酒煎瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病多靶點(diǎn)作用機(jī)制的交互網(wǎng)絡(luò)分析

劉明陽，張洋，高麗，董振飛，曾以德

山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

冠心?。–HD）是由冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引發(fā)管腔狹窄或閉塞所導(dǎo)致的器質(zhì)性心臟疾病[1]?！吨袊?guó)心血管健康與疾病報(bào)告》2020[2]顯示，中國(guó)心血管病患病率處于持續(xù)上升階段，截至2020 年，CHD 患者數(shù)量可能超1 139 萬?！端貑枴づK氣法時(shí)論》記載：“心病者，胸中痛，脅支滿，脅下痛，膺背肩胛間痛。”《類證治裁·胸痹》記載：“胸痹，胸中陽微不運(yùn)，久則陰乘陽位，而為痹結(jié)也?！焙笫莱ⅰ瓣栁㈥幭摇笨醋鰿HD 的病機(jī)，胸中陽氣衰微日久，寒邪、水飲、痰濁、血瘀等邪實(shí)上乘，痹阻胸陽，不通則痛。《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》記載：“胸痹不得臥，心痛徹背者，瓜蔞薤白半夏湯主之?！贬槍?duì)痰濕瘀滯、陽氣不振的胸痹，可用具有通陽行氣、化痰散結(jié)功效的酒煎瓜蔞薤白半夏湯進(jìn)行治療。研究表明，瓜蔞薤白半夏湯治療CHD 痰瘀互結(jié)證取得了良好療效[3]。楊衛(wèi)明[4]對(duì)56 例CHD 患者使用瓜蔞薤白半夏湯治療，臨床療效優(yōu)于常規(guī)治療方案。酒在本方中體現(xiàn)出了散痹通陽、載藥上行等作用。本研究遵循《金匱要略》中的方法，使用瓜蔞、薤白、清半夏、米酒同煮，通過臨床觀察證實(shí)酒煎療效更優(yōu)。中藥方劑的藥物成分多不明確，作用機(jī)制往往不清楚，限制了中醫(yī)藥的發(fā)展，也難以體現(xiàn)中藥復(fù)方多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以闡述中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制，有效彌補(bǔ)既往研究中單靶點(diǎn)、低選擇性的不足[6]。但是在研究方法中仍存在一些技術(shù)性缺陷，嚴(yán)重影響網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)虛擬篩選的準(zhǔn)確性[7]。近年來，質(zhì)譜分析技術(shù)發(fā)展迅速，其可更客觀地分析中藥復(fù)方煎劑中的化學(xué)成分[8]。本研究采用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-Q-TOF/MS）分析酒煎瓜蔞薤白半夏湯的化學(xué)成分，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法和分子對(duì)接手段，對(duì)該方治療CHD 的作用機(jī)制進(jìn)行分析，為深入探究酒煎瓜蔞薤白半夏湯治療CHD的藥理作用及治療機(jī)制提供借鑒和參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試劑1260 型高效液相色譜儀和6230 型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司），HALO 90A C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7μm，美國(guó)AMT 公司），F(xiàn)A1604N 型0.1 mg 電子天平秤（上海精密科學(xué)儀器有限公司）， Centrifuge 5420 微量離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）， 明澈D24 UV 純水儀（Merck Millipore），YM-080S 超聲儀（深圳市方奧微電子有限公司）。甲醇、乙腈、甲酸（上海麥克林生化科技股份有限公司），純度均為L(zhǎng)C-MS 級(jí)。

1.2 中藥飲片瓜蔞、薤白、清半夏飲片均由河北康益強(qiáng)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，所有藥材均由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室梁曉東副教授進(jìn)行鑒定和評(píng)估。

2 研究方法

2.1 酒煎瓜蔞薤白半夏湯制備精確稱取瓜蔞24 g、清半夏12 g、薤白9 g 及米酒700 mL。上述材料置于煎藥砂鍋中浸泡1 h 后煎煮1 h，倒出藥液，紗布過濾，再次加入米酒700 mL，重復(fù)以上操作。合并2 次濾液并濃縮至250 mL，制備成酒煎瓜蔞薤白半夏湯標(biāo)準(zhǔn)煎液[3]。

2.2 質(zhì)譜供試液制備取酒煎瓜蔞薤白半夏湯標(biāo)準(zhǔn)煎液1 mL，放入真空冷凍干燥機(jī)中，冷阱盤管溫度設(shè)置為-80 ℃，真空度1 Pa 以下。48 h 后取出凍干樣品，精密加入100% 甲醇1 mL，超聲40 min，12 000 r/min 離心12 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得酒煎瓜蔞薤白半夏湯質(zhì)譜供試液。

2.3 液質(zhì)聯(lián)用成分分析①色譜條件。HALO 90A C18 色譜柱，流動(dòng)相-0.1% 甲酸水溶液（A）-乙腈溶液（B）梯度洗脫（0～10 min，2%～10%B；10～20 min，10%～20%B；20～25 min，20%～45%B；25～30 min，45%～95% B；30～35min，95%～100% B），流速0.3 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm、254 nm、310 nm、325 nm，進(jìn)樣量2 μL。②質(zhì)譜條件。采用電噴霧離子源（ESI），離子源電壓3.2 kV，毛細(xì)管加熱溫度為350 ℃，霧化氣壓35 psig，碎裂電壓175 V，離子源溫度350 ℃，干燥氣流量8 L/min，質(zhì)譜掃描范圍m/z50～1 500，鞘氣、輔助氣均為氮?dú)?。按照以上條件進(jìn)行設(shè)置，對(duì)正、負(fù)離子模式分別檢測(cè)，獲取總離子流圖。

2.4 酒煎瓜蔞薤白半夏湯化學(xué)成分鑒定通過查詢中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）、PubMed 數(shù)據(jù)庫組建瓜蔞、薤白、清半夏的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，通過中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID）、 有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem）、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）檢索中藥相關(guān)化學(xué)成分信息，通過正離子模式下[M+H]+、[M+Na]+及負(fù)離子模式下[M-H]-、[M+HCOO]-加合分子離子的精確理論質(zhì)荷比，對(duì)色譜峰各成分進(jìn)行精確指認(rèn)。

2.5 酒煎瓜蔞薤白半夏湯化學(xué)成分篩選與分子結(jié)構(gòu)獲取通過PubChem 數(shù)據(jù)庫對(duì)酒煎瓜蔞薤白半夏湯組成藥物的化學(xué)成分進(jìn)行類藥性識(shí)別，篩選出結(jié)構(gòu)明確、有藥理作用的成分作為本方的活性成分。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫檢索活性成分對(duì)應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)，將分子結(jié)構(gòu)下載并保存為SDF 格式。

2.6 酒煎瓜蔞薤白半夏湯作用靶點(diǎn)篩選將“2.5”中得到的SDF 格式文件導(dǎo)入Swiss 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），研究物種選擇“Homo sapiens”，檢索出活性成分的作用靶點(diǎn)，去重后即為酒煎瓜蔞薤白半夏湯的作用靶點(diǎn)。

2.7 疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）中進(jìn)行檢索，Score≥10 作為篩選的條件。將結(jié)果取交集后獲得CHD 的相關(guān)靶點(diǎn)。

2.8 藥物-疾病作用靶點(diǎn)篩選在韋恩圖繪制工具（http：//www.ehbio.com/test/venn/#/）中分別錄入酒煎瓜蔞薤白半夏湯和CHD 的作用靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，取交集后的共同靶點(diǎn)即為酒煎瓜蔞薤白半夏湯治療CHD 的作用靶點(diǎn)。

2.9 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建及分析將中藥的活性成分及獲取的潛在基因作用靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件，構(gòu)建中藥-活性成分-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer 功能對(duì)主要活性成分進(jìn)行分析，節(jié)點(diǎn)的大小代表度值（degree）的高低。

2.10 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)建立及功能富集分析將作用靶點(diǎn)上傳至Metascape 在線分析網(wǎng)站（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），建立PPI 網(wǎng)絡(luò)及基因本體（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，并繪制氣泡圖進(jìn)行可視化。將GO 富集分析中的生物過程、細(xì)胞成分、分子功能的相關(guān)靶點(diǎn)錄入OmicStudio 網(wǎng)站（https：//www.omicstudio.cn/tool）進(jìn)行Upset 分析并繪圖，篩選酒煎瓜蔞薤白半夏湯調(diào)控CHD 的主要方式與核心靶點(diǎn)。

2.11 分子對(duì)接使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫下載核心活性成分的3D 結(jié)構(gòu)，保存為SDF 格式，使用OpenBabel軟件將文件格式轉(zhuǎn)換為mol2。 在PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）中檢索基因靶點(diǎn)，物種篩選條件為“Homo sapiens”，將核心靶點(diǎn)的3D 結(jié)構(gòu)保存為PDB 格式，使用PyMOL viewer 軟件打開并去除水分子及配體。使用AutoDockTools 軟件對(duì)靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫鍵處理，設(shè)置grid box 覆蓋全部結(jié)構(gòu)，運(yùn)行Autogrid 程序進(jìn)行第一次對(duì)接運(yùn)算，使用Genentic Algorithm 算法進(jìn)行運(yùn)算后，運(yùn)行AutoDock程序進(jìn)行第二次對(duì)接運(yùn)算。統(tǒng)計(jì)結(jié)合能，若結(jié)合能≤-5 kJ/mol 即可認(rèn)為對(duì)接成功，將篩選出的結(jié)合位點(diǎn)保存為PDBQT 格式文件后，使用PyMOL viewer 軟件進(jìn)行可視化處理。

3 研究結(jié)果

3.1 酒煎瓜蔞薤白半夏湯化學(xué)成分分析供試液正負(fù)離子模式的總離子流色譜圖（TIC）見圖1。在正、負(fù)離子模式下從酒煎瓜蔞薤白半夏湯中共分析鑒定出76 個(gè)化學(xué)成分，包含正離子模式下鑒定出的59 個(gè)化學(xué)成分及負(fù)離子模式下鑒定出的17 個(gè)化學(xué)成分。

圖1 酒煎瓜蔞薤白半夏湯UPLC-Q-TOF/MS 分析的TIC

3.2 藥物-疾病共同作用靶點(diǎn)酒煎瓜蔞薤白半夏湯組成藥物中瓜蔞作用靶點(diǎn)603 個(gè)，薤白作用靶點(diǎn)140 個(gè)，清半夏作用靶點(diǎn)623 個(gè)，去重后得到作用靶點(diǎn)751 個(gè)。CHD 靶點(diǎn)取交集，共得到靶點(diǎn)1 249 個(gè)。繪制韋恩圖（圖2），酒煎瓜蔞薤白半夏湯與CHD 的靶點(diǎn)取交集后獲得潛在作用靶點(diǎn)190 個(gè)。

圖2 藥物-疾病作用靶點(diǎn)韋恩圖

3.3 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將瓜蔞、薤白、清半夏的活性成分及作用靶點(diǎn)輸入Cytoscape3.8.2軟件后繪制網(wǎng)絡(luò)圖，190 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)與所對(duì)應(yīng)的52 個(gè)活性成分參與網(wǎng)絡(luò)圖繪制，見圖3。潛在作用靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的活性成分中，10 個(gè)成分能與20 個(gè)以上的靶點(diǎn)相連接，推測(cè)這10 個(gè)成分是酒煎瓜蔞薤白半夏湯發(fā)揮CHD 治療作用的主要活性成分，見表1。

表1 酒煎瓜蔞薤白半夏湯主要活性成分信息表

圖3 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)及功能富集分析酒煎瓜蔞薤白半夏湯的PPI 結(jié)果顯示，其中94 個(gè)核心靶點(diǎn)均有相互作用，300 條邊構(gòu)成了各蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)，見圖4。其中白細(xì)胞介素（IL）-1β、 磷酸肌醇3 激酶α（PIK3CA）、雌激素受體（ESR）2 等靶蛋白關(guān)聯(lián)度排名較高。GO 富集分析顯示，生物過程結(jié)果主要涉及激素反應(yīng)、對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用、細(xì)胞遷移的正向調(diào)控等；細(xì)胞組成結(jié)果主要集中于膜筏、膜側(cè)等；分子功能結(jié)果主要涉及絲氨酸水解酶活性、脂質(zhì)結(jié)合、血紅素結(jié)合等。KEGG 功能富集分析結(jié)果主要涉及脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、cGMP-PKG 通路、鈣信號(hào)通路、PPAR 信號(hào)通路，見圖5。Upset 分析顯示，激素反應(yīng)與脂質(zhì)結(jié)合的相關(guān)靶點(diǎn)存在高度重合，12 個(gè)共同靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為雄激素受體（AR）、ESR1、ESR2、核受體亞家族1H3（NR1H3）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）、過氧化物酶體增殖物激活受體δ（PPARD）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、血小板活化因子受體（PTAFR）、維生素D 受體（VDR）、維甲酸X 受體α（RXRA）、核受體亞家族3C1（NR3C1）、核受體亞家族3C2（NR3C2），見圖6。

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 GO 與KEGG 富集分析示意圖

圖6 激素反應(yīng)與主要細(xì)胞成分及分子功能靶點(diǎn)交互關(guān)系

3.5 分子對(duì)接對(duì)“3.4”篩選出的12 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)獲取PDB ID 和靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)，再分別與有效成分進(jìn)行對(duì)接。結(jié)合能≤-5 kJ/mol 表示有較好的結(jié)合活性，有效成分中環(huán)（亮氨酸-酪氨酸）、美迪紫檀素、肉葉蕓香堿顯示結(jié)合能力較好，與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了11 次成功對(duì)接，見表2。分子對(duì)接的可視化結(jié)果見圖7。

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)與有效成分分子對(duì)接信息表

圖7 分子對(duì)接示意圖

4 討論

本研究將751 個(gè)酒煎瓜蔞薤白半夏湯作用靶點(diǎn)與1 249 個(gè)CHD 靶點(diǎn)取交集，獲得藥物-疾病潛在作用靶點(diǎn)190 個(gè)。結(jié)果顯示，52 個(gè)活性成分與潛在作用靶點(diǎn)有對(duì)應(yīng)關(guān)系，通過中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，美迪紫檀素、肉葉蕓香堿、環(huán)（亮氨酸-酪氨酸)、亞油酸、石榴酸為酒煎瓜蔞薤白半夏湯影響CHD 疾病靶點(diǎn)的主要活性成分。其中，美迪紫檀素是一種具有生物活性的紫檀香酚，通常被應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等疾病的治療[9]。炎癥反應(yīng)在CHD發(fā)病全程都起到重要的作用，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6 等促炎因子的上升被證實(shí)與CHD發(fā)病相關(guān)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，美迪紫檀素可通過下調(diào)各種促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6 和IL-17A，上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10，發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞活性的作用[11]。肉葉蕓香堿是一種具有抗癌和抗炎作用的天然生物堿。有研究指出，肉葉蕓香堿通過增加一氧化氮（NO）的釋放舒張血管，抑制腎上腺素受體功能與鈣通道激活所導(dǎo)致的血管收縮[12]。而NO 和鈣通道抑制劑被認(rèn)為對(duì)CHD 有治療作用[13]。環(huán)（亮氨酸-酪氨酸）是一種具有生物活性的環(huán)狀二肽，有抑制血小板聚集的作用，能通過激活PI3K/Akt 通路產(chǎn)生抗炎作用，有效治療CHD[14]。亞油酸是一種不飽和脂肪酸，增加亞油酸的攝入可以降低CHD 等心血管疾病導(dǎo)致的病死率[15]。亞油酸也具有抗氧化應(yīng)激與抗炎的作用，能夠調(diào)控血清中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)，降低血清中MMP-9 水平有利于CHD 疾病轉(zhuǎn)歸[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，石榴酸可通過激活PPARG 調(diào)控CHD 的發(fā)展[17-18]。因此，酒煎瓜蔞薤白半夏湯可能通過美迪紫檀素、肉葉蕓香堿、環(huán)（亮氨酸-酪氨酸）、亞油酸、石榴酸等活性成分影響CHD 的疾病進(jìn)程。

為深入挖掘酒煎瓜蔞薤白半夏湯調(diào)控CHD 的潛在作用機(jī)制，本研究進(jìn)行了GO、KEGG 富集分析。有研究顯示，cGMP-PKG 通路異?？梢鸲喾N心血管疾病[19]。通過激活cGMP-PKG 通路并上調(diào)LDLR基因表達(dá)，清除過多冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的低密度脂蛋白（LDL）可緩解內(nèi)皮損傷[20]。鈣通道拮抗劑可抑制血管平滑肌中的鈣通道引發(fā)的血管收縮，通過擴(kuò)張血管調(diào)控CHD[21]。

在本研究中，Upset 分析結(jié)果顯示，激素調(diào)控與脂質(zhì)結(jié)合存在關(guān)聯(lián)，其中AR、ESR2、PPARA 等12 個(gè)靶點(diǎn)被認(rèn)為是核心靶點(diǎn)。通過分子對(duì)接對(duì)12 個(gè)核心靶點(diǎn)與酒煎瓜蔞薤白半夏湯主要活性成分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其中6 個(gè)核心靶點(diǎn)與以上3 個(gè)活性成分成功對(duì)接，包括PPARA、RXRA、AR、PPARG、PPARD、ESR2。其中，PPARG 與RXRA 屬于核受體超家族，是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵參與者[22]。相關(guān)研究證明，PPARG 與RXRA 在CHD 患者的巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中表達(dá)水平均顯示出下調(diào)趨勢(shì)，相關(guān)基因的低表達(dá)不利于CHD 患者的愈后[23]。PPARA、PPARG、PPARD 是脂蛋白代謝、能量平衡、炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，可獨(dú)立或通過相互作用導(dǎo)致機(jī)體脂代謝異常，提高CHD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[24]。雄激素也被證實(shí)對(duì)CHD 有調(diào)控作用，能夠降低CHD易感基因ADTRP 的表達(dá)，在心血管疾病中起保護(hù)作用[25]。ESR2 可與雌激素進(jìn)行高親和力的結(jié)合，雌激素已被證明可以通過其受體ESR2 下調(diào)HUVEC 中糖蛋白（GP130）的表達(dá)，而GP130 是IL-6 轉(zhuǎn)信號(hào)通路中的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在動(dòng)脈粥樣硬化的慢性炎癥中起關(guān)鍵作用[26]。雌激素也可通過其G 蛋白耦聯(lián)受體GPER 和SR-BI 抑制LDL 轉(zhuǎn)胞吞作用，可對(duì)CHD 起到預(yù)防和早期治療作用[27]。本研究中，美迪紫檀素、肉葉蕓香堿、環(huán)（亮氨酸-酪氨酸）均與以上靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合能力，驗(yàn)證了這3 種成分可能通過影響激素反應(yīng)調(diào)節(jié)脂質(zhì)結(jié)合，通過酒煎瓜蔞薤白半夏湯調(diào)控CHD 對(duì)多個(gè)信號(hào)通路發(fā)揮作用。

綜上，本研究運(yùn)用UPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)對(duì)酒煎瓜蔞薤白半夏湯的活性成分進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)酒煎瓜蔞薤白半夏湯可能通過激素反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)結(jié)合的方式干預(yù)CHD，為后續(xù)復(fù)方藥物的基礎(chǔ)研究和CHD 的臨床治療提供數(shù)據(jù)支持和理論保障。