三種肺結(jié)核實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的方法學(xué)評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用價(jià)值

張曉坤, 李勰璘, 李筱慧

廣州市荔灣中心醫(yī)院檢驗(yàn)科(廣東廣州 510170)

結(jié)核分枝桿菌具有抗酸性,是引起結(jié)核病的病原菌,傳染性強(qiáng),感染后可以侵犯全身器官,臨床上以肺結(jié)核為主,目前感染情況呈上升趨勢(shì),結(jié)核病至今仍為重要的傳染病及慢性疾病,是導(dǎo)致患者死亡的主要疾病之一。根據(jù)WHO的最新報(bào)告,全球每年約有上千萬新發(fā)病例,將近有40%患者死亡。2014年中國新增肺結(jié)核病患者九十多萬例,僅次于印度和印度尼西亞, 居全球第3位[1]。經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)因艾滋病、吸毒、免疫抑制劑、酗酒和貧困等原因,發(fā)病率有上升趨勢(shì)。中國十四五結(jié)核病防治規(guī)劃提出的防治目標(biāo)是到2030年肺結(jié)核發(fā)病率降低80%,患者病死率降低90%,任重而道遠(yuǎn)。在社區(qū)中心及基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行結(jié)核病的早檢測(cè)、早診斷和結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測(cè),以達(dá)到早治療早控制的目的。傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法比較多,包括影像學(xué)、病理學(xué)、結(jié)核菌素試驗(yàn)、涂片鏡檢、結(jié)核菌培養(yǎng)等,但這些方法受限于假陽性、假陰性高,敏感度低,檢測(cè)時(shí)間過長,無耐藥結(jié)果,操作繁瑣,實(shí)驗(yàn)室要求高,生物安全要求高等不足,臨床診治得不到實(shí)驗(yàn)室的有效支持。臨床上常見治療藥物為利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素,利福平與異煙肼同時(shí)使用可以減少耐藥菌的產(chǎn)生。近年來,快速分子檢測(cè)技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用,特別是結(jié)核分枝桿菌相關(guān)耐藥基因快速診斷技術(shù)的廣泛使用,2010年WHO推薦使用Xpert MTB/RIF方法,是一種快速檢測(cè)結(jié)核桿菌和利福平耐藥性的檢驗(yàn)系統(tǒng),針對(duì)利福平耐藥核心區(qū)間RRDR設(shè)定引物、探針,進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)是否含有MTB及其是否對(duì)利福平耐藥,可以全自動(dòng)地對(duì)樣本進(jìn)行核酸提取純化,在2 h內(nèi)能提供檢測(cè)結(jié)果,為全自動(dòng)一體化半定量巢式實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng),用于結(jié)核菌的快速檢測(cè)和利福平耐藥性檢測(cè)[2],經(jīng)過多年實(shí)踐,臨床診治取得顯著成效,在耐多藥結(jié)核病早期診治中顯示出重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 檢測(cè)對(duì)象 留取2021年10月至2022年9月結(jié)核門診及住院患者529例,其中男350例,女179例,年齡(41±11)歲。肺結(jié)核患者晨痰標(biāo)本用專用的塑料痰瓶內(nèi)送檢,痰標(biāo)本以膿痰或膿性黏液樣痰為合格,痰量5 mL。分別用3種檢測(cè)方法檢測(cè),結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)照組為同時(shí)期隨機(jī)選擇的68例其他非結(jié)核肺部疾病(肺癌26例、肺炎32例、支氣管炎癥10例)患者,男41例,女27例,年齡(38±9)歲。以結(jié)核桿菌檢測(cè)陽性為確診依據(jù),按《臨床診療指南:結(jié)核病分冊(cè)》[3]作出診斷。本研究經(jīng)廣州市荔灣中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)倫理審查批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 胰酶為上海生物工程公司生產(chǎn);2 g/dL NaOH為自配;羅氏培養(yǎng)基為南京普朗公司生產(chǎn);利福平藥敏試劑為美國BD公司生產(chǎn);Xpert MTB/RIF設(shè)備和試劑盒為美國Cepheid公司生產(chǎn);抗酸染液為貝索公司生產(chǎn)。

1.3 檢測(cè)方法 (1)囑咐患者清晨漱口后留取1份晨痰樣本,按《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[4]進(jìn)行檢測(cè)、鑒定與藥敏試驗(yàn),無菌試管取5 mL痰液加入2～4倍量2 g/dL NaOH加塞振蕩液化,室溫30 min消化滅菌,取0.1 mL以無菌操作均勻接種培養(yǎng)基斜面上,37℃溫育,每周觀察,有菌落生長者,經(jīng)抗酸染色鏡檢報(bào)告抗酸分枝桿菌生長,若8周仍無菌生長報(bào)告陰性結(jié)果。(2)另取液化后的菌液1.1 mL加入1.1 mL的磷酸鹽緩沖液中混勻,取0.1 mL進(jìn)行涂片抗酸染色檢測(cè),取0.5 mL進(jìn)行Xpert MTB/RIF系統(tǒng)檢測(cè)[5]進(jìn)行檢測(cè)。(3)結(jié)果判讀:涂片法報(bào)告結(jié)果根據(jù)抗酸染色涂片中結(jié)核菌的多少判別為4+、3+、2+、1+和陰性;培養(yǎng)法報(bào)告結(jié)果根據(jù)羅氏培養(yǎng)基有菌落生長,經(jīng)抗酸染色鏡檢確認(rèn)抗酸分枝桿菌生長,再進(jìn)行藥敏試驗(yàn);Xpert MTB/RIF法(簡(jiǎn)稱Xpert,下同)的結(jié)果以高水平、中水平、低水平、極低水平和未檢出5個(gè)水平來表示,CT值<16,表示MTB檢出值為高水平;CT值為16～22,表示MTB檢出為中水平;CT值為23～28,表示MTB檢出為低水平;CT值為29～38,表示MTB檢出為極低水平;CT值>38,表示MTB未檢出。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 組間比較采用2檢驗(yàn), 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種檢測(cè)方法性能分析 Xpert法、培養(yǎng)法和涂片法的敏感度分別為40.64%(215/529)、35.35%(187/529)和15.31%(81/529)。Xpert法與培養(yǎng)法的檢測(cè)敏感度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=1.23,P>0.05),與涂片法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=67.21,P<0.05)。見表1、2。

表1 3種檢測(cè)方法結(jié)果比較 例

表2 3種檢測(cè)方法性能評(píng)價(jià) %

2.2 Xpert法性能評(píng)價(jià) 在529例肺結(jié)核患者中,涂片法檢測(cè)出陽性樣本81例,陰性樣本448例。以培養(yǎng)法作為比較標(biāo)準(zhǔn),在涂片法檢測(cè)陽性樣本中Xpert法檢測(cè)的敏感度和特異度分別為98.70%(76/77)和75.00%(3/4), Xpert法與培養(yǎng)法的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=0.167,P>0.05);在涂片法檢測(cè)陰性的樣本中,Xpert法的敏感度和特異度分別為94.74%(108/114)和 92.81%(310/334),Xpert法與培養(yǎng)法的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=9.63,P<0.05);在全部529例肺結(jié)核Xpert法檢測(cè)的樣本中的敏感度為96.79%(181/187),特異度為91.52%(313/342)。見表3。

表3 Xpert法和培養(yǎng)法結(jié)果對(duì)比 例

2.3 Xpert法與涂片法結(jié)果的分析 為分析Xpert法與涂片法結(jié)果的對(duì)應(yīng)關(guān)系,將Xpert法檢測(cè)結(jié)果分為高水平、中水平、低水平、極低水平和未檢出5個(gè)等級(jí), 其中在21例高水平樣本中, 培養(yǎng)法檢測(cè)全部為陽性, 培養(yǎng)報(bào)陽時(shí)間為16 d, 涂片法陽性14例中, 涂片陽性級(jí)別3+～4+者12例(85.71%); 其中在69例極低水平樣本中, 培養(yǎng)法檢測(cè)陽性為51例(陽性率為73.91%), 報(bào)陽時(shí)間為29 d, 涂片法檢測(cè)陽性僅有5例(陽性率為7.25%);在Xpert法檢測(cè)為陰性的314例樣本中,發(fā)現(xiàn)5例涂片法檢測(cè)為陽性,培養(yǎng)法檢測(cè)陽性為5例, 報(bào)陽時(shí)間為41 d。見表4。

表4 Xpert法與涂片法結(jié)果的評(píng)價(jià) 例(%)

2.4 Xpert法與培養(yǎng)法耐藥結(jié)果分析 選取Xpert法及培養(yǎng)法檢測(cè)均陽性的187例菌株進(jìn)行利福平藥敏試驗(yàn), 藥敏結(jié)果顯示Xper法、培養(yǎng)法對(duì)利福平的耐藥率分別為22.46%(42/187)和21.92%(41/187),兩種方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=0.167,P>0.05)。以培養(yǎng)法藥敏試驗(yàn)為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn),Xpert法對(duì)利福平耐藥的敏感度和特異度分別為95.12%(39/41)和97.95%(143/146),見表5。

表5 Xpert法與培養(yǎng)法耐藥結(jié)果分析

3 討論

實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)是診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn),特別是藥敏結(jié)果對(duì)指導(dǎo)臨床用藥和耐藥性監(jiān)測(cè)等方面具有重要作用。由于用藥的不規(guī)范,產(chǎn)生了耐多藥結(jié)核分枝桿菌,導(dǎo)致結(jié)核病的控制情況比較嚴(yán)峻,需要早診斷、早治療,早期快速檢測(cè)對(duì)早期合理治療起到?jīng)Q定性作用,也是耐藥結(jié)核病防治與控制的重要手段。因此耐多藥結(jié)核病患者得到早期、及時(shí)、合理的診療,是有效降低繼發(fā)性耐藥和結(jié)核病病死略的重要措施[6]。近年來,快速分子檢測(cè)技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用,特別是結(jié)核分枝桿菌相關(guān)耐藥基因快速診斷技術(shù)的廣泛使用,嚴(yán)峻形勢(shì)得到了改善。

Xpert法能早期快速檢測(cè)結(jié)核菌和MTB耐藥性,2010年WHO推薦其作為活動(dòng)性結(jié)核病及利福平耐藥的快速檢測(cè)技術(shù),特別是對(duì)結(jié)核發(fā)病率高及耐藥率高的國家作為結(jié)核菌早期快速檢測(cè)及耐多藥結(jié)核快速篩查的首選檢測(cè)方法,為全自動(dòng)一體化半定量巢式實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)[7-11],敏感度和特異度分別高達(dá)89%和99%,而結(jié)核菌素試驗(yàn)只有65%和75%,優(yōu)勢(shì)明顯。

結(jié)核菌的檢測(cè)除了影像學(xué)或病理學(xué)檢查外,實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果可作為確診依據(jù)。一方面,當(dāng)涂片法結(jié)果為陽性時(shí),使用Xpert法可以確診及排除非結(jié)核分枝桿菌感染,并能同時(shí)檢查利福平耐藥情況;另一方面,當(dāng)涂片法結(jié)果為陰性、患者有感染癥狀時(shí),亦能使用Xpert法確診并能同時(shí)提供利福平耐藥情況,指導(dǎo)臨床診治。

本研究采用涂片法、培養(yǎng)法和Xpert法對(duì)529例患者清晨痰液樣本進(jìn)行檢測(cè),Xpert法的敏感度與培養(yǎng)法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與涂片法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在涂片法陽性樣本中,Xpert法敏感度和特異度與培養(yǎng)法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在涂片法檢測(cè)為陰性樣本中,Xpert法與培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),充分說明Xpert法不僅在涂片法檢測(cè)陽性的樣本中有較好的檢出性能,而且在涂片法檢測(cè)為陰性的樣本中,也有較好的敏感度和特異度,檢測(cè)結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果[12-15]基本上保持一致。

本研究通過Xpert法與涂片法結(jié)果的評(píng)價(jià),說明Xpert法水平量級(jí)程度與樣本中MTB菌數(shù)呈正比,檢測(cè)結(jié)果等級(jí)越高,樣本中存在的結(jié)核桿菌數(shù)量越多,培養(yǎng)法報(bào)告陽性的時(shí)間越短,與國內(nèi)外相關(guān)研究[13]基本一致。

本研究以Xpert法及培養(yǎng)法檢測(cè)均為陽性結(jié)果的結(jié)核桿菌菌株進(jìn)行利福平藥敏試驗(yàn),藥敏結(jié)果顯示Xper法、培養(yǎng)法檢測(cè)利福平的耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以培養(yǎng)法藥敏試驗(yàn)為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn),Xpert法對(duì)利福平耐藥的敏感度和特異度與國內(nèi)外相關(guān)研究[16]結(jié)果符合。對(duì)于Xpert 法報(bào)告為極低水平等級(jí)及藥敏試驗(yàn)顯示利福平耐藥的樣本應(yīng)采用培養(yǎng)法藥敏試驗(yàn)或其他分子生物學(xué)手段進(jìn)一步確認(rèn),可以一定程度上避免假陽性的發(fā)生。Xpert法檢測(cè)結(jié)核桿菌和利福平耐藥性結(jié)果的報(bào)告時(shí)間能夠縮短至2 h,可以做到當(dāng)天采樣檢測(cè)當(dāng)天報(bào)告檢測(cè)結(jié)果,有利于結(jié)核病特別是耐藥菌株的早期診斷和治療,具有顯著的臨床應(yīng)用價(jià)值。

總體而言,培養(yǎng)法是診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn),但時(shí)效性不夠好,涂片法敏感度較低,易出現(xiàn)漏檢,均影響結(jié)核病的早期診療。Xpert法在快速檢測(cè)和利福平耐藥性評(píng)價(jià)方面敏感度和特異度均較高,臨床應(yīng)用價(jià)值顯著。

利益相關(guān)聲明:本文無任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:李勰璘、李筱慧負(fù)責(zé)標(biāo)本檢測(cè);張曉坤負(fù)責(zé)資料收集、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析;論文共同完成。