微量稀釋聯(lián)合平板計數(shù)法評價聚維酮碘抗菌活性及其影響因素

懷文輝 彭開松

摘要 ［目的］建立一種評價聚維酮碘抗菌效果的科學方法，并研究影響其抗菌能力的因素，為聚維酮碘防控水產(chǎn)細菌病提供參考。［方法］采用微量稀釋聯(lián)合平板計數(shù)法（包括標測法和模測法）測定了不同廠商和批次聚維酮碘的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，并評估了孵育溫度、細菌濃度、培養(yǎng)基濃度、pH、貨架期對聚維酮碘最小抑菌濃度的影響。［結(jié)果］標測法測得的聚維酮碘對4株漁源多重耐藥菌的MIC（213～17 g/m3）和MBC（216～19 g/m3）是臨床使用濃度的數(shù)萬倍。模測法測得的聚維酮碘對MH可培養(yǎng)水生菌的MIC（27～11 g/m3）和MBC（29～12 g/m3）是臨床使用濃度的數(shù)百到數(shù)千倍。試驗體系的溫度（5 ℃到35 ℃）越高、細菌濃度（103到108 cfu/mL）越大、培養(yǎng)基濃度（0.082～21 g/L，MH）越大、pH（5.5到9.5）越高，聚維酮碘對細菌的MIC越大。聚維酮碘固態(tài)原粉貨架期為18個月，而聚維酮碘溶液貨架期約3個月。［結(jié)論］聚維酮碘對漁源致病菌和水生MH可培養(yǎng)菌的MIC遠遠高于臨床使用濃度；水溫、pH、培養(yǎng)基濃度、細菌濃度都影響抗菌活性；聚維酮碘固體穩(wěn)定性遠高于其水溶液。

關鍵詞 聚維酮碘；微量稀釋聯(lián)合平板計數(shù)法；最小抑菌濃度；最小殺菌濃度

中圖分類號 S94? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）06-0093-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.021

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Microdilution Combined with Plate Counting Method for Evaluating the Antibacterial Activity of Povidone Iodine and Its Influencing Factors

HUAI Wen-hui1， PENG Kai-song2

（1. Quanjiao County Agricultural and Rural Bureau， Chuzhou， Anhui 239599;2. Lab of Aquatic Health and Fishery Medicine Creation， Department of Fisheries， College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei， Anhui 230036）

Abstract ［Objective］ To establish a scientific method for evaluating the antibacterial effect of povidone iodine （PVP-I） and study the factors affecting its antibacterial ability， providing reference for the prevention and control of aquatic bacterial diseases with PVP-I. ［Method］ This study used a microdilution combined with plate counting method， further divided into standard measurement method and analog measurement method， to determine the minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of PVP-I from different manufacturers and batches. The effects of incubation temperature， bacterial concentration， medium concentration， pH， and shelf life on the minimum inhibitory concentration of PVP-I were evaluated. ［Result］ The MIC （213-17 g/m3） and MBC （216-19 g/m3） of PVP-I against four strains of multidrug-resistant fishing bacteria measured by the calibration method were tens of thousands of times higher than the clinical concentrations used. The MIC （27-11 g/m3） and MBC （29-12 g/m3） of PVP-I on MH cultivable aquatic bacteria measured by the modeling method are hundreds to thousands of times higher than clinical concentrations. The higher the temperature of the experimental system （5 ℃ -35 ℃）， the higher the bacterial concentration （103-108 cfu/mL）， the higher the medium concentration （0.082-21 g/L， MH）， and the higher the pH （5.5-9.5）， the greater the MIC of PVP-I on bacteria. The shelf life of povidone iodine solid raw powder is at least 18 months， and the shelf life of povidone iodine solution is about 3 months. ［Conclusion］ The MIC of PVP-I against pathogenic bacteria from fishing sources and cultivable aquatic MH bacteria is much higher than the clinical use concentration;water temperature， pH， medium concentration， and bacterial concentration all affect antibacterial activity;the solid stability of PVP-I is much higher than its aqueous solution.

Key words Povidone-iodine;Microdilution combined with plate counting method;Minimum inhibitory concentration;Minimum bactericidal concentration

聚維酮碘是廣譜消毒劑，在農(nóng)牧漁業(yè)上的用量占其總量的50%以上。聚維酮碘溶液（水產(chǎn)用）是國家批準的使用最廣泛的水體消毒劑。但是近年來，“聚維酮碘全池潑灑無法防治常見多發(fā)細菌性疾病”的案例越來越多。

聚維酮碘溶液（獸用）和（醫(yī)用）以沖洗（0.1%聚維酮碘）、浸泡（0.5%～1.0%聚維酮碘）和涂抹（5%聚維酮碘）方式使用，聚維酮碘最低使用濃度為1 000 g/m3（以聚維酮碘計）［1］。而聚維酮碘溶液（水產(chǎn)用）全池潑灑使用的最低濃度為0.45 g/m3（以聚維酮碘計）。聚維酮碘消毒最低劑量在獸用和水產(chǎn)用時有2 222倍的差異，成了聚維酮碘溶液（水產(chǎn)用）全池潑灑被質(zhì)疑無效的主要依據(jù)。

聚維酮碘溶液（水產(chǎn)用）的現(xiàn)有藥效評價方法也備受質(zhì)疑?！端a(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物藥效試驗技術指導原則》中采用殺菌率評價消毒劑殺菌效力［2］，該方法中有中和步驟，不符合漁業(yè)水體消毒實踐；且殺菌率結(jié)果無法直接指導臨床用藥劑量。雖然，有不少研究者采用試管二倍比稀釋法測定聚維酮碘對細菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），但關鍵技術參數(shù)并未統(tǒng)一，這必然影響檢測結(jié)果，也導致試驗結(jié)果無法比較［3-10］。

綜上，聚維酮碘溶液（水產(chǎn)用）的使用效果、說明書用量和藥效評價方法，均受到了諸多質(zhì)疑。因此，有必要建立一種更直接的適合水產(chǎn)養(yǎng)殖實際用藥情況的消毒劑藥效定量評價方法。該研究在參考抗生素微量肉湯稀釋法的基礎上，建立了微量稀釋聯(lián)合平板計數(shù)法的新方法，并用于研究聚維酮碘藥效的影響因素，以期為聚維酮碘在水產(chǎn)上的科學使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和消毒劑

以全基因組序列明確的4株多重耐藥性病菌為測試菌，依次為大腸桿菌（Escherichia coli strain E105）（NZ_CP071375.1）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii strain AV040）（CP095841.1）、副炭疽芽孢桿菌（Bacillus paranthracis strain BC006）（NZ_CP119629.1）和貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis strain B14）（CP127164.1），上述菌株分別分離自溫州光唇魚、大口黑鱸、鳊魚和克氏原螯蝦。

10%聚維酮碘溶液（有效碘1%）均采集自安徽省境內(nèi)的養(yǎng)殖場或銷售門店，以廠商和批號為標識，分別為武漢興旺生物技術發(fā)展有限公司（簡稱“興旺”，20211013），武漢中博水產(chǎn)生物技術有限公司（簡稱“中博”，20210802），廣州市和生堂動物藥業(yè)有限公司（簡稱“和生堂”，20210501、20220501、20230305），安徽萬士生物制藥有限公司（簡稱“萬士”，20210415、20220603、20230528），四川佳泰動物藥業(yè)有限公司（簡稱“佳泰”，20220216），廣州金水動物保健品有限公司（簡稱“金水”，20221202），湖南裕翔生物科技有限公司（簡稱“裕翔”，20230109），無錫中水漁藥有限公司（簡稱“中水”，20230327）。陽性對照為藍月亮84消毒液（藍月亮（天津）有限公司，20200807）和仁和醫(yī)用碘伏消毒液（唐派醫(yī)療有限公司，20220602）。聚維酮碘原粉（有效碘10%）為博愛新開源醫(yī)療科技集團股份有限公司生產(chǎn)（20210207）。10%聚維酮碘溶液（均標識為有效碘1%）包括4個獸用制劑（和生堂和佳泰，說明書推薦的最低使用濃度為1 000 g/m3）；其余均為水產(chǎn)用制劑（說明書推薦的最低使用濃度為0.45 g/m3）。

1.2 標準微量稀釋聯(lián)合平板計數(shù)法測定MIC和MBC

參考鄒文騰等［9］的方法，采用標準微量稀釋聯(lián)合平板計數(shù)法（簡稱標測法）進行試驗，步驟如下。在96孔板上，依次布100 μL的滅菌水、布100 μL的聚維酮碘工作液（2n g/m3）并依次2倍比稀釋、布100 μL細菌工作液（MH稀釋的對數(shù)期細菌為1×106～2×106 cfu/mL，并采用平板計數(shù)確定起始細菌濃度），同時設陽性對照（無消毒劑、有測試菌）和陰性對照。96孔板28℃培養(yǎng)16～18 h后，以第1～10列中的清亮孔和渾濁孔分界處清亮孔所對應的消毒劑最低終濃度為MIC。以殺死99.9%供試細菌所需的最低藥物濃度為最小殺菌濃度（MBC）。測定體系起始細菌濃度約為5×105 cfu/mL，在MIC判讀時，MIC孔及以前孔所對應細菌濃度一般不超過108 cfu/mL數(shù)量級；取清亮孔中100 μL樣品涂布MHA平板，28 ℃培養(yǎng)16～18 h，平板上菌落數(shù)不大于50者所對應藥物濃度被判定為MBC。該研究中的MIC和MBC值均取以2為底的對數(shù)，這樣更容易比較MIC和MBC之間的關系。

1.3 標測法評估抽檢聚維酮碘藥效

2021—2023年在安徽省市場上收集10%聚維酮碘溶液，按1.2方法測定MIC和MBC。試驗時樣品應在生產(chǎn)批號后的90天左右，主要是因為出廠期3個月左右的10%聚維酮碘溶液藥效未降低。

1.4 模擬全池潑灑的微量稀釋聯(lián)合平板計數(shù)法測定MIC和MBC

在4～6月，從定遠縣和全椒縣的代表性精養(yǎng)池塘（主養(yǎng)鱸魚、鯽魚、草魚）、非水源水庫、稻蝦田取水樣，4 ℃車載冰箱運送到實驗室后，立刻在“標測法”基礎上改良為“模測法”測定聚維酮碘對MH可培養(yǎng)菌的MIC和MBC。鱸魚池、鯽魚池、水庫、草魚池、稻蝦田的水樣pH分別為8.45、8.43、8.22、8.16和8.23，MH可培養(yǎng)細菌的濃度依次為3.8×106、2.5×105、3.5×105、4.1×104和3.6×103 cfu/mL，水體干物質(zhì)分別為0.12、0.13、0.08、0.08和0.03 g/L。具體步驟為，依次布100 μL水樣水（采用平板計數(shù)確定起始細菌濃度）、布100 μL聚維酮碘工作液（2n g/m3）并依次進行2倍比稀釋，同時設陽性對照（無消毒劑、有滅菌水、水樣和MH）和陰性對照（有滅菌水和MH）。聚維酮碘與水生菌共孵育6 h后，采用MHA進行平板計數(shù)，求各孔細菌濃度。計算BCR=（MIC測定中起始細菌濃度）/（MIC判讀時各孔的細菌濃度）。當10-3

1.5 聚維酮碘MIC的影響因素研究

采用“1.2”的標準測法，評價孵育溫度、起始細菌濃度、培養(yǎng)基濃度、pH、貨架期等對聚維酮碘MIC的影響，試驗使用聚維酮碘濃度為10%。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法可靠性驗證

為了評估該研究所建立方法的可靠性，以醫(yī)用84消毒液和仁和碘伏為陽性對照，測定的MIC值見表1。表1顯示，兩者MIC和MBC的測定值，非常接近說明書推薦的最小使用濃度。這說明該方法可靠，且測得的MIC值和MBC值可供臨床用藥參考。

2.2 抽檢聚維酮碘制劑的MIC和MBC比較

當MBC/MIC ≥ 32，即log2（MBC/MIC）≥ 5時，測試菌對該藥物有耐藥性。由表2數(shù)據(jù)可演算出，log2（MBC/MIC）為2、3、4，可見對常用抗生素有多重耐藥性的4株測試菌對聚維酮碘仍然敏感。

12批次聚維酮碘對4個測試菌株的MIC值在213～217即8 192～131 072 g/m3之間，最大值是最小值的16倍；MBC值在216～219即65 536～524 288 g/m3 之間，最大值是最小值的8倍。同種制劑對不同細菌的MIC值可能相同或相差2倍，而MBC值可能相同或相差2～4倍。

4個獸用樣品，MIC測定值與說明書最低使用濃度比值為8～131；而8個水產(chǎn)用樣品，MIC測定值與說明書最低使用濃度比為18 204～72 818。說明該方法實測水產(chǎn)用聚維酮碘的MIC值是推薦使用最小濃度的數(shù)萬倍。

2.3 模擬聚維酮碘全池潑灑消毒養(yǎng)殖水測定MIC和MBC

由表3可知，4個聚維酮碘殺滅代表性水樣中可培養(yǎng)菌的MIC范圍為27～211即128～2 048 g/m3，MIC測定值與說明書最小使用濃度比值為 284～4 551倍；而MBC范圍為29～212即512～4 096 g/m3，MBC測定值與說明書最小使用濃度比值為 1 138～9 102倍。也就是該方法的實測值是推薦使用最低濃度的數(shù)百到數(shù)千倍。

2.4 影響聚維酮碘MIC的試驗因素

2.4.1 孵育溫度對聚維酮碘MIC的影響。由表4可見，隨著孵育溫度從5 ℃逐漸上升到35 ℃，MIC逐漸呈現(xiàn)升高趨勢，說明在臨床應用中高溫期使用聚維酮碘時，可能需要適當提高濃度，才可能達到預期效果。

2.4.2 載菌量對聚維酮碘MIC的影響。由表5可知，隨著MIC試驗體系中細菌起始終濃度從108 cfu/mL按10倍比遞減到103 cfu/mL，聚維酮碘對2種細菌的MIC均呈現(xiàn)降低趨勢。因此，對水生細菌濃度高的水體，需要更高濃度的聚維酮碘，才能達到相同消毒效果。

2.4.3 MH濃度對聚維酮碘MIC的影響。MH中干物質(zhì)濃度為21 g/L。由表6可知，隨著評價體系中有機物濃度的依次下降，聚維酮碘對細菌的MIC有依次降低的趨勢。

2.3.4

pH對聚維酮碘MIC的影響?！吨腥A人民共和國獸藥典（一部）》中10% PVP-I的pH在3.0～6.5，為合格。由表7可知，隨著評價體系的pH從5.5升高到9.5，MIC值呈上升趨勢。

2.3.5 貨架期與保存形態(tài)對MIC的影響。聚維酮碘溶液更容易失效，而固態(tài)聚維酮碘原粉現(xiàn)用現(xiàn)配，更容易保持藥效。聚維酮碘溶液在出廠后3個月藥效就開始下降；而固態(tài)聚維酮碘藥效可以維持到第18個月（表8）。

3 討論

3.1 方法創(chuàng)新與有效性

前人用“試管二倍比稀釋法結(jié)合平板計數(shù)法”測定聚維酮碘對細菌的MIC和MBC，根據(jù)細菌生長動力學理論推算，有些研究者采用的試驗參數(shù)測定結(jié)果符合MIC和MBC的定義［3-4］；而另一些研究者采用試驗參數(shù)所測得的MIC和MBC值偏大［5-7］。該研究中，標準微量肉湯稀釋聯(lián)合平板計數(shù)法的試驗參數(shù)如下：培養(yǎng)基MH、細菌工作液濃度1×106～2×106 cfu/mL、藥物稀釋液滅菌RO水、28 ℃培養(yǎng)16～18 h。標測法可靠且更適合高通量檢測。

3.2 測定MIC值與臨床使用濃度之間差異的分析

王娜等［4］測得的聚維酮碘對某株菌的 MBC是MIC的2倍；而該研究測得的MBC是MIC的4、8或16倍。這提示臨床分離細菌對聚維酮碘耐藥性增強。 聚維酮碘在低濃度時抑制氣單胞菌生長，高濃度時殺滅細菌［5］，其對 Aeromonas sp． T1-T6、ATCC7966的MIC為125～250 g/m3，MBC為 4 000～8 000 g/m3。高曉華［11］研究顯示，聚維酮碘對 30 株水產(chǎn)致病菌株的MIC為16～1 024 g/m3、MBC為32～4 096 g/m3。 該研究測得的聚維酮碘對漁源病原菌的MIC和MBC比前人［3，5，11］測定結(jié)果高很多。

前人和該研究結(jié)果均顯示，測定的聚維酮碘對漁源細菌的MIC和MBC均比水產(chǎn)全池潑灑用最低濃度（0.45 g/m3）高數(shù)百倍到數(shù)萬倍。聚維酮碘（水產(chǎn)用）全池潑灑推薦濃度為0.45～0.75 g/m3，可能并不是從消毒效果角度考慮，而是從聚維酮碘對水生環(huán)境和水生動物的安全角度考慮。高曉華［11］研究后認為，聚維酮碘在水產(chǎn)養(yǎng)殖上使用的安全濃度不宜超過1.344 g/m3。熊斌［12］研究顯示，聚維酮碘對海水（水溫30 ℃，pH 8.0，海水比重1.024）養(yǎng)殖南美白對蝦仔蝦（1.2 cm，7.7 mg）的安全濃度為0.515 mg/L。

3.3 影響聚維酮碘MIC的因素剖析

何寶時等［13-14］的研究結(jié)果顯示，溫度越低、pH越低，聚維酮碘穩(wěn)定性越好，這能解釋試驗溫度越低、pH越低，測得的MIC值越小。陳璇等［3］采用無菌水、NB和2倍NB稀釋聚維酮碘開展試驗，結(jié)果顯示，有效碘濃度隨培養(yǎng)基濃度升高而降低，說明有機物含量越高對有效碘的中和效果越強，導致其消毒效果越差。該研究結(jié)果還顯示，聚維酮碘固體的貨架期約18個月，比液態(tài)的聚維酮碘溶液的貨架期（3個月）要長很多，說明固態(tài)更有利于保持抗菌活性。

4 結(jié)論

水產(chǎn)上聚維酮碘全池潑灑推薦使用濃度0.45～0.75 g/m3，主要不是基于其抗菌活性，而是考慮對水生動物和水環(huán)境的安全性。水產(chǎn)病原菌對聚維酮碘的耐藥性有增加趨勢。溫度越高、pH越高、有機物濃度越高、細菌濃度越高，聚維酮碘對細菌的MIC越高，其抗菌活性越差。聚維酮碘粉末比其水溶液的貨架期更長。

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