長鏈非編碼RNA IGF2BP2-AS1通過調控miR-375表達對喉癌細胞遷移及增殖的影響

王挺 張楊 郭潔 范崇盛 劉亞芳

1鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，洛陽 471000；2吉林大學第一醫(yī)院腫瘤科，長春 130061

喉癌是全球常見的咽喉部惡性腫瘤，其發(fā)病通常較隱匿，確診時可能已發(fā)生轉移［1-2］。喉癌的發(fā)生和發(fā)展涉及多種基因、多種信號通路的改變，特別是表觀遺傳基因的表達異常［3］。因此，探究喉癌發(fā)生發(fā)展的基因調控機制，有助于尋找新的治療靶點。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類內(nèi)源性小分子RNA，參與調控染色質的結構變化、基因轉錄、基因翻譯過程［4-6］。lncRNA 作為一種非編碼RNA，被證實在喉癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤中異常表達，與腫瘤細胞的分化、放化療敏感度以及患者預后密切相關［7-10］。胰島素樣生長因子2 mRNA 結合蛋白2（IGF2BP2）-AS1 是新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，其在多種腫瘤（如膀胱癌、口腔鱗狀細胞癌等）中高表達，表現(xiàn)為明顯的癌基因功能［11-12］。IGF2BP2-AS1在喉癌細胞中的表達及對喉癌細胞的調控機制 并 不 清 楚 。本 研 究 以 IGF2BP2-AS1/微RNA-375（miR-375）軸為切入點，探究IGF2BP2-AS1 對喉癌細胞增殖、遷移的影響及分子機制，以期為喉癌的診療提供新策略。

材料與方法

研究時間為2022年1月至2023年11月，研究地點為鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院中心實驗室，研究類型為基礎研究。

1.細胞系和主要試劑

支氣管上皮細胞系16HBE 和喉癌細胞系AMC-NH-8、TU159、TU138、TU686 購自北京索萊寶科技有限公司。胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司。陰性對照RNA 和IGF2BP2-AS1 小干擾RNA 購自武漢益普生物科技有限公司。miR-375、miR-NC 購自上海恒斐生物科技有限公司。Lipofectamine 3000、CCK-8 試劑盒購自美國Invitrogen公司。SYBR試劑盒、雙熒光素酶活性試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。雙熒光素酶載體購自北京智杰方遠科技有限公司。兔源N-鈣黏著蛋白（N-Cadherin）、叉頭框蛋白C2（FOXC2）、β 肌動蛋白（β-actin）、CDK2、細胞周期蛋白A（Cyclin A）一抗抗體購自美國Sigma公司。

2.細胞培養(yǎng)和分組

恒溫箱參數(shù)設置為37 ℃、5%CO2，AMC-NH-8、TU159、16HBE、TU138、TU686 均用含12%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的TU686 細胞接種在12 孔板，TU686 細胞分為si-NC 組和si-IGF2BP2-AS1 組，分別采用Lipofectamine 3000 轉染試劑將陰性對照RNA 和IGF2BP2-AS1 小干擾RNA 轉染到TU686 細胞，轉染45 h后進行后續(xù)實驗。

3.實時熒光定量PCR（qPCR）檢測細胞中IGF2BP2-AS1、miR-375表達

采用Trizol法提取各細胞系的總RNA，進一步反轉錄為cRNA。按照SYBR 試劑盒說明書設置qPCR 反應體系，以GAPDH 為內(nèi)參比較IGF2BP2-AS1 表達量，以U6 為內(nèi)參比較miR-375 表達量，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算IGF2BP2-AS1、miR-375相對表達量。

表1 qPCR引物序列

4.CCK-8 法檢測敲降IGF2BP2-AS1 后TU686 細胞的增殖能力

收集轉染后的各組TU686 細胞，分別以3×103個/孔接種于96孔板，在恒溫箱內(nèi)持續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4、5 d。每天固定時間分別向各孔加40 μl的CCK-8試劑，恒溫箱內(nèi)處理2 h。采用全自動酶標儀測量各孔TU686細胞在450 nm處的吸光度（OD）值。

5.劃痕愈合實驗檢測敲降IGF2BP2-AS1后TU686細胞的遷移能力

收集轉染后的各組TU686 細胞，用含15%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸。調整細胞密度后，分別將TU686 細胞加入24孔板，培養(yǎng)24 h。PBS溶液清洗3次，用10 μl移液槍吸頭在24 孔板底劃痕，PBS 溶液清洗3 次，加入1 ml 不含胎牛血清的培養(yǎng)基，在光學顯微鏡下觀察、拍照，測量劃痕寬度P1。培養(yǎng)24 h 后，PBS 溶液清洗3 次，加入1 ml 不含胎牛血清的培養(yǎng)基，在光學顯微鏡下觀察、拍照，測量劃痕寬度P2。TU686細胞劃痕愈合率=（P1-P2）/P1×100%。

6.雙熒光素酶報告基因實驗驗證IGF2BP2-AS1 與miR-375的靶向

分別構建IGF2BP2-AS1 野生型質粒IGF2BP2-AS1-Wt和突變型質粒IGF2BP2-AS1-Mut，采用Lipofectamine 3000 試劑分別將IGF2BP2-AS1-Wt、IGF2BP2-AS1-Mut 與miR-NC 或miR-375 轉染到TU686 細胞。轉染45 h，利用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測TU686細胞的海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性，分析各組TU686 細胞的熒光素酶活性。

7.Western blotting 檢測TU686 細胞中N-Cadherin、FOXC2、CDK2、Cyclin A蛋白表達

采用RIPA 裂解液提取轉染后TU686 細胞的總蛋白，蛋白變性后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉到硝酸纖維素膜，經(jīng)10%牛血清白蛋白封閉50 min。加入一抗N-Cadherin（1∶2 000 稀釋）、FOXC2（1∶3 000 稀釋）、CDK2（1∶4 000 稀釋）、β-actin（1∶4 000 稀釋）、Cyclin A（1∶4 000 稀釋），在4℃孵育8 h。經(jīng)TBST 溶液清洗后，加入二抗羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）抗體（1∶7 000稀釋），在25 ℃孵育50 min。經(jīng)TBST 溶液清洗后，采用化學發(fā)光法曝光并顯影。

8.統(tǒng)計學方法

所有實驗均獨立重復4 次。用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，用GraphPad 7.0軟件繪圖。呈正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1.IGF2BP2-AS1在喉癌各細胞系中的表達

qPCR 檢測顯示（圖1），與16HBE 細胞相比，喉癌細胞AMC-NH-8、TU159、TU138、TU686 中IGF2BP2-AS1 呈高表達（F=37.42，P＜0.01），其中以TU686細胞中IGF2BP2-AS1表達最高（P＜0.01）。因此，后續(xù)以TU686細胞為研究。

圖1 IGF2BP2-AS1在支氣管上皮細胞系16HBE和喉癌細胞系AMC-NH-8、TU159、TU138、TU686中的表達量

2.IGF2BP2-AS1小干擾RNA的敲降效率

qPCR檢測顯示，si-NC組和si-IGF2BP2-AS1組TU686細胞中IGF2BP2-AS1 表達分別為（7.25±0.22）和（1.02±0.30），si-IGF2BP2-AS1 組TU686 細胞中IGF2BP2-AS1 表達低于si-NC組（t=16.79，P＜0.01），提示IGF2BP2-AS1 小干擾RNA敲降成功。

3.敲降IGF2BP2-AS1后TU686細胞遷移情況

劃痕愈合實驗顯示，si-NC 組和si-IGF2BP2-AS1 組TU686 細胞劃痕愈合率分別為（65.08±3.82）% 和（28.16±6.13）%，si-IGF2BP2-AS1 組細胞劃痕愈合率低于si-NC組（t=5.11，P＜0.01）。

4.敲降IGF2BP2-AS1后TU686細胞增殖情況

CCK-8 結果顯示（圖2），在鋪板后第2、3、4、5 天si-IGF2BP2-AS1 組TU686 細胞增殖能力均低于si-NC 組（t=3.83、3.17、3.02、6.31，均P＜0.01）。

圖2 敲降IGF2BP2-AS1對喉癌細胞TU686增殖的影響

5.IGF2BP2-AS1與miR-375的靶向關系

采用LncRNome在線軟件預測顯示（圖3），IGF2BP2-AS1與miR-375存在結合位點，miR-375可能是IGF2BP2-AS1靶基因。雙熒光素酶報告基因檢測顯示（圖4），IGF2BP2-AS1-Wt中，miR-375 組相對熒光素酶活性低于miR-NC 組（t=8.95，P＜0.01）；IGF2BP2-AS1-Mut中，miR-NC組與miR-375組熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.74，P＞0.05）。

圖3 IGF2BP2-AS1與miR-375的靶向結合位點

圖4 雙熒光素酶報告基因實驗驗證IGF2BP2-AS1 與miR-375的靶向關系

6.敲降IGF2BP2-AS1對miR-375表達的影響

si-NC 組和 si-IGF2BP2-AS1 組 TU686 細胞中miR-375 表達分別為（1.02±0.40）和（4.95±0.49），si-IGF2BP2-AS1 組TU686 細胞中miR-375 表達高于si-NC組（t=6.23，P＜0.01）。

7.敲降IGF2BP2-AS1后TU686細胞中遷移及增殖蛋白表達情況

Western blotting 顯示（圖5），敲降IGF2BP2-AS1 表達后的TU686 細胞中遷移蛋白N-Cadherin、FOXC2 表達與增殖蛋白CDK2、Cyclin A表達均低于si-NC組。

圖5 敲降IGF2BP2-AS1 對喉癌細胞TU686 中遷移蛋白和增殖蛋白表達的影響

討論

研究顯示，lncRNA 廣泛參與調控細胞的各種生命過程，如凋亡、代謝、遷移［13-16］。喉癌細胞中存在多種lncRNA的異常表達，lncRNA 已成為喉癌診斷的生物標志物以及治療的分子靶點［17-19］。Lu 等［20］研究顯示，喉癌組織和細胞系中l(wèi)ncRNA ZFAS1表達高于癌旁組織和正常鼻咽上皮細胞，高表達的lncRNA ZFAS1 與患者淋巴結轉移、臨床分期相關，lncRNA ZFAS1 可促進喉癌細胞增殖、侵襲以及N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達，并抑制E-鈣粘蛋白表達。Wan 等［21］研究顯示，lncRNA SNHG16 在喉癌組織和細胞系中表達上調，其通過調節(jié)miR-140-5p/Wnt/β-catenin 通路軸促進喉癌的發(fā)生發(fā)展。IGF2BP2-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種促癌性lncRNA［11］。Tong 等［12］研究表明，與正常組織樣本相比，口腔鱗狀細胞癌中IGF2BP2-AS1 表達上調，且IGF2BP 2-AS1 高表達與口腔鱗狀細胞癌患者的較差生存率相關；IGF2BP2-AS1 主要定位在細胞質中，其下調能夠抑制細胞增殖和遷移，導致細胞周期停滯和細胞凋亡。目前，IGF2BP2-AS1對喉癌細胞調控的功能尚不清楚。

本研究證實，IGF2BP2-AS1在喉癌細胞系中高表達，提示IGF2BP2-AS1 可能參與調控喉癌的發(fā)生和進展。沉默IGF2BP2-AS1 表達后，喉癌TU686 細胞增殖和遷移能力均受到限制，說明IGF2BP2-AS1可能是喉癌治療的潛在靶點。lncRNA 可發(fā)揮競爭性RNA 作用，以海綿吸附的方式降低miRNA 的表達，從而影響腫瘤細胞的各種生物過程［22-25］。例如，lncRNA NEAT1 可以通過功能性海綿miR-577 和miR-1224-5p 促進喉癌細胞的增殖，并抑制細胞凋亡［26］。本研究采用生物信息學軟件LncRNome 分析顯示，IGF2BP2-AS1 的核苷酸序列與miR-375 具有互補位點。miR-375 在結直腸癌、胃癌、膀胱癌等惡性腫瘤中低表達，能抑制腫瘤細胞的細胞周期、轉移以及生長［27-29］。Dai等［30］研究顯示，miR-375 在喉癌組織和細胞系中表達下調，過表達miR-375 明顯抑制喉癌細胞的增殖、細胞周期和遷移能力。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗證實IGF2BP2-AS1 靶向結合miR-375。在TU686 細胞中，敲降IGF2BP2-AS1 后，miR-375 表達增高，進一步證實miR-375和IGF2BP2-AS1存在負向調控關系。

綜上所述，IGF2BP2-AS1 在喉癌細胞系中呈高表達，IGF2BP2-AS1通過海綿吸附miR-375可影響喉癌細胞的遷移及增殖，IGF2BP2-AS1 的研究可為喉癌診斷和靶向治療提供新的靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明王挺：研究設計與實施、文章撰寫；張楊、郭潔：數(shù)據(jù)采集；范崇盛：研究設計、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱；劉亞芳：統(tǒng)計分析、指導