低溫環(huán)境下野外自然好氧堆肥理化特征及微生物群落結(jié)構(gòu)變化

曾橋 施春陽(yáng) 李俊 李祥 張璐璐

摘要 ［目的］研究低溫環(huán)境下野外自然好氧堆肥理化特征及微生物群落結(jié)構(gòu)變化，實(shí)現(xiàn)低溫季節(jié)養(yǎng)殖廢棄物的資源化利用。［方法］以豬糞和稻殼為原料在低溫環(huán)境下進(jìn)行自然好氧堆肥處理，對(duì)堆肥過程中溫度、pH、含水率、NH+4-N、NO-3-N和種子發(fā)芽指數(shù)（GI）進(jìn)行分析，選取細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū)和真菌ITS序列進(jìn)行高通量測(cè)序，比較好氧堆肥過程中不同階段微生物群落多樣性及組成差異。［結(jié)果］當(dāng)環(huán)境溫度為-6.7～6.4 ℃時(shí)，整個(gè)堆肥過程高溫階段持續(xù)11 d，經(jīng)過38 d的好氧堆肥處理，堆體含水率、pH、NH+4-N、NO-3-N等指標(biāo)均趨于穩(wěn)定，堆肥結(jié)束時(shí)GI達(dá)到了122.12%，表明堆肥產(chǎn)品完全腐熟。低溫條件下堆肥不同階段樣本微生物群落分析表明，Acinetobacter是堆肥初期和升溫階段優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，而Pseudofulvimonas和Ensifer在堆肥高溫階段豐度最高，Parapedobacter為堆肥末期優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。Ascobolus是堆肥初期優(yōu)勢(shì)真菌屬，而Mycothermus為好氧堆肥升溫、高溫和腐熟階段的優(yōu)勢(shì)菌群。細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝等是堆肥過程中細(xì)菌的主要代謝功能。理化指標(biāo)與微生物多樣性相關(guān)性分析表明，堆肥過程中pH與屬水平上豐度較高的微生物相關(guān)性強(qiáng)，含水率、溫度、NH+4-N和發(fā)芽指數(shù)次之。［結(jié)論］低溫條件下野外自然好氧堆肥可順利進(jìn)行并完全腐熟，這為低溫環(huán)境下野外自然好氧堆肥提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞 好氧堆肥；低溫環(huán)境；理化特征；高通量測(cè)序；群落結(jié)構(gòu)；功能預(yù)測(cè)

中圖分類號(hào) X713? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2024）06-0051-09

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.013

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Changes of Physico-chemical Characteristics and Microbial Community Structure During Natural Aerobic Composting Under Low Temperature Environment in the Field

ZENG Qiao1，2， SHI Chun-yang1，2， LI Jun3 et al

（1.School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science&Technology，Xian，Shaanxi 710021;2.Shaanxi Research Institute of Agricultural Products Processing Technology， Xian，Shaanxi 710021;3.Xian Agricultural Technology Extension Center，Xian，Shaanxi 710061）

Abstract ［Objective］To study the changes of physico-chemical characteristics and microbial community structure during natural aerobic composting under low temperature in the field，realize the resource utilization of breeding waste in low temperature season.［Method］Using pig manure and rice husk as raw materials for aerobic composting in the field， the temperature， pH， water content， NH+4-N， NO-3-N and germination index （GI） of seeds during composting process were analyzed， the bacterial 16S rDNA V3-V4 region and fungal ITS region were further selected for high-throughput sequencing.The diversity and composition of microbial communities in different stages of aerobic composting process were compared.［Result］When the environmental temperature was -6.7-6.4 ℃， the high-temperature stage of the entire composting process lasted for 11 days. After 38 days of aerobic composting treatment，the moisture content， pH， NH+4-N， NO-3-N and other indicators of the pile tended to be stable. At the end of composting， the GI reached 122.12%， indicating that the compost product was completely decomposed.The analysis of microbial communities in samples from different stages of composting under low temperature conditions showed that Acinetobacter was the dominant bacterial genus in the early and heating stages of composting， Pseudofulvimonas and Ensifer had the highest abundance in the high temperature stage of composting， and Parapedactor was the dominant bacterial genus in the late stage of composting. Ascobolus was the dominant fungal genus in the early stages of composting， while Mycothermus was the dominant microbial community in the heating， high temperature and maturation stages of aerobic composting.The predicted results of bacterial community function showed that amino acid transport and metabolism，carbohydrate transport and metabolism et al were the main metabolic functions of bacteria in composting process.The correlation analysis between physicochemical indexes and microbial diversity showed that the pH and genus abundance were highly correlated， followed by water content， temperature， NH+4-N and GI.［Conclusion］Natural aerobic compost can be carried out smoothly and completely decomposed in the field under low temperature conditions，it provide a basi for natural aerobic composting in the field under low temperature environment.

Key words Aerobic composting;Low temperature;Physico-chemical characteristics;High-throughput sequencing;Community structure;Function prediction

近年來，隨著我國(guó)人民生活水平的提高，對(duì)肉蛋奶等畜禽產(chǎn)品的需求量不斷增長(zhǎng)，畜禽養(yǎng)殖業(yè)朝著集約化、工廠化、規(guī)?；较蜓杆侔l(fā)展，從而導(dǎo)致畜禽糞便的排放量不斷增加。我國(guó)是世界上最大的畜禽養(yǎng)殖國(guó)，每年產(chǎn)生的畜禽糞便廢棄物高達(dá)40億t［1］，而規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)中有90%以上都缺乏必要的糞污治理措施，農(nóng)村也存在大量未經(jīng)處理的畜禽糞便被隨意處置和排放的現(xiàn)象，這不僅浪費(fèi)了大量的養(yǎng)分資源，而且給環(huán)境帶來了極大的壓力。

好氧堆肥處理是實(shí)現(xiàn)畜禽糞便無害化和資源化利用的一個(gè)重要途徑，經(jīng)過好氧堆肥處理，其發(fā)酵產(chǎn)物施用于土壤不僅可以增加土壤肥力，提高土壤保水、透氣的能力，還可以調(diào)節(jié)土壤中微生物菌群種類和數(shù)量，從而改善土壤結(jié)構(gòu)，推進(jìn)農(nóng)業(yè)提質(zhì)增效，同時(shí)避免了畜禽糞便低質(zhì)量處理所導(dǎo)致的環(huán)境問題。野外自然好氧堆肥堆體適中，易于操作，不需要額外添加菌劑，適用于農(nóng)村較為分散的農(nóng)戶對(duì)在畜禽養(yǎng)殖和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄物進(jìn)行資源化利用。環(huán)境溫度對(duì)好氧堆肥進(jìn)程有較大的影響，環(huán)境溫度高，堆肥過程啟動(dòng)快，堆肥效率也較高。我國(guó)地域遼闊，北方地區(qū)冬季時(shí)間長(zhǎng)，溫度低，但是有關(guān)低溫環(huán)境下的野外自然好氧堆肥研究報(bào)道較少。

好氧堆肥的實(shí)質(zhì)是利用微生物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)轉(zhuǎn)化畜禽糞便中的有機(jī)物為無機(jī)物和穩(wěn)定的腐殖質(zhì)的過程［2］，微生物群落的代謝能力和菌群結(jié)構(gòu)是影響好氧堆肥效果的關(guān)鍵因素［3］。堆肥過程中參與的微生物數(shù)量龐大，種類繁多，作用復(fù)雜，由于絕大部分微生物難以實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)，因此，無法采用傳統(tǒng)方法對(duì)其進(jìn)行分離和鑒定。近年來，高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于堆肥環(huán)境中微生物多樣性分析，該技術(shù)可檢測(cè)到樣本中傳統(tǒng)純培養(yǎng)不能發(fā)現(xiàn)的低豐度微生物菌群，有助于更加全面準(zhǔn)確地揭示環(huán)境中微生物群落的復(fù)雜度和多樣性［4］。該研究選取豬糞和稻殼作為堆肥原料，在冬季低溫條件下采用好氧堆肥工藝，研究野外堆肥過程中主要理化參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化，并對(duì)堆肥過程中微生物群落變化進(jìn)行分析，從而深入了解低溫環(huán)境下堆肥過程中微生物群落的變化規(guī)律，為開發(fā)適宜農(nóng)村分散的小堆體畜禽糞便冬季自然好氧堆肥化利用提供依據(jù)，從而促進(jìn)畜禽糞便的資源化利用。

1 材料與方法

1.1 材料來源

新鮮豬糞取自興平市星光良種豬繁養(yǎng)殖有限公司，稻殼購(gòu)自湖北京和米業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 好氧堆肥試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

試驗(yàn)在冬季進(jìn)行，環(huán)境溫度為-6.7～6.4 ℃，試驗(yàn)地點(diǎn)為陜西西安。

將稻殼粉碎，過12目篩，按一定比例與新鮮豬糞混合均勻，調(diào)節(jié)碳氮比為30左右，調(diào)節(jié)堆體含水量為60%左右，堆體為圓錐體。每3 d翻堆1次，進(jìn)入降溫階段后，每7 d翻堆1次，進(jìn)入腐熟期停止翻堆，整個(gè)堆肥周期為38 d。

1.2.2 采樣方法。

從堆制0 d起，每2 d于堆體內(nèi)部分別距離底部30 cm處和距離外部15～30 cm處的截面上多點(diǎn)共取混合樣品500 g（鮮重），樣品混勻后，采用四分法取樣，樣品分為兩份，一份用于測(cè)定理化指標(biāo)，另一份貯存于-20 ℃冰箱備用。同時(shí)，于堆肥的0、4、10、16、38 d分別取樣，編號(hào)依次為1、2、3、4、5，貯存于-80 ℃冰箱用于高通量測(cè)序。

1.2.3 理化指標(biāo)分析。

采用自動(dòng)溫度記錄儀測(cè)定堆體溫度，將溫度記錄儀探頭插入堆體距離底部30 cm處和距離外部15～30 cm處的截面上隨機(jī)排布5個(gè)點(diǎn)，取平均溫度作為堆體實(shí)際溫度。取適量樣品于105 ℃下干燥至恒重，計(jì)算含水率。pH采用pH計(jì)測(cè)定。

硝態(tài)氮（NO-3-N）按NY/T 1116—2014規(guī)定的方法測(cè)定。

銨態(tài)氮（NH+4-N）采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定［5］。

種子發(fā)芽指數(shù)：取新鮮堆肥樣品3 g加入30 mL去離子水中，置于水平搖床上振蕩2 h后過濾，吸取濾液5 mL，加到鋪有濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中。每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)點(diǎn)播20粒顆粒飽滿的小白菜種子，置于培養(yǎng)箱中于28 ℃培養(yǎng)，避光培養(yǎng)3 d，以去離子水作對(duì)照，按下式計(jì)算發(fā)芽指數(shù)［6］：

GI=（A×B）/（C×D）×100%（1）

式中：A為堆肥浸提液種子發(fā)芽率；B為堆肥浸提液種子根長(zhǎng)；C為蒸餾水種子發(fā)芽率；D為蒸餾水種子根長(zhǎng)。

1.2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析。

1.2.4.1 DNA的提取。

樣品DNA采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒（OMEGA，美國(guó)）按操作流程進(jìn)行提取。

1.2.4.2 16S rDNA和ITS序列高通量測(cè)序。

采用特異性引物341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）、805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）對(duì)細(xì)菌16S rDNA 基因的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用特異性引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）、ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）對(duì)真菌ITS rDNA基因的ITS1～I(xiàn)TS2區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR初次擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR二次擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，5個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。進(jìn)一步對(duì)DNA進(jìn)行純化，利用Qubit3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA 精確定量，等量混合后送生工生物工程（上海）股份有限公司基于Illumina平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

理化指標(biāo)測(cè)定相關(guān)試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果均采用Graph Pad Prism軟件進(jìn)行處理。高通量測(cè)序序列結(jié)果采用QIIME進(jìn)行分析。序列質(zhì)控過程將堿基平均質(zhì)量低于20以及片段長(zhǎng)度低于200 bp 的序列刪除［7］，同時(shí)，將含有模糊堿基的序列也進(jìn)行刪除。采用“join paired ends.py”命令對(duì)兩端測(cè)序序列進(jìn)行拼接。采用USEARCH61（Edgar 2010）比對(duì) SILVA和UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行嵌合體去除［8-9］。對(duì)去噪后序列采用QIIME進(jìn)行多樣性分析，在97%的水平上進(jìn)行分類操作單元（OTU）聚類［10］，并分別與SILVA和UNITE進(jìn)行比對(duì)，確定微生物的分類信息?；赪eighted UniFrac采用“beta diversity through plots.py”在QIIME中進(jìn)行主成分分析（PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 好氧堆肥過程中溫度的變化

從圖1可以看出，整個(gè)堆肥過程環(huán)境溫度為-6.7～6.4 ℃，堆體溫度在6 d時(shí)達(dá)到50.7 ℃，在10 d時(shí)達(dá)到峰值54.3 ℃，至15 d開始，堆體溫度逐步下降，至17 d時(shí)，堆體溫度下降至50 ℃以下，且下降較快；從25 d起，堆體溫度下降緩慢，并逐步穩(wěn)定。整個(gè)堆肥過程由于溫度的不同明顯分為3個(gè)階段，0～5 d為升溫階段，6～16 d為高溫階段，17～38 d為降溫腐熟階段。該試驗(yàn)堆肥初期堆體升溫較慢，且堆體最高溫度較相關(guān)報(bào)道［11］的溫度低，可能的原因包括一方面此次堆肥試驗(yàn)在冬季進(jìn)行，環(huán)境溫度較低，進(jìn)而造成堆體溫度也較低；另一方面，該試驗(yàn)為自然堆肥，未添加外源菌劑，因此啟動(dòng)較慢。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，整個(gè)堆肥過程中，堆體溫度在50 ℃以上維持了11 d，符合國(guó)家《糞便無害化衛(wèi)生要求》（GB 7959—2012）規(guī)定，達(dá)到了畜禽糞便無害化處理的要求，說明自然好氧堆肥在冬季較低環(huán)境溫度下可以順利進(jìn)行。

2.2 好氧堆肥過程中含水率和pH的變化

有文獻(xiàn)報(bào)道，合適的堆肥初始含水率為50%～60%［12］。水分對(duì)于堆肥過程中微生物的生長(zhǎng)繁殖過程必不可少，一方面，堆肥物料中的營(yíng)養(yǎng)成分溶解于水中被微生物生長(zhǎng)和代謝所利用，另一方面，堆肥過程中由于微生物的作用，堆體溫度逐步升高，水分的蒸發(fā)有利于調(diào)節(jié)堆體溫度，從而保證堆肥進(jìn)程的順利進(jìn)行。由圖2可知，堆肥初始含水率為58.69%，隨著堆肥過程的進(jìn)行，含水率逐步降低，至20 d，含水率降至47.27%；從22 d 起，含水率下降速率大大降低，至38 d，含水率為43.90%，整個(gè)過程堆肥含水率下降了14.79百分點(diǎn)。該試驗(yàn)含水率下降較慢，且堆肥結(jié)束時(shí)產(chǎn)品含水率也較高，這與張?zhí)N琦等［13］采用牛糞和水稻秸稈在低溫下進(jìn)行好氧堆肥的研究結(jié)果一致，主要是由于堆肥過程在冬季進(jìn)行，環(huán)境溫度較低，因此，堆體水分蒸發(fā)較慢，從而導(dǎo)致產(chǎn)品含水率較高。好氧堆肥過程中pH從初始的7.02逐步上升至8.10，從6 d起，pH逐步下降，至16 d，pH逐步穩(wěn)定，至堆肥結(jié)束時(shí)，pH為7.86。在堆肥前期，堆體pH迅速上升，這可能是由于堆體溫度上升，大量有機(jī)質(zhì)被分解產(chǎn)生了大量NH+4-N；而隨著堆肥的進(jìn)行，堆肥過程中產(chǎn)生的NH3大量揮發(fā)，以及微生物發(fā)酵產(chǎn)生了有機(jī)酸，從而使得堆體pH略下降，至堆肥結(jié)束，堆體逐步穩(wěn)定，pH也趨于穩(wěn)定?？傮w來看，冬季低溫環(huán)境下堆肥pH變化較其他季節(jié)溫和，這是由于在氣溫相對(duì)較高的季節(jié)微生物繁殖旺盛，堆肥過程相對(duì)劇烈。

2.3 好氧堆肥過程中NO-3-N、NH+4-N的變化

從圖3可以看出，NH+4-N含量從堆肥開始明顯上升，至4 d達(dá)到最大值，總體來說，NH+4-N含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，這是由于隨著堆肥的進(jìn)行，溫度逐漸升高，微生物活動(dòng)加劇，同時(shí)由于礦化作用，因而產(chǎn)生了大量的NH+4-N。然而進(jìn)入高溫階段后，由于溫度的升高以及翻堆，促使NH+4-N以NH3釋放出來，從而造成NH+4-N含量的下降。與圖1對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，NH+4-N含量的最高點(diǎn)在堆肥進(jìn)入高溫階段前出現(xiàn)，這說明相關(guān)微生物在堆肥升溫階段已經(jīng)開始大量生長(zhǎng)和代謝，并通過脫氨作用將NH3釋放，從而使得NH+4-N上升。NO-3-N變化趨勢(shì)與NH+4-N完全相反，堆肥初期，NO-3-N含量先下降，而后逐漸上升，至20 d，NO-3-N含量達(dá)到峰值，此后NO-3-N含量緩慢下降并逐步保持穩(wěn)定。堆肥過程中NO-3-N含量的變化與硝化細(xì)菌的活性密切相關(guān)［14］，高溫對(duì)硝化細(xì)菌的活性有一定的抑制作用，因此，NO-3-N含量的峰值較堆肥高溫階段滯后。至堆肥結(jié)束，NO-3-N和NH+4-N含量比值接近1，說明在低溫環(huán)境下進(jìn)行的好氧堆肥已經(jīng)達(dá)到腐熟。

2.4 好氧堆肥過程中發(fā)芽指數(shù)的變化

堆肥腐熟度是評(píng)價(jià)堆肥質(zhì)量的重要指標(biāo)，未腐熟的堆肥含有大量對(duì)植物種子有毒害作用的小分子有機(jī)物、NH3、揮發(fā)性脂肪酸和酚酸等［15］，從而抑制種子的生長(zhǎng)。發(fā)芽指數(shù)是通過檢驗(yàn)堆肥浸提液對(duì)植物種子發(fā)芽是否產(chǎn)生抑制作用來評(píng)價(jià)堆肥無害化、穩(wěn)定化程度的指標(biāo)，但是目前對(duì)于種子發(fā)芽指數(shù)達(dá)到多少表明堆肥已經(jīng)腐熟，目前還尚需進(jìn)一步研究確定。有研究認(rèn)為，種子發(fā)芽指數(shù)大于50%則可以認(rèn)為堆肥已達(dá)腐熟［16］，一般達(dá)到80%時(shí)，可認(rèn)為堆肥已經(jīng)完全腐熟［17］，也有學(xué)者認(rèn)為，發(fā)芽指數(shù)達(dá)到110%是評(píng)價(jià)堆肥腐熟的較為合適的指標(biāo)［18］。從圖4可以看出，在堆肥結(jié)束的38 d，種子發(fā)芽指數(shù)達(dá)到了122.12%。此外，NO-3-N/NH+4-N接近1，同時(shí)溫度、含水率、pH等指標(biāo)均趨于穩(wěn)定，可以判斷低溫環(huán)境下的野外自然堆肥產(chǎn)品完全腐熟，這為冬季低溫環(huán)境下堆肥提供了依據(jù)。

2.5 低溫環(huán)境下堆肥微生物群落組成分析

2.5.1 堆肥不同階段樣本α多樣性分析。

α多樣性可以反映微生物群落的豐度和多樣性，Chao指數(shù)和Ace指數(shù)越大，說明微生物群落豐富度越高；Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數(shù)越大，說明群落多樣性越低；Coverage指數(shù)實(shí)際反映了測(cè)序結(jié)果是否代表樣本的真實(shí)情況，其數(shù)值越高，則樣本中序列沒有被測(cè)出的概率越低［19］。堆肥各階段樣品細(xì)菌和真菌群落α多樣性分析結(jié)果見圖5，從圖5可以看出，Coverage指數(shù)均在0.93以上，說明測(cè)序結(jié)果能較真實(shí)地反映樣品中微生物群落［20］；由Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可知，細(xì)菌和真菌群落豐富度變化趨勢(shì)一致，均呈下降—上升—下降—上升。由Shannon指數(shù)可知，細(xì)菌群落多樣性在升溫和高溫階段呈逐步上升趨勢(shì)，高溫階段末期和腐熟階段呈下降趨勢(shì)；而真菌群落多樣性在升溫階段先上升，至高溫階段下降，在高溫末期則又上升，腐熟階段多樣性下降。α多樣性分析表明，豬糞堆肥樣品的微生物多樣性初期和升溫階段是最豐富的，而田偉［18］以牛糞為原料堆肥時(shí)，腐熟后的堆肥樣品中的微生物多樣性最豐富，說明不同的氮源對(duì)微生物多樣性有較大影響。

2.5.2 堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)。

2.5.2.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

從圖6可以看出，Acinetobacter是堆肥初期優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，其豐度為65.91%，其次豐度較高的細(xì)菌屬為Pseudomonas、Psychrobacter、Devosia、Brevundimonas、Comamonas，其豐度為1.19%～9.74%。隨著堆肥的進(jìn)行，堆體溫度逐漸升高，在升溫階段，Acinetobacter豐度下降至33.2%，但仍為豐度最高的細(xì)菌屬，Devosia、Leadbetterella、Pseudomonas、Brevundimonas、Stenotrophomonas、Comamonas、Gemmobacter等為豐度次之的細(xì)菌屬，其豐度為1.65%～8.40%。隨著堆肥進(jìn)入高溫階段，Acinetobacter的豐度迅速下降至1.54%，Pseudofulvimonas豐度最高，達(dá)19.95%，Ensifer豐度次之，為4.25%，Verrucomicrobium的豐度為3.76%，其余豐度較高的細(xì)菌屬為Devosia、Luteimonas、Pseudoxanthomonas、Parapedobacter、Solibacillus、Kofleria、Povalibacter等，其豐度為1.84%～2.88%。高溫階段末期，Pseudofulvimonas、Ensifer、Parapedobacter、Gp6、Luteimonas豐度均略有升高，累計(jì)豐度達(dá)37.47%；Verrucomicrobium豐度略有下降，為2.38%；Bordetella、Devosia、Povalibacter、Pseudoxanthomonas的豐度為1.76%～2.27%；Parapedobacter為堆肥末期優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，豐度為12.37%，Pseudofulvimonas、Pseudomonas、Luteimonas、Rhodanobacter、Phaselicystis、Arachidicoccus、Ensifer等豐度為1.69%～3.43%。

從圖6b可以發(fā)現(xiàn)，整個(gè)好氧堆肥過程中，總體豐度較高的細(xì)菌屬分別為Acinetobacter、Pseudofulvimonas、Parapedobacter、Pseudomonas、Devosia、Ensifer、Luteimonas、Verrucomicrobium和Gp6等，它們是堆肥過程中主要的細(xì)菌屬。Acinetobacter主導(dǎo)升溫階段，Pseudofulvimonas主導(dǎo)高溫階段和降溫階段，Parapedobacter主導(dǎo)腐熟階段。

2.5.2.2 真菌群落組成。

從圖7a可以看出堆肥過程中真菌群落在屬水平上的分布，Ascobolus是堆肥初期優(yōu)勢(shì)真菌屬，其豐度為18.53%，其次為Verticillium，豐度為6.65%，其余豐度在1.00%以上的真菌屬包括Alternaria、Papiliotrema。在堆肥升溫階段，真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較為明顯的變化，Ascobolus豐度下降很快，下降幅度達(dá)84%，但仍然為升溫階段豐度較高的真菌屬，其余豐度較高的包括Arthrographis、Fusarium、Anthopsis、Cystofilobasidium、Cryptococcus、Alternaria等，其豐度為0.36%～2.02%。隨著堆肥過程的進(jìn)行，Mycothermus成為好氧堆肥高溫階段的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，其豐度為72.75%，Anthopsis豐度略高于升溫階段，達(dá)到3.48%，其余豐度較高的分別為Candida、Aspergillus、Verticillium、Ascobolus、Mortierella等，豐度為0.32%～0.80%。高溫階段后期，Mycothermus豐度略有下降，但仍然為優(yōu)勢(shì)菌群，Anthopsis豐度上升至4.94%，Verticillium、Candida、Aspergillus、Alternaria、Archaeorhizomyces、Mortierella、Ascobolus等豐度為0.46%～1.66%。在堆肥腐熟階段，Mycothermus豐度進(jìn)一步下降，但仍然為優(yōu)勢(shì)菌群，至好氧堆肥末期，其豐度下降至45.10%；Mortierella豐度上升較快至3.80%，Chrysosporium、Myceliophthora、Verticillium、Aspergillus等豐度為0.39%～0.72%。

從圖7b可以發(fā)現(xiàn)，好氧堆肥過程中，總體豐度較高的真菌屬為Mycothermus、Ascobolus、Anthopsis、Verticillium、Mortierella等，其中Ascobolus是堆肥初期和升溫階段主導(dǎo)真菌屬，Mycothermus主導(dǎo)高溫階段、降溫和腐熟階段。

2.5.3 堆肥不同階段樣本PCA和OTU分析。

基于細(xì)菌門水平相對(duì)豐度PCA分析結(jié)果（圖8a）表明，PCA1和PCA2的主要貢獻(xiàn)之和為90%，表明在這2個(gè)維度上能夠反映樣本的實(shí)際情況。從圖8a可以看出，在堆肥過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，不同階段樣本發(fā)生了明顯的分離，其中樣本3和樣本4距離較近，說明菌群結(jié)構(gòu)相似。這可能是由于樣本3和樣本4分別為堆肥第10天和第16天，堆體溫度差異不大，因而菌群結(jié)構(gòu)也較相似，隨著堆肥逐步進(jìn)入腐熟階段，堆體溫度下降較快，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化也較大。利用Venn圖研究不同階段樣品中細(xì)菌分布的變化，結(jié)果如圖8b所示，5個(gè)樣本中共檢出16 511個(gè)OTUs，其中僅114個(gè)OTUs是共有的，占總OTUs數(shù)目的0.69%。其中，堆肥初期樣本中特有OTUs數(shù)目為3 103個(gè)，占總OTUs數(shù)目的18.79%；升溫階段樣本中特有OTUs數(shù)目為3 183個(gè)，占總OTUs數(shù)目的19.28%；高溫期和高溫末期特有的OTUs數(shù)目分別為2 898和2 642個(gè)，分別占總OTUs數(shù)目的17.55%和16.00%；堆肥末期樣本中特有OTUs數(shù)目為3 679個(gè)，占總OTUs數(shù)目的22.28%。堆肥各不同階段樣本中特有OTUs數(shù)目總計(jì)15 505個(gè)，共占總OTUs數(shù)目的93.90%。該結(jié)果表明，在低溫環(huán)境下好氧堆肥不同階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。

基于真菌門水平相對(duì)豐度PCA分析結(jié)果（圖9a）表明，PCA1和PCA2的主要貢獻(xiàn)之和為88%，表明在這2個(gè)維度上能夠反映樣本的實(shí)際情況。從圖9a可以看出，在堆肥過程中真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，不同階段樣本發(fā)生了明顯的分離，其中樣本3和樣本4距離較近，說明菌群結(jié)構(gòu)相似。這可能是由于樣本3和樣本4分別為堆肥第10天和第16天，堆體溫度差異不大，因而菌群結(jié)構(gòu)也較相似，隨著堆肥逐步進(jìn)入腐熟階段，堆體溫度下降較快真菌群落結(jié)構(gòu)變化也較大。利用Venn圖研究不同階段樣品中真菌分布的變化，結(jié)果如圖9b所示，5個(gè)樣本中共檢出3 498個(gè)OTUs，其中26個(gè)OTUs是共有的，占總OTUs數(shù)目的0.74%，堆肥初期、升溫階段、高溫期、高溫末期、堆肥末期樣本中特有OTUs數(shù)目分別為584、436、691、603和734個(gè)，共占總OTUs數(shù)目的87.14%。該結(jié)果表明，在低溫環(huán)境下好氧堆肥不同階段真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。

2.5.4 堆肥過程中細(xì)菌群落功能變化。

從圖10可以看出，在好氧堆肥初期，細(xì)菌菌群對(duì)應(yīng)的主要功能為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（amino acid transport and metabolism），轉(zhuǎn)錄（transcription），能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化（energy production and conversion），翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和合成（translation，ribosomal structure and biogenesis），細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞殼的合成（Cell wall/membrane/envelope biogenesis），無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（inorganic ion transport and metabolism）等。而在升溫階段，主要功能為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，轉(zhuǎn)錄，能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化，碳水化合物運(yùn)輸和代謝（carbohydrate transport and metabolism），細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞殼的合成，無機(jī)離子代謝，信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制（singal transduction mechanisms），翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和合成等。高溫和降溫階段，細(xì)菌菌群主要代謝功能與升溫階段類似。總體來看，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝等是堆肥過程中細(xì)菌的主要代謝功能，堆肥原料中豐富的纖維素、蛋白質(zhì)、脂肪等通過氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝所產(chǎn)生的氨基酸、大分子糖類、多酚、多肽等是腐殖酸合成的前體物質(zhì)，具有促進(jìn)腐殖酸合成和提高腐殖酸產(chǎn)量及分子量的作用，從而加快堆肥進(jìn)程和促進(jìn)堆肥的腐熟［21-22］。

2.6 微生物多樣性與理化指標(biāo)相關(guān)性分析

將堆肥過程中理化指標(biāo)與豐度較高的細(xì)菌屬和真菌屬進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表1所示。pH與Acinetobacter、Pseudomonas、Luteimonas、Pseudoxanthomonas、Ascobolus、Verticillium、Anthopsis高度相關(guān)（|r|>0.8），且與Acinetobacter、Ascobolus和Verticillium呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與Luteimonas呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；含水率與Acinetobacter、Pseudofulvimonas、Pseudoxanthomonas、Parapedobacter、Povalibacter、Verticillium、Anthopsis、Mycothermus高度相關(guān)（|r|>0.8），其中與Anthopsis呈顯著負(fù)相關(guān)（P<005）；溫度與Acinetobacter、Pseudofulvimonas、Pseudoxanthomonas、Parapedobacter、Povalibacter、Mycothermus高度相關(guān)（|r|>0.8），與Parapedobacter呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與Mycothermus則呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；NH+4-N與Pseudofulvimonas、Pseudoxanthomonas、Parapedobacter、Povalibacter、Verticillium、Anthopsis、Mycothermus高度相關(guān)（|r|>0.8），與Pseudoxanthomonas呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與Anthopsis呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；NO-3-N除與Pseudoxanthomonas高度相關(guān)外，與其他屬微生物相關(guān)性較弱；發(fā)芽指數(shù)與Acinetobacter、Pseudofulvimonas、Pseudoxanthomonas、Parapedobacter、Povalibacter、Anthopsis、Mycothermus高度相關(guān)（|r|>0.8），與Anthopsis呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。

3 結(jié)論

（1）低溫環(huán)境下野外自然好氧堆肥啟動(dòng)慢，高溫階段溫度相對(duì)較低，但經(jīng)過38 d好氧堆肥過程，堆體各項(xiàng)理化特征指標(biāo)趨于穩(wěn)定，種子發(fā)芽指數(shù)達(dá)到了122.12%，說明低溫環(huán)境下堆肥樣品可以達(dá)到腐熟。

（2）堆肥升溫階段細(xì)菌和真菌多樣性較為豐富，細(xì)菌和真菌多樣性變化存在一定差異。堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，細(xì)菌屬水平上優(yōu)勢(shì)菌群隨著堆肥過程的進(jìn)行而發(fā)生改變，但真菌屬水平上優(yōu)勢(shì)菌群在進(jìn)入高溫階段后至堆肥結(jié)束主要為Mycothermus。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝等是堆肥過程中細(xì)菌的主要代謝功能，它們加快了堆肥的進(jìn)程和促進(jìn)了堆肥的腐熟。

（3）理化指標(biāo)與微生物多樣性相關(guān)性分析表明，堆體pH、含水率、溫度、NH+4-N和發(fā)芽指數(shù)等因素與多種屬水平上豐度較高的微生物存在顯著相關(guān)性（P<0.05），而NO-3-N與屬水平上主要菌群相關(guān)性均不顯著（P>0.05）。

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