高效氟氯氰菊酯降解菌的分離與降解特性研究

張婧一 彭清忠 易浪波

摘要 ［目的］篩選降解高效氟氯氰菊酯（β-CF）的微生物菌種資源，并研究其降解特性。［方法］利用梯度壓力馴化法，從曾使用擬除蟲菊酯類殺蟲劑的土壤中富集篩選降解β-CF的候選菌株，通過形態(tài)學(xué)和基于16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定其分類地位，采用單因素試驗研究菌株對β-CF的耐受性和降解特性。［結(jié)果］篩選獲得1株以β-CF為唯一碳源生長、環(huán)境適應(yīng)能力強的細(xì)菌GM4，經(jīng)鑒定該菌為嗜油不動桿菌（Acinetobacter oleivorans）。菌株GM4對β-CF的耐受濃度可以達到600 mg/L，在初始濃度50 mg/L、pH 8.0、接菌量10%、溫度28 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，對β-CF降解率為99.44%。［結(jié)論］菌株GM4能高效降解β-CF，是環(huán)境中β-CF類農(nóng)藥殘留生物修復(fù)的優(yōu)良種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞 高效氟氯氰菊酯；降解菌；分離；耐受性；降解特性

中圖分類號 X 172? 文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）06-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.001

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Isolation and Degradation Performance of a Beta-cyfluthrin-degrading Strain

ZHANG Jing-yi，PENG Qing-zhong，YI Lang-bo

（School of Biological Resources and Environmental Sciences，Jishou University，Jishou，Hunan 416000）

Abstract ［Objective］To screen the highly efficient degradation strains of beta-cyfluthrin （β-CF），and study their degradation characteristics.［Method］Gradient pressure acclimation was used to enrich and screen candidate strains for degradating β-CF from soil that had been used pyrethroids，and the taxonomic status was identified by morphological characteristics and phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence.The tolerance and degradation characteristics of candidate strains to β-CF were investigated by single-factor experiments.［Result］A dominant strain GM4 with strong environmental adaptability was obtained by screening，and the strain was identified as Acinetobacter oleivorans.The tolerance concentration of strain GM4 to β-CF could reach 600 mg/L，and the degradation rate of β-CF was 99.44% after the initial concentration of 50 mg/L，pH 8.0，inoculation amount of 10%，and temperature of 28 °C for 48 h.［Conclusion］The GM4 strain can efficiently degrade β-CF，which is an excellent germplasm resource for the bioremediation of pesticide residues of β-CF in the environment.

Key words Beta-cyfluthrin;Degrading strain;Isolation;Tolerance;Degradation characteristic

農(nóng)藥作為重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，在減少農(nóng)作物損失、保障糧食產(chǎn)量安全上貢獻巨大［1］。中華人民共和國國家統(tǒng)計局資料顯示，2019年我國使用農(nóng)藥總計137.19萬t［2］。擬除蟲菊酯是通過模仿天然除蟲菊素化學(xué)結(jié)構(gòu)人工合成的一類殺蟲劑［3-4］，具有高效、殺蟲譜廣等特點，在我國西北和華北等地廣泛應(yīng)用，其產(chǎn)量占據(jù)全球農(nóng)藥類總產(chǎn)量的20%［5］。高效氟氯氰菊酯（beta-cyfluthrin，簡稱β-CF）是新一代 Ⅱ 型含α-氰基的高效廣譜擬除蟲菊酯類殺蟲劑［6］，作為應(yīng)用最廣泛的菊酯類殺蟲劑之一，主要用來防治蚜蟲、薊馬等害蟲，同時能兼治蜱螨［7］。但是 Ⅱ 型菊酯農(nóng)藥普遍具有光、熱穩(wěn)定等特點，在環(huán)境中半衰期較長，自然環(huán)境條件下很難降解，在固相、液相、氣相中的循環(huán)易引發(fā)環(huán)境中農(nóng)藥的殘留，2009—2011年的一份研究報告表明，美國北卡羅來納州50名成年人的782份固體食物中氟氯氰菊酯的檢出率達6%［8］；2017—2019年對北京大興區(qū)主產(chǎn)水果農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀監(jiān)測，主要殘留的菊酯類農(nóng)藥包括氟氯氰菊酯，且在葡萄和西瓜的使用最為廣泛［9］。研究表明，水中濃度為10 ng/L的β-CF等菊酯類農(nóng)藥就可殺死全部無脊椎生物［10］，同時也會對非目標(biāo)靶性生物如家蠶、蜜蜂等益蟲造成影響［11］。β-CF等菊酯類農(nóng)藥含有鹵素基團具有脂溶性，易被人體呼吸道和胃腸道吸收［12］，對人與哺乳動物具有神經(jīng)毒性［5］、生殖毒性和免疫毒性［13-14］等。越來越多的研究證明其對生態(tài)環(huán)境和人類健康具有較高的潛在風(fēng)險。2020年7月歐盟發(fā)布了β-CF的正式禁用公告［15］。

微生物降解作為一種安全、有效的農(nóng)藥殘留消除手段，逐漸成為農(nóng)藥環(huán)境污染的主要修復(fù)方式。研究表明環(huán)境中蘊藏著很多能夠降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的細(xì)菌、真菌等微生物，如Bhatt等［16］從廣西某農(nóng)藥廠排污口污泥中分離獲得1株鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas trueperi），在30 ℃、pH 7.0條件下培養(yǎng)96 h，對100 mg/L的丙烯菊酯降解效率達93%；王若瑜等［17］從發(fā)酵大曲中分離到的玫瑰紅紅球菌（Rhodococcus rhodochrous），其對質(zhì)量濃度為5 mg/L的氯氟氰菊酯降解率可達71.44%；陳銳等［18］從土壤中分離得到1株高效分解菊酯類農(nóng)藥的微生物菌株SSCL-3，經(jīng)鑒定該菌為米曲霉（Aspergillus oryzae），該菌在無機鹽培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)24 h，對500 mg/L 高效氯氰菊酯的降解率可達88.9%。目前，關(guān)于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解菌的篩選和農(nóng)藥殘留的生物修復(fù)主要集中在聯(lián)苯菊酯［19］、丙烯菊酯、氯氰菊酯等老牌菊酯類農(nóng)藥，對β-CF這類高活性新型菊酯類農(nóng)藥降解菌的研究較少，急需發(fā)掘降解這類新型菊酯類農(nóng)藥殘留的微生物資源?；诖?，該研究以β-CF為唯一碳源，從使用過擬除蟲菊酯農(nóng)藥的果園、耕地土壤中富集分離降解β-CF的細(xì)菌，通過形態(tài)特征和16S rRNA基因序列分析進行鑒定，并研究其降解特性，旨在為β-CF等擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留的生物修復(fù)積累種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗試劑。β-CF原藥（純度95%）購自廣東立威化工有限公司；β-CF標(biāo)準(zhǔn)品購自北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院；甲醇（色譜級）和丙酮（分析純）購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；TaqDNA聚合酶與各種限制性內(nèi)切酶均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。試驗用水為Milli-Q超純水。

1.1.2 試驗儀器。Applied Biosystems MiniAmp PCR儀（中國賽默飛世爾科技有限公司）；Eppendorf Centrifuge 5424離心機（德國艾本德股份公司）；T6紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；Eyela-1100真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社）；IS-RDV1恒溫振蕩培養(yǎng)箱（美國精騏有限公司）。

1.1.3 樣品。

樣品采自湖南省永順縣曾使用擬除蟲菊酯類蟲劑的果園和耕地（28°54′11″N，110°4′12″E），共收集土壤樣本6份，于無菌袋中密封，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 培養(yǎng)基。LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母膏5 g、pH 7.0，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃，滅菌20 min；固體培養(yǎng)基中加入15 g的瓊脂。富集培養(yǎng)基：NaCl 2.0 g、NH4NO3 5.0 g、K2HPO4 1.0 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、酵母膏1.0 g、pH 7.0，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃，滅菌20 min，添加β-CF丙酮母液至最終濃度依次為100、200、300、400和500 mg/L。液體選擇培養(yǎng)基：NaCl 2.0 g、NH4NO3 5.0 g、K2HPO4 1.0 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、pH 7.0，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃，滅菌20 min，添加β-CF丙酮母液至最終濃度為500 mg/L；固體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 β-CF降解菌的富集與分離。

稱取土樣10 g加入裝有90 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，于28 ℃、150 r/min 振蕩2 h，靜置30 min，取上清液，按1%接菌量（體積比）接種至含100 mg/L β-CF農(nóng)藥的富集培養(yǎng)基中，恒溫振蕩（28 ℃，150 r/min）培養(yǎng)5 d，轉(zhuǎn)接至β-CF濃度提高100 mg/L的新鮮富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5 d，如此馴化，直至β-CF濃度提高至500 mg/L時振蕩培養(yǎng)5 d，馴化結(jié)束。

按1%接菌量取馴化液接種至β-CF為唯一碳源的液體選擇培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，轉(zhuǎn)接2次，取50 μL培養(yǎng)液涂布在固體選擇培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，待菌落長出，選取不同形態(tài)特征的單菌落，四分體劃線純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接3次。對篩選出的優(yōu)勢菌株置于20%的甘油管中于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離菌株的形態(tài)觀察與分子鑒定。

1.2.2.1 菌株的形態(tài)觀察。

取單菌落在LB固體培養(yǎng)基和固體選擇培養(yǎng)基上劃線，于28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況和形態(tài)特征。收集純化后的新鮮菌體至1.5 mL EP管中，用0.9%的NaCl溶液漂洗菌體2～3次，5 000 r/min離心3 min，去上清后加入1 mL濃度為2.5%的戊二醛溶液，輕搖充分混勻，重懸菌液，置于4 ℃冰箱過夜固定，待鏡檢。

1.2.2.2 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析。

使用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取分離菌株基因組DNA，以其為模板，采用16S rRNA基因通用引物（PA5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；PB5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′）PCR擴增目的片段，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性2.5 min，95 ℃變性15 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

將獲得的16S rRNA基因片段（序列長度約1 500 bp）測定結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，在數(shù)據(jù)庫中下載關(guān)系密切的菌株16S rRNA基因序列，使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法（neighbor-joining）進行聚類分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.3 降解菌對β-CF的耐受性測定。

挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基，于28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，取10 mL 對數(shù)生長期菌液，5 000 r/min離心5 min后棄上清，加無菌水10 mL重懸，重復(fù)3次，制備OD600為2.0的菌懸液，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將菌懸液按2％接菌量（體積比）接種至β-CF濃度分別為0、300、600、900和1 200 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，每12 h取樣測定菌液OD600值，試驗設(shè)置3組平行。

1.2.4 環(huán)境因子對菌株生長和β-CF降解的影響。

取OD600為2.0的菌懸液接種至β-CF為唯一碳源的100 mL液體選擇培養(yǎng)基中，于150 r/min振蕩培養(yǎng)，分別考察β-CF初始濃度（50、100、200、300和400 mg/L）、溫度（20、24、28、32和36 ℃）、接菌量（1%、3%、5%、10%、15%）和pH（5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）對菌株生長和β-CF降解的影響，每個因素設(shè)3組平行，試驗結(jié)束后取樣測定菌液OD600值和β-CF濃度，根據(jù)β-CF濃度變化計算降解率。

β-CF降解率=（C0x-Cx）/C0x×100%

式中：C0x為第x小時時相應(yīng)空白樣品中β-CF濃度（mg/L）；Cx為第x小時樣品中β-CF濃度（mg/L）。

1.2.5 β-CF濃度檢測。

收集各發(fā)酵菌液于5 000 r/min下離心5 min，上清液轉(zhuǎn)至250 mL燒瓶，菌體用10 mL無水乙醇重懸，離心收集上清液，轉(zhuǎn)入燒瓶，重復(fù)3次合并溶液，于56 ℃負(fù)壓旋轉(zhuǎn)蒸干，加入丙酮溶解，定容至25 mL，樣品經(jīng)0.45 μm有機系微孔濾膜過濾，高效液相色譜測定β-CF濃度。對照處理同上。

β-CF檢測條件：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（0.5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相為水∶甲醇=20∶80，等度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，進樣量20 μL，柱溫30 ℃，采用外標(biāo)法定量。

1.3 統(tǒng)計分析

運用Origin 2021制圖，采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差（ANOVA）分析，多重比較采用圖基檢驗（Tukey test）。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-CF降解菌的分離與鑒定

經(jīng)過馴化和富集，分離獲得1株能以β-CF為唯一碳源生長的菌株，編號GM4。菌株GM4在以β-CF為唯一碳源的固體選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h發(fā)現(xiàn)，菌落細(xì)小，呈淡黃色，圓形、邊緣規(guī)則，不透明（圖1A）；接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后觀察，菌落直徑2.5～3.0 mm，乳白色，圓形、邊緣規(guī)則，不透明（圖1B）；掃描電鏡下菌體呈球桿狀，單個排列，大小約為（0.3～0.5）μm×（0.5～0.7）μm（圖1C）。

提取菌株GM4的基因組DNA，PCR擴增獲得16S rRNA基因片段。經(jīng)測序和比對分析，利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，菌株GM4和嗜油不動桿菌DR1（Acinetobater oleivorans DR1）聚為一支，其與Acinetobater oleivorans DR1的16S rRNA基因序列同源性高達99.99%。結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，鑒定該菌株為嗜油不動桿菌（Acinetobater oleivorans）。

2.2 菌株GM4對β-CF的耐受性測定

菌株GM4對β-CF的耐受性如圖3所示。由圖3可知，對照組（0 mg/L的β-CF）中菌株GM4的生長規(guī)律符合細(xì)菌的典型生長曲線；在β-CF濃度為300 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，菌株GM4快速進入對數(shù)生長期，36 h后菌液OD600值達到最大，為2.705，對數(shù)期后的穩(wěn)定期長達52 h，表現(xiàn)對β-CF較強的適應(yīng)性；在β-CF濃度為600 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，菌體生長呈現(xiàn)出與β-CF濃度為300 mg/L時相似的生長模式，但遲滯期較長，12 h后菌株快速增殖，48 h菌液OD600值最大，為2.756，較對照組最大OD600略高。在營養(yǎng)條件充足時，菌株能耐受較高濃度的β-CF脅迫，生長良好，且低濃度的β-CF（β-CF≤600 mg/L）脅迫對菌株的生長具有促進作用，但當(dāng)β-CF濃度為900和1 200 mg/L時，菌株幾乎不生長，高濃度β-CF抑制菌體繁殖，對菌株毒害作用明顯。

52卷6期張婧一等 高效氟氯氰菊酯降解菌的分離與降解特性研究

2.3 菌株GM4降解β-CF特性研究

2.3.1 β-CF初始濃度對菌株GM4降解β-CF的影響。

從圖4可以看出，在β-CF初始濃度為50～200 mg/L，初始濃度越大，菌株GM4對β-CF的降解率越低。當(dāng)β-CF濃度為50 mg/L時，48 h最大降解率為79.91%；當(dāng)β-CF濃度為200 mg/L時，菌株對β-CF的降解率達最低（39.83%），與底物濃度為100 mg/L時相比差異顯著（P＜0.05），當(dāng)β-CF濃度為300 mg/L時，菌株對β-CF的降解率有小幅上升，達到47.65%，與底物濃度為200 mg/L時相比差異顯著（P＜0.05），隨后降解率下降至38.81%，與底物濃度為200mg/L時相比差異不顯著（P>0.05）。隨著農(nóng)藥濃度的增加，菌株GM4生物量（OD600）呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)β-CF濃度為100 mg/L 時，菌株生物量最大，隨后生物量降低，高濃度β-CF對菌株生長有抑制作用，不外加碳源情況下，菌株GM4對β-CF脅迫更敏感。

2.3.2 溫度對菌株GM4降解β-CF的影響。

從圖5可以看出，在20、24和36 ℃下培養(yǎng)，菌株GM4對β-CF的降解率之間沒有顯著差異；當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時，降解率最高，達95.61%，當(dāng)培養(yǎng)溫度為32 ℃時降解率次之，兩者相比差異顯著（P＜0.05）。菌株生物量（OD600）隨溫度升高呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時，菌株生物量最大，菌液OD600為1.294。

2.3.3 接菌量對菌株GM4降解β-CF的影響。

從圖6可以看出，當(dāng)菌株GM4接菌量在1%～10%時，菌株生物量和降解β-CF的能力隨接菌量的增大而提高，當(dāng)菌株GM4接菌量為1%時，降解率僅為65.11%，菌液OD600為0.810；當(dāng)接菌量為10%時，降解率達最高（98.37%），菌液OD600最高（1.331），與接菌量為1%時降解率相比差異顯著（P＜0.05）；接種量為15%時與接菌量10%相比，菌株對β-CF降解率差異不顯著（P>0.05）。營養(yǎng)物質(zhì)充足的情況下，接菌量越大，菌體就會產(chǎn)生更多相關(guān)的代謝物質(zhì)，從而加快β-CF的降解。但當(dāng)接菌量為15%時，菌株的生長受到抑制，可能是由于接種量加大，微生物生長所需碳源不足，從而限制了菌株生長。因此，菌株GM4降解β-CF的最佳接菌量為10%。

2.3.4 pH對菌株GM4降解β-CF的影響。

從圖7可以看出，在培養(yǎng)基pH為5.0～9.0時，菌株GM4的生物量（OD600）隨pH的升高持續(xù)升高后趨于平穩(wěn)，當(dāng)pH為8.0和9.0時，菌株生長較好，當(dāng)pH為8.0時，菌液OD600最高，為1.646。菌株對β-CF的降解率在中性和偏堿性條件下（pH為7.0、8.0、9.0）較之酸性條件（pH為5.0、6.0）更高，兩者相比差異顯著（P＜0.05），堿性條件更有利于菌株生長，也更有利于菌株對β-CF的利用。當(dāng)pH為8.0時，菌株對β-CF降解率達到最高，為99.44%。當(dāng)pH為5.0時，菌株對β-CF降解率為93.08%，與pH為6.0時相比，降解率差異不顯著（P>0.05）?？赡苁且驗棣?CF在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下更易水解，進而易被菌株利用所致。

3 結(jié)論與討論

3.1 環(huán)境中存在降解β-CF的微生物菌種資源

國內(nèi)外關(guān)于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥生物修復(fù)的報道甚多，但主要集中在結(jié)構(gòu)較簡單的菊酯類農(nóng)藥（如聯(lián)苯菊酯、丙烯菊酯和氯氰菊酯等）降解菌的篩選和降解特性研究，關(guān)于含復(fù)雜官能團如α-氰基的新型二代高活性擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的微生物降解報道較少。β-CF作為一類疏水性和脂溶性較強的新型二代農(nóng)藥，易被油滴、土壤顆粒等吸附，田間應(yīng)用時常無遮蔽噴灑或用于種子處理，因此在土壤表層和地下水中分布極廣［20-21］，目前β-CF降解菌的報道主要涉及一些真菌［如黑曲霉（Aspergillus niger）、綠色木霉（Trichoderma viride）［22］］和少數(shù)細(xì)菌［如無色桿菌（Achromobacter.sp）［23］和假單胞菌（Pseudomonas.sp）［24］］。該研究通過富集馴化篩選獲得1株以β-CF為唯一碳源生長的細(xì)菌GM4，經(jīng)初步鑒定為嗜油不動桿菌（Acinetobater oleivorans），迄今為首次報道。菌株GM4對β-CF的耐受濃度可以達到600 mg/L，在初始濃度50 mg/L、pH 8.0、接菌量10%、溫度28 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，對β-CF降解率為99.44%；該菌株的篩選豐富了β-CF降解菌的種質(zhì)資源。周婷等［25］曾從受石油污染的土壤中篩選獲得嗜油不動桿菌（Acinetobater oleivorans），該菌對4 g/L原油的降解率為42.15%。李彬等［26］研究發(fā)現(xiàn)嗜油不動桿菌（Acinetobater oleivorans）對污水中的亞硝酸鹽具有良好的去除效果。研究表明嗜油不動桿菌在農(nóng)藥、原油和無機化合物等污染物降解轉(zhuǎn)化方面展現(xiàn)出較強的功能，在被污染的土壤和污水等環(huán)境的生物修復(fù)中具有很大的應(yīng)用潛力。

3.2 菌株GM4具有高效降解β-CF的能力

菌株GM4在底物濃度為50～400 mg/L、溫度20～36 ℃、接菌量1%～15%、pH 5.0～9.0的條件下生長良好，這與周婷等［25］對石油降解菌嗜油不動桿菌（Acinetobater oleivorans）的生長情況研究結(jié)果基本一致。在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中，該菌能耐受600 mg/L β-CF脅迫且生長良好；在β-CF為唯一碳源培養(yǎng)基中，底物濃度為400 mg/L條件下亦可正常生長，表明菌株GM4具有較強的環(huán)境適應(yīng)性。通過優(yōu)化降解條件發(fā)現(xiàn)，菌株GM4在含50 mg/L的β-CF培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h對β-CF的降解率可達99.44%。陳少華等［23］從農(nóng)藥廠排污口分離得到的一株高效降解菌P-01，初步鑒定為無色桿菌屬（Achromobacter sp.），在最佳條件下，該菌株培養(yǎng)7 d對50 mg/L β-CF的降解率為85.1%；Saikia等［24］從生產(chǎn)β-CF的農(nóng)藥工廠附近的土壤樣品中，分離得到一株施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）在8 d 內(nèi)對50 mg/L的β-CF的降解率為94%，但該菌株對β-CF降解不夠徹底，轉(zhuǎn)化代謝產(chǎn)物依然含有苯環(huán)；衛(wèi)正等［27］分離的中間蒼白桿菌（Ochrobactrum intermedium）在5 d內(nèi)對初始濃度為100、200、300和400 mg/L的氟氯氰菊酯的降解率分別為84.5%、54.7%、40.0%和30.5%。總體來看，菌株GM4降解周期較短，降解效率較高，是一株修復(fù)環(huán)境中β-CF類農(nóng)藥殘留污染的優(yōu)良種質(zhì)資源。

3.3 菌株GM4降解β-CF的機理有待深入研究

目前有關(guān)微生物降解β-CF的詳細(xì)機制仍然不清楚，一般認(rèn)為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解的關(guān)鍵首先是酯鍵的斷裂［28］，還有研究表明菊酯類農(nóng)藥的徹底降解涉及苯酚羥化酶、鄰苯二酚1，2-雙加氧酶和原兒茶酸3，4-雙加氧酶［29］，梁俊仕等［30］對不動桿菌Acinetobacter sp.4-D降解關(guān)鍵酶基因d34進行克隆表達，經(jīng)同源比對和酶活驗證，證實該基因編碼酶為鄰苯二酚雙加氧酶；Zhao等［31］在探究蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus GM-01代謝β-氯氰菊酯的機理過程中還發(fā)現(xiàn)了苯甲酸代謝通路和鄰苯二酚2，3-雙加氧酶代謝通路的相關(guān)蛋白顯著上調(diào)。因此，為了實現(xiàn)利用微生物資源對β-CF類農(nóng)藥殘留污染的環(huán)境修復(fù)，有必要從分子水平揭示菌株GM4降解β-CF的分子機理，并結(jié)合功能基因信息推測β-CF的生物轉(zhuǎn)化路徑，才能全面闡明微生物降解β-CF的代謝機制。

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