乳糖膽鹽體系大腸菌群測試片的研制及性能驗(yàn)證

王杰偉,孫萬東,吳艷輝,何艷玲,2*

1(北京陸橋技術(shù)股份有限公司,北京,100123)

2(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京,100176)

隨著國家經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展與人們健康意識的不斷提高,食品安全問題越來越受到人們的重視,在眾多食品微生物污染相關(guān)報(bào)道中,大腸菌群超標(biāo)占比較高[1]。大腸菌群作為一類衛(wèi)生指標(biāo)菌,是食品安全微生物檢測中的主要檢測項(xiàng)目之一[2]。食品中大腸菌群的檢測方法主要依據(jù)為GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》,其中平板計(jì)數(shù)法 (以下簡稱國標(biāo)方法),是在結(jié)晶紫中性紅膽鹽培養(yǎng)基(violet red bile agar,VRBA)培養(yǎng)基初篩后挑取典型與可疑菌落進(jìn)行確證,檢測周期長,可疑菌落的選擇較難把握[3],另外對于產(chǎn)氣能力較弱的大腸菌群,檢出率略低。隨著GB 4789.3—2016標(biāo)準(zhǔn)修訂,大腸菌群測試片也將獲得更高的接受度和更廣的實(shí)際應(yīng)用。當(dāng)前大腸菌群測試片相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)主要集中在測試片方法與國標(biāo)方法的性能比對上[4-5],對于如何增強(qiáng)測試片對弱產(chǎn)氣型大腸菌群的檢出能力尚無明確報(bào)道。本文針對此問題進(jìn)行了重點(diǎn)研究,以期進(jìn)一步完善大腸菌群測試片技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

結(jié)晶紫中性紅膽鹽培養(yǎng)基(violet red bile agar,VRBA)、結(jié)晶紫中性紅肉湯、腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth,BHI)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(tryptic soy agar,TSA),北京陸橋技術(shù)股份有限公司;瓜爾膠、海藻酸鈉、黃原膠、卡拉膠、乳糖、膽鹽、乳?；?N脂?；拾贝?、正丙基-?乳糖苷、正辛基-β-D-乳糖苷,均為分析純,阿拉丁試劑有限公司;聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)膜,上海晶華膠粘新材料股份有限公司;紙基膠板,上海金標(biāo)生物科技有限公司。

1.1.2 菌株

目標(biāo)菌:弗氏檸檬酸桿菌ATCC43864、大腸埃希氏菌ATCC25922、肺炎克雷伯氏菌ATCC13882、產(chǎn)氣克雷伯菌ATCC13048;革蘭氏陽性菌非目標(biāo)菌:糞腸球菌ATCC29212、金黃色葡萄球菌ATCC6538;革蘭氏陰性菌非目標(biāo)菌:鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、銅綠假單胞菌ATCC10104;均購自美國菌種保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104電子天平,瑞士梅特勒-托利多公司;SG604-INT生物安全柜,美國Baker公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備

分別挑取上述試驗(yàn)菌株的單菌落接種于BHI中,36 ℃培養(yǎng)24 h。取1 mL菌液加入9 mL無菌生理鹽水中混合均勻,即為10-1稀釋液,重復(fù)上述操作將菌液稀釋至適宜稀釋度,其中目標(biāo)菌、革蘭氏陰性非目標(biāo)菌得到菌落總數(shù)處于102CFU/mL的菌懸液;革蘭氏陽性菌非目標(biāo)菌得到菌落總數(shù)處于106CFU/mL的菌懸液;將4株目標(biāo)菌的菌懸液各取2 mL混合,得到混合菌液。

1.3.2 測試片的制備

大腸菌群測試片的基材選用菌落總數(shù)測試片研究[6]時(shí)所使用的基材,即上層覆膜為厚度為0.22 mm PET塑料膜,底板為200 g防水型背膠相紙,將培養(yǎng)基組分混合均勻后添加于測試片底板培養(yǎng)區(qū)域。

1.3.3 測試片載體的篩選

參照REN等[7]研究的相關(guān)信息,選擇瓜爾膠、海藻酸鈉、黃原膠、卡拉膠進(jìn)行試驗(yàn),篩選可應(yīng)用于大腸菌群測試片的載體。分別將15 g/L瓜爾膠、海藻酸鈉、黃原膠、卡拉膠,與15 g/L結(jié)晶紫中性紅肉湯培養(yǎng)基、10 g/L乳糖和1.2 g/L三號膽鹽混合均勻后,添加至測試片培養(yǎng)區(qū)域制備為測試片,每種測試片分別接種1 mL目標(biāo)菌混合菌液,于37 ℃培養(yǎng)24 h觀察菌落狀態(tài),同時(shí)接種TSA培養(yǎng)基作為對照,計(jì)算回收率。本研究中各試驗(yàn)均設(shè)置3組平行。

1.3.4 單因素-正交試驗(yàn)確定培養(yǎng)基關(guān)鍵組分添加量

1.3.4.1 冷水可溶凝膠添加量

分別將9、12、15、18、21 g/L卡拉膠,與15 g/L結(jié)晶紫中性紅肉湯培養(yǎng)基、10 g/L乳糖和1.2 g/L三號膽鹽混合均勻后,添加至測試片培養(yǎng)區(qū)域制備為測試片,每種測試片分別接種1 mL目標(biāo)菌混合菌液,于37 ℃培養(yǎng)24 h觀察菌落狀態(tài),同時(shí)接種TSA培養(yǎng)基作為對照。

1.3.4.2 乳糖添加量

分別將4、6、8、10、12 g/L乳糖,與15 g/L結(jié)晶紫中性紅肉湯培養(yǎng)基、1.2 g/L三號膽鹽和15 g/L卡拉膠混合均勻后,添加至測試片培養(yǎng)區(qū)域制備為測試片,每種測試片分別接種1 mL目標(biāo)菌混合菌液,于37 ℃培養(yǎng)24 h觀察菌落狀態(tài),同時(shí)接種TSA培養(yǎng)基作為對照。

1.3.4.3 膽鹽添加量

分別將膽鹽按0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 g/L,與15 g/L結(jié)晶紫中性紅肉湯培養(yǎng)基、10 g/L乳糖和15 g/L卡拉膠混合均勻后,添加至測試片培養(yǎng)區(qū)域制備為測試片,每種測試片分別接種1 mL目標(biāo)菌混合菌液與非目標(biāo)菌液,于37 ℃培養(yǎng)24 h觀察菌落狀態(tài),同時(shí)接種TSA培養(yǎng)基作為對照。

1.3.4.4 最優(yōu)組合的確定

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)中確定的各關(guān)鍵組分的添加水平范圍,將卡拉膠(12、15、18 g/L)、乳糖(6、8、10 g/L)與膽鹽(1.2、1.4、1.6 g/L)進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn),確定關(guān)鍵組分最優(yōu)組合。

1.3.5 針對特殊大腸菌群的優(yōu)化-誘導(dǎo)劑的篩選

將乳?；?N脂?；拾贝?、正丙基-?乳糖苷、正辛基-?-D-乳糖苷3種結(jié)構(gòu)類似物,按50～350 mg/L添加量分別設(shè)置試驗(yàn)組,與15 g/L結(jié)晶紫中性紅肉湯培養(yǎng)基、10 g/L乳糖、1.2 g/L三號膽鹽和15 g/L卡拉膠混合均勻后,添加至測試片培養(yǎng)區(qū)域制備為測試片,接種1 mL目標(biāo)菌混合菌液后于37 ℃培養(yǎng)24 h觀察菌落形態(tài)。同時(shí)設(shè)置陰性對照組,將每個(gè)試驗(yàn)組均做去除乳糖組分的處理,混合均勻后添加至測試片培養(yǎng)區(qū)域制備為測試片,接種1 mL弱產(chǎn)氣型菌株產(chǎn)氣克雷伯菌菌液后于37 ℃培養(yǎng)24 h觀察菌落形態(tài)。

1.3.6 大腸菌群測試片性能驗(yàn)證

1.3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證

參照GB 4789.28—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》中VRBA培養(yǎng)基質(zhì)控方法,使用標(biāo)準(zhǔn)菌株對本文研制的大腸菌群測試片進(jìn)行性能驗(yàn)證,將菌液接種至大腸菌群測試片上,于37 ℃ 培養(yǎng)24 h。其中目標(biāo)菌驗(yàn)證回收率,統(tǒng)計(jì)測試片上四周有氣泡菌落的數(shù)量,同時(shí)接種TSA培養(yǎng)基作為對照,計(jì)算回收率;非目標(biāo)菌驗(yàn)證抑制性,觀察測試片上是否有菌落生長;特異性驗(yàn)證,觀察測試片上鼠傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌的菌落形態(tài)。

1.3.6.2 實(shí)際樣品驗(yàn)證

選取50份不同基質(zhì)類型的市售食品樣品,梯度稀釋后分別使用測試片方法與國標(biāo)方法進(jìn)行大腸菌群計(jì)數(shù)。建立測試片法-國標(biāo)方法檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用線性回歸分析以檢驗(yàn)不同方法檢測結(jié)果的一致性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,顯著水平設(shè)定P<0.05,各組試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 測試片載體的確定

大腸菌群測試片中載體除固化粘合,為培養(yǎng)體系提供一個(gè)與固體培養(yǎng)基較近的生長環(huán)境外,還需有利于微生物發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣泡并將其有效截留。常規(guī)培養(yǎng)基載體瓊脂在冷水中不可溶,脆性易收縮[8],瓊脂顆粒間空隙較多,無法有效截留微生物發(fā)酵產(chǎn)生的氣泡;測試片研究涉及到的載體包括無紡布,紙基與冷水可溶凝膠,其中無紡布與紙基載體均無此特性[9],唯有冷水可溶凝膠遇冷水即水化形成黏稠半流體狀態(tài),分子間阻力更小,有利于氣泡的產(chǎn)生與保留,符合大腸菌群測試片對載體的要求[10-11]。

不同結(jié)構(gòu)的冷水可溶凝膠物理與化學(xué)特性也有不同[12-13],如黏稠度、擴(kuò)散阻力等,會(huì)對微生物生長、色素阻隔、氣泡截留等測試片關(guān)鍵指標(biāo)產(chǎn)生影響。海藻酸鈉為一種天然線性多糖[14],生物相容性好[15-16],作為載體培養(yǎng)后有較多區(qū)域被微生物液化,此狀態(tài)下的測試片載體阻力小,氣泡整體直徑較大,但可能對氣泡有一定的吸收能力,測試片上氣泡數(shù)偏少且?guī)缀鯖]有較小氣泡,同時(shí)載體已經(jīng)失去了對色素的阻隔性,無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù);黃原膠化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[17-18],作為載體培養(yǎng)后基本無液化情況,但阻力過大,氣泡直徑均偏小,菌落數(shù)量偏少,實(shí)際檢測時(shí)可能導(dǎo)致漏檢;瓜爾膠遇水后形成膠狀物[19],作為載體無明顯液化現(xiàn)象,但由于其阻力小且結(jié)構(gòu)松散,氣泡均較大,多個(gè)氣泡會(huì)擴(kuò)散融合為一個(gè)大氣泡,無法準(zhǔn)確進(jìn)行計(jì)數(shù);卡拉膠是一種提取自藻類的多糖,親水無毒[20],作為載體制備的測試片在上述各項(xiàng)指標(biāo)中均有良好的表現(xiàn),氣泡截留率略低原因?yàn)榛炀挟a(chǎn)氣克雷伯菌產(chǎn)氣能力較差,過小氣泡未統(tǒng)計(jì),此問題可通過組分優(yōu)化進(jìn)行改進(jìn)。

4種冷水可溶凝膠特性歸納見表1,制備的測試片在接種目標(biāo)菌培養(yǎng)后狀態(tài)見圖1。

a-卡拉膠;b-海藻酸鈉;c-黃原膠;d-瓜爾膠

表1 四種冷水可溶性凝膠性能比對

2.2 培養(yǎng)基關(guān)鍵組分添加量

2.2.1 冷水可溶凝膠添加量范圍

不同卡拉膠添加量對測試片回收率的影響相對較小,氣泡截留率以及測試片強(qiáng)度則有明顯差異,添加量低于9 g/L時(shí)培養(yǎng)基強(qiáng)度弱,接種時(shí)易被菌液沖散,培養(yǎng)后不同菌落產(chǎn)生的氣泡有擴(kuò)散融合的情況;增加到12 g/L時(shí)強(qiáng)度明顯改善,繼續(xù)增加至21 g/L后,體系凝膠強(qiáng)度過大,氣泡形態(tài)整體變?nèi)?部分菌株產(chǎn)生的氣泡過小易被漏檢?？ɡz添加量在12～18 g/L測試片氣泡形態(tài)易于觀察,氣泡截留率較高。

不同卡拉膠添加量制備的測試片培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 卡拉膠添加量對測試片性能影響

2.2.2 乳糖添加量范圍

大腸菌群國標(biāo)方法中以乳糖發(fā)酵產(chǎn)氣對菌株是否為大腸菌群進(jìn)行確認(rèn),需在大腸菌群測試片體系中添加適宜含量的乳糖以實(shí)現(xiàn)菌株確認(rèn)功能。乳糖添加量4 g/L時(shí)含量偏低,微生物之間競爭作用導(dǎo)致部分微生物無法有效發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣,氣泡整體偏小;隨著乳糖添加量增加此問題得到明顯改善,但當(dāng)乳糖添加量達(dá)到12 g/L時(shí),由于其發(fā)酵產(chǎn)物乳酸對微生物的抑制作用[21],活性較弱或存在損傷的微生物被抑制,回收率下降明顯,僅活性較高的微生物生長并發(fā)酵產(chǎn)氣,導(dǎo)致整體氣泡偏大,氣泡截留率異常升高。乳糖添加量在6～10 g/L較為適宜。不同乳糖添加量制備的測試片培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

表3 乳糖添加量對測試片性能影響

2.2.3 膽鹽添加量

膽鹽對革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抑制作用,可降低其細(xì)胞膜表面張力,使細(xì)胞膜破壞或菌體裂解,對革蘭氏陰性菌可能有誘導(dǎo)細(xì)胞膜多聚糖重塑等作用[22-24],抑制作用較輕微,但添加量過多時(shí)弱產(chǎn)氣型目標(biāo)菌產(chǎn)氣性能受影響較為明顯;另一方面膽鹽內(nèi)內(nèi)既含親水性的羥基和羧基,又含疏水性的甲基及烴核,主要構(gòu)型具有親水和疏水兩個(gè)側(cè)面,使分子具有界面活性分子的特征,能降低親水和疏水兩相之間的表面張力[25],即具備表面活性劑功能。由于測試片培養(yǎng)基中凝膠雖為冷水可溶且親水,但在無表面活性劑的情況下稀釋液并不能在培養(yǎng)基表面分散完全,一定添加量的膽鹽對于保證稀釋液在測試片培養(yǎng)區(qū)域的水?dāng)U散性能有著重要影響,在測試片體系下需對膽鹽的添加量進(jìn)行優(yōu)化。不同膽鹽添加量制備的測試片性能見表4。

表4 膽鹽添加量對測試片性能影響

膽鹽添加量過低時(shí),無法有效抑制革蘭氏陽性菌的生長,測試片培養(yǎng)基表面水?dāng)U散性能差,稀釋液無法自由擴(kuò)散滿整個(gè)培養(yǎng)區(qū)域,見圖2,此種情況增加測試片局部稀釋液溢出的風(fēng)險(xiǎn);添加量達(dá)到1.2 g/L時(shí),水?dāng)U散性能已較理想,繼續(xù)增加膽鹽添加量,水?dāng)U散速度雖繼續(xù)增加,但幅度已不大,雖不影響回收率,但添加量達(dá)到1.8 g/L時(shí)氣泡截留率明顯降低,說明隨著膽鹽添加量的增加,弱產(chǎn)氣型目標(biāo)菌的產(chǎn)氣性能開始被抑制,綜合抑制性、水?dāng)U散性能與對目標(biāo)菌產(chǎn)氣性能的影響,膽鹽添加量確定為1.2～1.6 g/L。

圖2 試驗(yàn)組誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)效果

2.2.4 最優(yōu)組合的確定

根據(jù)1.3.4節(jié)中確定的3種關(guān)鍵組分添加量范圍進(jìn)行了三因素三水平正交試驗(yàn),結(jié)果見表5。

表5 關(guān)鍵組分正交試驗(yàn)結(jié)果

3種關(guān)鍵組分對測試片氣體截留性能的影響程度主次順序?yàn)槟扄}>乳糖>卡拉膠,最優(yōu)配比為卡拉膠15 g/L,乳糖10 g/L,膽鹽1.2 g/L,經(jīng)過驗(yàn)證在此配比下,氣泡截留率為78.7%。

2.3 誘導(dǎo)劑的篩選

微生物菌株在測試片上產(chǎn)生氣泡的大小取決于菌株乳糖利用能力,自然界中存在一定比例的弱產(chǎn)氣型大腸菌群菌株,即使在營養(yǎng)充足,菌株未受損傷時(shí)產(chǎn)氣量仍很少甚至不產(chǎn)氣[26],另外產(chǎn)氣能力較強(qiáng)的菌株在活性不佳時(shí)產(chǎn)氣性能也會(huì)受到影響,在實(shí)際檢測過程中易被漏檢。相關(guān)研究中尚無對此問題改進(jìn)的報(bào)道,為提高測試片對此類菌株的檢出能力,本文參考本單位多年微生物快檢產(chǎn)品研發(fā)經(jīng)驗(yàn),嘗試添加少量無抑菌性的乳糖結(jié)構(gòu)類似物作為發(fā)酵誘導(dǎo)劑,在不產(chǎn)生假陽性氣泡的前提下增加弱產(chǎn)氣型目標(biāo)菌的產(chǎn)氣量,本研究中選擇乳?；?N脂?；拾贝?、正丙基-?乳糖苷、正辛基-?-D-乳糖苷3種組分作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行試驗(yàn)。

培養(yǎng)基中分別加入乳酰基-N脂?；拾贝?添加量達(dá)到250 mg/L)或正丙基-?乳糖苷(添加量達(dá)到200 mg/L)后,氣泡截留率可得到提升;添加正丙基-β乳糖苷的對照試驗(yàn)中,在100 mg/L添加量時(shí)陰性對照已有明顯產(chǎn)氣情況,此結(jié)構(gòu)類似物在誘導(dǎo)菌株發(fā)酵乳糖的過程中自身也被分解產(chǎn)生氣泡,在檢測過程中可能導(dǎo)致非目標(biāo)菌被誤判為大腸菌群;乳?；?N脂?；拾贝荚谔砑恿繛?50 mg/L時(shí)有良好的誘導(dǎo)效果,且對照組添加量為350 mg/L時(shí)陰性對照仍未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣菌落,此結(jié)構(gòu)類似物在誘導(dǎo)微生物發(fā)酵乳糖的過程中應(yīng)發(fā)揮了類似催化劑的作用,或即使在誘導(dǎo)過程中被消耗也不會(huì)發(fā)生產(chǎn)氣效應(yīng)。

使用含有250 mg/L乳?；?N脂?；拾贝冀M分的測試片,與未添加該組分的測試片對混合菌液進(jìn)行比對驗(yàn)證,共進(jìn)行10次檢測,使用SPSS軟件進(jìn)行配對t檢驗(yàn),P<0.05,添加誘導(dǎo)劑測試片產(chǎn)氣菌落數(shù)平均為94.6 CFU/片,未添加誘導(dǎo)劑測試片產(chǎn)氣菌落平均數(shù)為81.1 CFU/片,說明在測試片中添加250 mg/L乳?；?N脂?；拾贝甲鳛檎T導(dǎo)劑,對測試片產(chǎn)氣泡菌的檢出率能有顯著提升。

3種結(jié)構(gòu)類似物誘導(dǎo)效果見圖2,對照試驗(yàn)結(jié)果見圖3,驗(yàn)證數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析見表6。

a-100 mg/L正丙基-?乳糖苷對照;b-350 mg/L乳?；?N脂?；拾贝紝φ?/p>

表6 標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證結(jié)果

2.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證

4株大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株在測試片形成四周有明顯氣泡的菌落,回收率均達(dá)到75%以上,滿足現(xiàn)行國標(biāo)方法GB 4789.28—2013中VRBA培養(yǎng)基生長率(回收率)達(dá)到70%即滿足要求的評判標(biāo)準(zhǔn),革蘭氏陽性非目標(biāo)菌均被完全抑制,沙門氏菌等在國標(biāo)方法檢測時(shí)易與目標(biāo)菌混淆的干擾菌,在測試片上形成四周無氣泡的菌落,可直接與目標(biāo)菌進(jìn)行區(qū)分,顯示出測試片在特異性與便捷性上的優(yōu)勢,測試片標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證結(jié)果見表6與圖4。

a-弗氏檸檬酸桿菌;b-銅綠假單胞菌

2.5 實(shí)際樣品驗(yàn)證

使用大腸菌群測試片與國標(biāo)方法對50份市售食品樣本進(jìn)行檢測,2種檢測方法的線性相關(guān)曲線見圖5(未檢出大腸菌群的樣品,結(jié)果記為1 CFU/g),2種方法R2達(dá)到0.98。對于少部分的樣品,2種方法計(jì)數(shù)結(jié)果存在少許偏差,原因?yàn)閲鴺?biāo)方法在挑取典型菌落進(jìn)行確證的步驟中操作人員主觀因素對結(jié)果有影響,同時(shí)測試片方法補(bǔ)充了誘導(dǎo)劑成分,加強(qiáng)了對樣本中弱產(chǎn)氣目標(biāo)菌的檢測能力,部分樣品計(jì)數(shù)結(jié)果較國標(biāo)方法略高。本次驗(yàn)證國標(biāo)方法檢測為陰性的11份樣品中,有1份使用測試片法檢測出少量產(chǎn)氣量較少的菌落,經(jīng)國標(biāo)方法驗(yàn)證確定為大腸菌群,另有5份測試片檢驗(yàn)結(jié)果較國標(biāo)方法偏高的樣品,于每張測試片上挑取10個(gè)氣泡偏小的菌落用國標(biāo)方法確證后均判定為大腸菌群。去除掉上述6個(gè)樣品后,使用SPSS將2種方法檢測結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗(yàn),P>0.05,無明顯差異。說明對于常規(guī)樣品,測試片與國標(biāo)方法檢測結(jié)果無明顯差異,對于少量含有弱產(chǎn)氣目標(biāo)菌的樣品,使用測試片法可提升檢出率。

圖5 大腸菌群測試片法與國標(biāo)法檢測結(jié)果相關(guān)曲線

3 結(jié)論與討論

本文以大腸菌群國標(biāo)檢測方法檢測流程為參照,將VRBA體系與發(fā)酵驗(yàn)證體系相結(jié)合研制出大腸菌群測試片,可在一張測試片上同時(shí)實(shí)現(xiàn)選擇性分離與產(chǎn)氣驗(yàn)證。測試片關(guān)鍵環(huán)節(jié)為培養(yǎng)基組分研制,VRBA培養(yǎng)基中的瓊脂在冷水中不可溶,在測試片形式下無法作為載體,本研究引入冷水可溶凝膠作為培養(yǎng)體系載體,為微生物提供與固體培養(yǎng)基類似的生長環(huán)境,同時(shí)利用其成膠性收集截留大腸菌群在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的氣體,實(shí)現(xiàn)于測試片上同時(shí)進(jìn)行菌落形態(tài)與發(fā)酵產(chǎn)氣2種性狀的觀察。在實(shí)際研究過程中通過理化性能篩選出卡拉膠作為測試片載體,并通過正交試驗(yàn)確定卡拉膠15 g/L、乳糖10 g/L、膽鹽1.2 g/L的最優(yōu)添加量組合;最后本研究篩選出乳?；?N脂?；拾贝甲鳛槿樘前l(fā)酵誘導(dǎo)劑,添加量為250 mg/L時(shí),可顯著提升特殊弱產(chǎn)氣型目標(biāo)菌產(chǎn)氣率,最大程度避免對此類微生物的漏檢。標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行性能驗(yàn)證中,測試片回收率及革蘭氏陽性菌抑制性均滿足GB 4789.3—2013中對VRBA培養(yǎng)基的評判標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)沙門氏菌等革蘭氏陰性非目標(biāo)菌無氣泡生成,特異性良好;實(shí)際樣品檢測中,測試片與國標(biāo)中平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)結(jié)果一致性良好,說明本文研制的大腸菌群測試片在應(yīng)用于實(shí)際食品微生物檢測時(shí)結(jié)果與國標(biāo)方法結(jié)果無明顯差異,并且在一定程度上解決了當(dāng)前國標(biāo)方法在實(shí)際檢測過程中對部分弱產(chǎn)氣型大腸菌群檢出能力略低的問題。

大腸菌群測試片在進(jìn)行樣本檢測時(shí)相對于國標(biāo)方法具有明顯的優(yōu)勢,使用便捷,結(jié)果讀取環(huán)節(jié)相比于國標(biāo)方法需依靠經(jīng)驗(yàn)挑取典型菌與可疑菌,進(jìn)行產(chǎn)氣驗(yàn)證的判讀方式,測試片只需對四周有氣泡的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)即可,結(jié)果獲取更為客觀便捷,同時(shí)測試片最大優(yōu)勢分離確認(rèn)同時(shí)進(jìn)行,將檢測時(shí)間由48 h縮短為24 h,對于食品行業(yè)意義重大。在菌落總數(shù)測試片已經(jīng)進(jìn)入國家標(biāo)準(zhǔn)的背景下,大腸菌群測試片產(chǎn)品作為食品行業(yè)快速檢測的解決方案,將有更大的發(fā)揮空間。一款成熟的產(chǎn)品包括技術(shù)性能與批量化的生產(chǎn)工藝2個(gè)環(huán)節(jié),本文僅在技術(shù)可行性上進(jìn)行了嘗試,如何實(shí)現(xiàn)測試片批量化生產(chǎn)是后續(xù)研究重點(diǎn),本研究所做工作可為從事大腸菌群測試片研究的行業(yè)人員提供思路,為測試片產(chǎn)品的商品化積累經(jīng)驗(yàn)。