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    非小細(xì)胞肺癌組織中CLCA4的表達(dá)情況及與病理和預(yù)后的關(guān)系

    2024-04-02 13:42:50吳媛媛劉科齊艷麗童小華
    關(guān)鍵詞:激酶肺癌病理

    吳媛媛 劉科 齊艷麗 童小華

    1商洛市中心醫(yī)院病理科,商洛 726000;2商洛市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,商洛 726000

    非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常見(jiàn)的肺癌類型,占85%以上[1-3]。盡管近年來(lái)針對(duì)NSCLC的診療技術(shù)不斷進(jìn)步,但該疾病的發(fā)病率和病死率仍居高不下。因此,尋找新的治療靶點(diǎn)和標(biāo)志物對(duì)于NSCLC 的診療及預(yù)后評(píng)估至關(guān)重要。鈣激活的氯離子通道A 4(calcium-activated chloride channel regulator 4,CLCA4)是一種離子通道調(diào)節(jié)蛋白,在人體中廣泛分布,并參與多種生理過(guò)程[4]。CLCA4 可通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號(hào)通路(PI3K/AKT)、Janus 激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3(JAK2/STAT3)等腫瘤細(xì)胞增殖的信號(hào)途徑,介導(dǎo)結(jié)直腸癌的病理改變[5-6]。而PI3K/AKT、JAK2/STAT3 等腫瘤信號(hào)作為NSCLC 病理進(jìn)展的關(guān)鍵信號(hào)途徑,部分學(xué)者認(rèn)為CLCA4的表達(dá)與NSCLC 的病理進(jìn)展及預(yù)后存在關(guān)聯(lián)[4]。然而,目前對(duì)于CLCA4 在NSCLC 中的作用和機(jī)制研究資料有限,能否成為NSCLC 新的治療靶點(diǎn)尚待驗(yàn)證[5]?;诖?,本文旨在探討CLCA4 在NSCLC 組織中的表達(dá)情況,并研究其與病理及預(yù)后的關(guān)系,為NSCLC 的診療及預(yù)后評(píng)估提供新的思路和策略。

    資料與方法

    1.一般資料

    前瞻性選取商洛市中心醫(yī)院2019年4月至2022年4月收治的106 例NSCLC 患者進(jìn)行研究。(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合肺癌的臨床診斷[7],術(shù)前經(jīng)病理穿刺活檢確診;②符合手術(shù)指征,均行NSCLC根治性切除術(shù),術(shù)后留存病理組織送常規(guī)病理。美國(guó)麻醉師醫(yī)學(xué)會(huì)分級(jí)I~Ⅱ級(jí);③TNM 分期Ⅱ~ⅢA 期;④卡氏健康評(píng)分>65 分;⑤年齡>18 歲;⑥患者家屬均簽署知情同意書(shū)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①轉(zhuǎn)移癌;②NSCLC 復(fù)發(fā);③肝、腎功能衰竭;④合并其他呼吸道急性感染;⑤心腦血管急癥治療期;⑥妊娠期、哺乳期女性;⑦病歷資料缺失或不接受隨訪。

    本研究通過(guò)商洛市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào):2019-001)。

    2.研究方法

    術(shù)后收集患者的臨床資料,采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)癌組織及癌旁正常組織中CLCA4的表達(dá)情況。

    2.1.資料收集 人口學(xué)資料包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙、肺癌家族史;病理資料包括組織類型、分化程度、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

    2.2.CLCA4 陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)病理組織中CLCA4 陽(yáng)性表達(dá)情況。采用半定量評(píng)分法判定結(jié)果:染色強(qiáng)度分為無(wú)染色、弱染色、中等強(qiáng)度染色、強(qiáng)染色,對(duì)應(yīng)評(píng)分依次記為0分、1分、2分、3分;染色數(shù)量分為陽(yáng)性細(xì)胞占比<5%、5%~25%、>25%~75%、>75%~100%,對(duì)應(yīng)評(píng)分依次記為0分、1分、2分、3分。染色強(qiáng)度和染色數(shù)量得分之和≥2分判定為陽(yáng)性(陽(yáng)性細(xì)胞占比<5%直接記為陰性。)

    2.3.CLCA4 表達(dá)檢測(cè)方法 病理標(biāo)本置于RNAlater 保護(hù)液中,-80 ℃冷凍保存,檢測(cè)前離心去除保護(hù)劑。將組織標(biāo)本置于液氮中研磨成粉,依次提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,-20 ℃冷凍保存,預(yù)備PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μl,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min、變性15 s、60 ℃退火1 min、延伸溫度68 ℃,40個(gè)循環(huán)。取3個(gè)樣本復(fù)孔的均值,以CT值為基礎(chǔ),采用2-△△CT法計(jì)算CLCA4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

    2.4.隨訪及分組 所有患者術(shù)后采用門(mén)診復(fù)查、電話隨訪等方法跟蹤隨訪12 個(gè)月,觀察無(wú)病生存期(disease-free survival,DFS)情況。

    3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)處理采用SPSS 24統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn);符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。影響因素的分析采用多因素logistic逐步回歸模型,生存曲線Kaplan-Meier 分析與對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn),繪制受試者操作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)評(píng)估預(yù)測(cè)效能。

    結(jié)果

    1.CLCA4表達(dá)(表1)

    表1 106例非小細(xì)胞肺癌患者癌組織、癌旁正常組織中CLCA4表達(dá)分析

    癌組織中CLCA4 陽(yáng)性率及CLCA4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均低于癌旁正常組織(均P<0.05)。

    2.不同病理分期患者的CLCA4表達(dá)

    42 例Ⅱ期患者的CLCA4 mRNA 表達(dá)量為(0.69±0.15),64 例ⅢA 期患者的CLCA4 mRNA 表達(dá)量為(0.61±0.13),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.914,P=0.004)。

    3.不同預(yù)后組患者的臨床資料比較(表2)

    表2 不同預(yù)后非小細(xì)胞肺癌患者的臨床資料比較

    106例患者均正常隨訪12個(gè)月,其中非DFS組58例,DFS組48例。兩組患者的性別、年齡、BMI、吸煙、肺癌家族史、組織類型、分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);非DFS組中ⅢA期患者例數(shù)高于DFS組(P<0.05),CLCA4 mRNA表達(dá)量低于DFS組(P<0.05)。

    4.預(yù)后影響因素分析(表3)

    表3 106例非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的影響因素分析

    以NSCLC 患者死亡為因變量(是=1,否=0),logistic 回歸分析得出,TNM 分期(OR=4.031,95%CI1.429~11.364,P=0.003)、CLCA4 mRNA 表達(dá)量(OR=0.310,95%CI0.109~0.873,P=0.003)均是NSCLC患者DFS的影響因素。

    5.預(yù)測(cè)效能分析(圖1)

    圖1 CLCA4 mRNA預(yù)測(cè)106例非小細(xì)胞肺癌患者DFS的ROC

    ROC 分析得出,CLCA4 mRNA 預(yù)測(cè)NSCLC 患者DFS 的最佳截?cái)嘀禐?.60,靈敏度為0.802(95%CI0.715~0.893)、特異度為0.809(95%CI0.721~0.904)、曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.857(95%CI0.782~0.935)。

    6.生存預(yù)后分析(圖2)

    圖2 不同CLCA4 mRNA 表達(dá)水平的非小細(xì)胞肺癌患者的DFS曲線比較

    基于5.中CLCA4 mRNA 預(yù)測(cè)NSCLC 患者DFS 的最佳截?cái)嘀担瑢⒒颊叻譃镃LCA4 mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組,其中CLCA4 mRNA 高表達(dá)組50 例,死亡2 例;低表達(dá)組56 例,死亡11 例。兩組患者的生存曲線比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=6.006,P=0.014)。

    討論

    NSCLC 作為全球生存率最低的實(shí)體瘤,基因蛋白的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-11]。根據(jù)全球癌癥2020 年數(shù)據(jù)報(bào)道[12],肺癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因,我國(guó)約30%的癌因死亡與肺癌有關(guān),且發(fā)病率及病死率一直呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。近幾年隨著靶向[表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑、間變性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因、C-ros原癌基因1酪氨酸激酶(ROS1)融合基因等]、免疫[程序性死亡受體1(PD-1)、程序性死亡受體配體1(PD-L1)、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)抑制劑等)]等生物療法不斷取得突破,肺癌患者的生存效果顯著改善,但5 年總生存率僅保持在20%,且晚期NSCLC 患者的預(yù)后更差[13-15]。因此,針對(duì)NSCLC 新型診療靶點(diǎn)的探索一直是臨床醫(yī)學(xué)者研究的重點(diǎn)。

    本研究嘗試探究CLCA4 在NSCLC 組織中的表達(dá)情況以及與病理和預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果表明,與癌旁正常組織比較,癌組織中CLCA4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量更低,且隨著NSCLC 患者的病理進(jìn)展,CLCA4 表達(dá)量呈降低趨勢(shì)。與Li和Huang[6]、陳慧莉等[16]報(bào)道的CLCA4 在結(jié)直腸癌、乳腺癌中的表達(dá)均被抑制一致。Horaira等[17]研究提出,在癌組織中CLCA4基因甲基化改變可導(dǎo)致其表達(dá)水平下降。因此,本研究分析NSCLC 組織中DNA 甲基化改變是導(dǎo)致CLCA4 表達(dá)降低的原因之一,CLCA4 mRNA 表達(dá)量與NSCLC 患者的DFS預(yù)后相關(guān),且在NSCLC 患者DFS預(yù)測(cè)中效能表現(xiàn)良好。同時(shí),CLCA4 mRNA 高表達(dá)組與低表達(dá)組生存曲線存在差異,進(jìn)一步證實(shí)CLCA4 表達(dá)的變化與NSCLC 的病理進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。JAK2/STAT3 信號(hào)通路被廣泛認(rèn)為是與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)的一條信號(hào)通路,JAK2/STAT3 信號(hào)通路的活化可誘導(dǎo)靶向基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[18-21]。早期研究表明,JAK2/STAT3 信號(hào)通路可通過(guò)介導(dǎo)干擾素-γ、白細(xì)胞介素-10 等細(xì)胞因子激活JAK2酪氨酸激酶,從而使其磷酸化并激活STAT3轉(zhuǎn)錄因子[22-23]。激活的STAT3可通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合,誘導(dǎo)靶基因(如cyclin D1、c-myc、Bcl-2等)的轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程[24-26]。在肝癌、乳腺癌、肺癌等[27-28]多種惡性腫瘤中都存在JAK2/STAT3 的異常激活。Xiong 等[29]發(fā)現(xiàn)CircRPPH1 通過(guò)PI3K/AKT 和JAK2/STAT3 信號(hào)通路促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在NSCLC 的治療中可通過(guò)阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路和抑制msi2 細(xì)胞活性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[30]。而蔣可心等[31]研究發(fā)現(xiàn),CLCA4對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路具有抑制作用,且該信號(hào)途徑可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。因此,CLCA4 與JAK2/STAT3信號(hào)通路的相互作用,同樣是影響NSCLC病理進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)鍵。后續(xù)臨床實(shí)踐可通過(guò)檢測(cè)NSCLC癌組織中CLCA4 的變化,輔助診斷或評(píng)估NSCLC 患者的病理狀態(tài),且可能成為后續(xù)治療NSCLC的新型靶點(diǎn)。

    綜上,NSCLC 患者癌組織中CLCA4 表達(dá)被抑制,且與病理進(jìn)展及DFS 預(yù)后有關(guān)。但鑒于本研究納入樣本量有限,后續(xù)仍需完善多中心、大樣本隨機(jī)對(duì)照研究,證實(shí)本研究結(jié)論。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

    作者貢獻(xiàn)聲明吳媛媛:醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn),實(shí)施研究,采集數(shù)據(jù),分析/解釋數(shù)據(jù),文章撰寫(xiě),統(tǒng)計(jì)分析,獲取研究經(jīng)費(fèi),行政、技術(shù)或材料支持,指導(dǎo),支持性貢獻(xiàn);劉科、齊艷麗:采集數(shù)據(jù),對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱,統(tǒng)計(jì)分析,支持性貢獻(xiàn);童小華:醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn),分析/解釋數(shù)據(jù),對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱,獲取研究經(jīng)費(fèi),行政、技術(shù)或材料支持,指導(dǎo)

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