抑霉唑（C14H14Cl2N2O），以靶向細胞膜和抑制麥角固醇的生物合成為殺菌機制[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)芳樟醇處理顯著降低了麥角甾醇含量，可以推斷芳樟醇通過抑制麥角甾醇合成破壞生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌細胞膜。此外，芳樟醇處理增加了MDA的含量，說明生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌發(fā)生了脂質(zhì)過氧化，加重了對細胞膜的損傷，抑制了菌絲的生長。

本研究在驗證芳樟醇抑菌機理的同時，還測試了芳樟醇降低生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌致病力的能力。高文騰[14]研究表明，0.72 mg/mL芳樟醇噴藥處理能夠顯著降低小麥的病小穗率，400 μL芳樟醇拌土處理可顯著降低大豆疫病的發(fā)生。Xu Yanqun等[34]研究表明，芳樟醇熏蒸處理顯著抑制草莓果實的灰霉病，延長草莓保鮮期。Li Xiuming等[28]研究表明，芳樟醇通過破壞番茄尖孢鐮刀菌細胞膜的結(jié)構(gòu)、阻礙其氧化還原功能和營養(yǎng)代謝，抑制其活性。Shen Qing等[29]研究表明，芳樟醇熏蒸能顯著抑制番茄灰葡萄孢菌絲體生長，增加抗氧化酶活性和抗壞血酸含量，與細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的主要酶多聚半乳糖醛酸（內(nèi)切）酶、纖維素酶、β-半乳糖苷酶被芳樟醇抑制，表明芳樟醇可以保持細胞壁結(jié)構(gòu)的完整性，加強對病原體的物理屏障，從而減輕番茄果實灰霉病的癥狀。本研究結(jié)果表明，向生姜姜塊噴灑芳樟醇溶液顯著減弱了生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的致病力，說明芳樟醇在根源上抑制了生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲體和孢子的生長，破壞細胞結(jié)構(gòu)，同時降低了生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的分解能力，從侵入寄主的角度起到減輕病害發(fā)生的作用。這些研究結(jié)果為更好地開發(fā)和利用芳樟醇作為植物源抑菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，2 g/L的芳樟醇可有效抑制生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌菌絲的生長，孢子萌發(fā)率僅為（5.83±2.16）%，能夠破壞菌絲體的細胞膜，增加細胞的通透性，使菌絲體發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致菌絲體內(nèi)外環(huán)境失衡，影響菌絲體的正常生命活動，從而降低生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的致病力。綜上，本研究初步探討了芳樟醇對生姜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的抑制作用機理，研究結(jié)果可為生姜枯萎病的生物防治提供新的思路，為后續(xù)工作的開展和深入研究提供理論依據(jù)，對生產(chǎn)上綜合防控生姜枯萎病和其他土傳病害具有重要的實踐指導(dǎo)意義和研究價值。