供者來源游離DNA在肝移植領(lǐng)域相關(guān)研究與應(yīng)用進(jìn)展

梁 田,楊洪吉,狄文佳

(1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,四川 成都 611731;2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院器官移植中心,四川 成都 610072)

在過去的幾十年里,肝移植術(shù)后一年后的長期生存率并沒有改善[1,2]。移植排斥反應(yīng)(transplant rejection)是指:受者進(jìn)行同種異體組織或器官移植術(shù)后,外源性的組織或器官等移植物被受者免疫系統(tǒng)識別,受者發(fā)起針對移植物的攻擊、破壞和清除的免疫學(xué)反應(yīng)。排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫這兩部分。臨床最常見的急性排斥反應(yīng)主要由細(xì)胞免疫介導(dǎo),而超急性排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)主要由體液免疫介導(dǎo)?；颊咝栝L期進(jìn)行免疫抑制治療,來保證移植器官功能。肝移植術(shù)后患者(liver transplantation patients,LT)死亡數(shù)約四分之一來源于長期使用免疫抑制劑導(dǎo)致移植物出現(xiàn)感染,腫瘤等并發(fā)癥。移植物出現(xiàn)術(shù)后功能障礙導(dǎo)致移植患者死亡的數(shù)量約占11%～12%[1]。個性化免疫抑制(individual immunosuppression,IS)有望對LT后的長期生存產(chǎn)生積極影響,并能更好地平衡必要的異體反應(yīng)性抑制和慢性IS的不良影響。在前瞻性研究IS最小劑量的實驗中,強(qiáng)調(diào)了移植物穿刺活檢的重要性[3～5],穿刺活檢能對IS指導(dǎo)作出有效價值,雖然穿刺活檢具有較高的準(zhǔn)確性,但穿刺活檢價格昂貴,且不是肝移植患者常規(guī)隨訪項目[6],因此,需要一種更為簡單,有效的方法代替移植肝穿刺活檢。

1 供體來源細(xì)胞游離DNA

1.1 供體來源細(xì)胞游離DNA概述根據(jù)目前研究,最有前途的標(biāo)記物之一便是供體來源細(xì)胞游離DNA(donor-derivedcell-free DNA,ddcfDNA)[7]。ddcfDNA是一種來源于移植器官細(xì)胞的游離胞外DNA?？梢栽诟我浦残g(shù)后患者的血液與尿液中檢測出。而且近期相關(guān)研究表明,血液中ddcfDNA水平的絕對和相對增加與移植物損傷的程度有關(guān),例如,在缺血/再灌注損傷或排斥發(fā)作期間。患者血液中ddcfDNA絕對值上升。因此,在診斷急性排斥反應(yīng)時,ddcfDNA似乎比常規(guī)肝酶相關(guān)指標(biāo)更精確[8,9]。然而,以往的研究僅限于肝移植術(shù)后1年內(nèi)移植物損傷的評估[7]。近年來,關(guān)于ddcfDNA預(yù)測移植肝損失及檢測移植肝功能的實驗越來越多,受目前試驗條件受限,數(shù)據(jù)及結(jié)論也大不相同。

1.2 供體來源細(xì)胞游離DNA檢測移植物損傷的可行性隨著以PCR二代測序為基礎(chǔ)的高敏感性、高通量檢測技術(shù)的應(yīng)用,通過多種方法證實可在移植受者血,尿樣本中檢測到ddcfDNA及其所占總細(xì)胞游離DNA的比例[11,12]。近年來,越來越多的研究表明,ddcfDNA在腎移植術(shù)后移植腎功能檢測中具有巨大前景以及應(yīng)用價值。浙江大學(xué)Jiashen團(tuán)隊[12]的一項關(guān)于尿ddcfDNA與BK腎病的研究,此實驗收錄了147例患者的尿液血液標(biāo)本,此實驗證實了在急性移植腎損傷時,患者ddcfDNA水平明顯更高,另外也指出尿ddcfDNA水平可以區(qū)分1型T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)與BK多瘤病毒相關(guān)腎病,他們認(rèn)為ddcfDNA可以作為一種移植物損傷標(biāo)志,特別對于BK腎病領(lǐng)域。研究指出:在器官移植術(shù)后患者中,尿液ddcfDNA含量與血液ddcfDNA含量具有相關(guān)性,該研究指出,移植物受損的患者中,尿液中ddcfDNA含量成實質(zhì)性增高,且血液中含量同時成相關(guān)性增高。表明利用尿液檢測相關(guān)DNA含量評估移植物是否受損同樣具有可行性。尿液相對于血液來說,為更容易采集的標(biāo)本且更易于保存,對于患者來說更容易接受且普及。因此,大家開始廣泛研究ddcfDNA對于其他移植如肝移植、心臟移植、肺移植等是否具有同樣價值。

2 供體來源細(xì)胞游離DNA在肝移植領(lǐng)域研究進(jìn)展

在肝移植相關(guān)ddcfDNA的研究試驗中,Beck等[13]研究發(fā)現(xiàn)兩例移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)患者的血液中ddcfDNA含量增高超過正常值的55%～60%。此外,移植物相關(guān)并發(fā)癥如感染、血腫時也會影響ddcfDNA含量水平[14]。Macher等[15]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)肝移植出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)、肝動脈或靜脈血栓或多器官功能衰竭導(dǎo)致的移植物損傷,血液中ddcfDNA及總細(xì)胞游離DNA含量均會有不同程度增高。而在非移植物損傷性并發(fā)癥中如膽源性腹膜炎或創(chuàng)口感染,ddcfDNA含量無明顯異常升高或降低。Baumann等[16]對其中心61亞臨床移植物損傷患者的研究發(fā)現(xiàn),無組織性發(fā)生排斥反應(yīng)的患者(包括亞臨床T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)以及臨床顯性T細(xì)胞介介導(dǎo)的排異反應(yīng)),其患者的血液ddcfDNA絕對值逐步增加。以上研究均顯示ddcfDNA有望成為一種監(jiān)測各類器官移植物損傷的通用生物標(biāo)記物。此外,有部分研究發(fā)現(xiàn)在肝移植發(fā)生早期明顯的急性排斥反應(yīng)的前一周,ddcfDNA已開始增高[14]。Levitsky等[17]進(jìn)行了一項試驗,旨在評估ddcfDNA在肝移植受者移植物損傷診斷和作為移植物功能障礙不同原因之前的預(yù)測生物標(biāo)志物的效用。實驗分析其移植中心LT隊列的血漿中ddcfDNA。將經(jīng)活檢證實的急性排斥反應(yīng)患者(AR,n=57)、功能正?；颊?TX,n=94)和急性功能障礙且無排斥反應(yīng)患者(ADNR,n=68)按一定要求分組對比,其ddcfDNA檢測損傷的準(zhǔn)確性高達(dá)87%,從LT連續(xù)采集的血液樣本顯示,在移植物功能障礙發(fā)生前(包括急性排斥反應(yīng)患者與急性功能障礙但未發(fā)生排斥反應(yīng)者),ddcfDNA就以升高,但在功能正常患者中沒有升高。因此他們指出,在肝功能正常的情況下,ddcfDNA的連續(xù)升高可能可以識別移植物臨床前損傷,并且在移植物發(fā)生排斥反應(yīng)中最明顯。該生物標(biāo)志物可幫助發(fā)現(xiàn)移植物損傷和排斥反應(yīng)的早期跡象,為肝移植受者的管理策略提供相關(guān)參考價值。根據(jù)上述實驗結(jié)果,可知ddcfDNA在亞臨床排斥反應(yīng)早期診斷中具有一定的應(yīng)用價值。但Baumann等[16]同時指出:ddcfDNA片段在無創(chuàng)預(yù)測相關(guān)亞臨床移植物損傷方面的準(zhǔn)確性雖然高達(dá)87%,但其敏感性和特異性相當(dāng)有限,在一定的ddcfDNA片段的截斷值下,其預(yù)測靈敏度和特異性分別為73%和52%。根據(jù)此前瞻性監(jiān)測活檢計劃中移植物損傷的患病率計算,ddcfDNA分?jǐn)?shù)高于預(yù)設(shè)值的陽性預(yù)測值為76%,而陰性預(yù)測值為47%,因此不能實用ddcfDNA預(yù)測亞臨床移植物發(fā)生損傷的可能。而ddcfDNA僅僅只能作為移植物是否發(fā)生損傷的檢測指標(biāo)。以上部分觀點前后矛盾,可能的原因有:①樣本量少,出現(xiàn)小樣本得出大結(jié)論的可能。②受地區(qū)、人種、年齡等多方面影響可能造成選擇偏倚。③目前各個中心檢測方法不同,造成數(shù)據(jù)差異。

3 供體來源細(xì)胞游離DNA與個體化免疫抑制治療

3.1 個體化免疫抑制治療患者進(jìn)行肝移植之后,由于人免疫系統(tǒng)對外源性肝臟具有攻擊抵制作用,患者術(shù)后需要進(jìn)行免疫抑制治療來減少免疫系統(tǒng)對移植肝臟的攻擊。根據(jù)之前提供的數(shù)據(jù)顯示,移植受者約四分之一死亡來源于長期使用免疫抑制劑所產(chǎn)生的不良反應(yīng)導(dǎo)致移植器官衰竭或者其他組織器官出現(xiàn)新問題。移植藥物是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)最具挑戰(zhàn)和復(fù)雜的領(lǐng)域,過去30年研發(fā)有效的免疫抑制藥物(ISDs)已大大提高了器官移植受體的存活率,ISDs可用于阻斷不同作用機(jī)制的免疫系統(tǒng),最大程度減少器官排斥反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險,如炎癥、免疫力和組織修復(fù)等。但I(xiàn)SDs濃度過高可產(chǎn)生藥物毒性,濃度過低會導(dǎo)致移植器官發(fā)生排斥?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為,根據(jù)個體差異,制定個性化免疫抑制治療方案是保證移植物及患者長期生存的必要條件。

3.2 ddcfDNA在IS中的研究Oellerich等[18]比較了10例肝植患者術(shù)后5～30 d血液中ddcfDNA含量與他克莫司血藥濃度,發(fā)現(xiàn)ddcfDNA水平絕對值與他克莫司血藥濃度呈負(fù)相關(guān),且證實他克莫司最低有效濃度為6.8 μg/L,這與以往的研究結(jié)果相符合[19]。表明了ddcfDNA在檢測其他免疫抑制劑的免疫抑制最低有效濃度方面可能具有廣闊的應(yīng)用前景。器官移植術(shù)后患者在免疫抑制劑濃度控制不理想時,為避免免疫抑制劑過量及減少不良反應(yīng)會選擇更換免疫抑制劑,ddcfDNA可能用于檢測這些患者的免疫抑制效果。目前ddcfDNA在肝移植中的作用以及建立診斷標(biāo)準(zhǔn)和排除排斥反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)仍處于初級階段[20]。由于免疫抑制劑藥物的不良反應(yīng)仍然是導(dǎo)致患者的長期預(yù)后不良的主要原因。一種非侵入性標(biāo)記物來指導(dǎo)免疫抑制水平,并在免疫抑制管理中增加個性化免疫治療仍然是迫切的需求,ddcfDNA可能給我們研究方向提供一種新思路。

由于肝移植體積大,肝細(xì)胞再生率高,因此與腎移植相比,肝移植中有較高的ddcfDNA含量。Schutz等[9]發(fā)表的一項前瞻性研究(n=115)報道,在移植后的前2周內(nèi),由于缺血再灌注,受者血液中有非常高的ddcfDNA釋放。2周后,ddcfDNA中位數(shù)絕對值下降至≤10%。在沒有丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者樣本中,ddcfDNA百分率的中位數(shù)絕對值為3.3%,在HCV感染患者中,與非HCV感染患者相比,其中位水平較高,為5.9%,但仍低于10%的確定診斷或排除排斥反應(yīng)的零界點。使用來自80例穩(wěn)定的非HCV患者的232個樣本和來自16例活檢證實急性排斥反應(yīng)患者的28個樣本,將其與傳統(tǒng)肝功能檢測指標(biāo)(天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素)進(jìn)行比較。ddcfDNA優(yōu)于任何傳統(tǒng)肝功能檢測指標(biāo),其診斷曲線下面積為96.5%。在截斷值為10%的情況下,ddcfDNA的診斷敏感性為90.3%,特異性為92.9%,在這項研究中,當(dāng)穩(wěn)定的HCV陽性肝移植受者與有排斥反應(yīng)的肝移植受者進(jìn)行比較時,ddcfDNA的診斷敏感性、特異性和曲線下面積下降,但仍優(yōu)于傳統(tǒng)的肝移植檢測指標(biāo)。與非HCV感染患者相比,采用23.6%的截斷值,曲線下面積下降到88.2%,ddcfDNA的診斷敏感性為75%特異性為84.2%?？偟膩碚f,ddcfDNA相對于傳統(tǒng)肝功能檢測指標(biāo),其診斷移植物損傷診斷的敏感性及特異性都更高。上述研究中關(guān)于HCV陽性患者的經(jīng)驗可能表明,考慮到同種異體移植物損傷的無數(shù)原因,缺乏高水平的ddcfDNA可能在臨床實踐中更有利于作為移植物排斥的早期標(biāo)記。

4 總結(jié)與展望

在過去的幾年里,我們看到了在實體器官移植中關(guān)于ddcfDNA的臨床研究呈爆炸式增長[17]。根據(jù)現(xiàn)在目前的研究結(jié)果,專家們普遍認(rèn)為ddcfDNA不是異體移植物排斥反應(yīng)的特異性標(biāo)記物,更恰當(dāng)?shù)孛枋鰬?yīng)該為評估移植物損傷嚴(yán)重程度的標(biāo)記物,盡管這種損傷最常見的原因通常是異體移植物排斥反應(yīng),在異體移植物損傷存在時,ddcfDNA升高,似乎預(yù)示移植后不良事件。最近有報道稱,將ddcfDNA加入Banff活檢評分與單獨行移植物活檢評分相比,前者提供更好的預(yù)測[21]。有趣的是,有人認(rèn)為ddcfDNA本身可能是引起移植物炎癥,排斥反應(yīng)的原因[22]。最后,如果ddcfDNA被證明是一個連續(xù)的生物標(biāo)志物,它將會對移植受者管理提供全新的指導(dǎo)方向,提高移植受者的長期生存期。話雖如此,目前的數(shù)據(jù)并不能提供ddcfDNA關(guān)于連續(xù)監(jiān)測在實體器官移植患者管理中的效用的明確結(jié)論。需要人們進(jìn)一步進(jìn)行探究其可行性。