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    豬流行性腹瀉病毒Nsp7 基因真核表達載體的構(gòu)建及表達

    2024-04-01 05:27:26魏佳琪高振秋鄭亮牛欣雨武峰峰吳春宇王志昊張華曹宏偉
    關(guān)鍵詞:雙酶靜置質(zhì)粒

    魏佳琪,高振秋,鄭亮,牛欣雨,武峰峰,吳春宇,王志昊,張華,曹宏偉,,

    (1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,大慶 163319;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院;3.鹽城師范學(xué)院)

    豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的病毒性疾病,該病極具傳染性。PEDV 主要是引發(fā)腸道炎癥,對腸道造成損害,包括絨毛萎縮和脫落[1-2]。PEDV 為有囊膜的5’端加帽、3’端ploy(A)尾的單股正鏈RNA 病毒,是α 冠狀病毒家族中的一員,基因組核苷酸大約28 000 nt[3-4]。在PEDV 的基因組中,有三分之二的基因編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,即復(fù)制酶蛋白1a 和1b。它們在自身編碼的剪切酶的作用下被剪切成16 個非結(jié)構(gòu)蛋白(Nsp1-Nsp16),這些非結(jié)構(gòu)蛋白在PEDV 復(fù)制、裝配和逃避宿主天然免疫中發(fā)揮重要的作用[5]。PEDV 編碼的23個病毒蛋白中,已被證實有11 個蛋白能夠拮抗干擾素的產(chǎn)生,從而逃避宿主天然免疫[6]。

    PEDV Nsp7 蛋白分子量約為10 kDa,編碼83 個氨基酸,屬于疏水性蛋白質(zhì)。PEDV Nsp7 蛋白與病毒的復(fù)制以及病毒粒子的組裝有關(guān)[7-9]。研究發(fā)現(xiàn),冠狀病毒Nsp7 可以抑制宿主天然免疫,拮抗IFN 免疫應(yīng)答[10]。冠狀病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒RNA 的合成、加工以及病毒-宿主相互作用中發(fā)揮多種功能,其中Nsp7 至Nsp10 蛋白可以作為這些酶的關(guān)鍵輔助因子[11]。

    到目前為止,關(guān)于冠狀病毒Nsp7 作用機制方面的研究報道較少,對于PEDV Nsp7 蛋白也是如此。為進一步研究PEDV Nsp7 蛋白的生物學(xué)功能,研究構(gòu)建了PEDV Nsp7 基因的真核表達質(zhì)粒,并通過Western Blot 及間接免疫熒光技術(shù)確定PEDV Nsp7蛋白在細胞中成功表達。研究為后續(xù)制備抗PEDV Nsp7 蛋白的多克隆抗體以及PEDV Nsp7 蛋白的生物學(xué)功能研究奠定了一定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 細胞與質(zhì)粒

    豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)、人腎上皮細胞(HEK-293T)均保存于實驗室;胎牛血清(FBS)和DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco 生物公司;質(zhì)粒pCMVMyc 由實驗室保存;感受態(tài)細胞DH5α 購自北京天根生物技術(shù)有限公司;患有PED 的仔豬病料采集于黑龍江省大慶市某豬場,并保存在實驗室-80 ℃冰箱。

    1.2 主要試劑與抗體

    MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、PCR 試劑盒、限制性內(nèi)切酶、無縫克隆酶2×Seamless、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、ExTaq 熱啟動DNA 聚合酶購自Takara 公司;LipofectamineTM2000購自Invitrogen 公司;DNA 膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購于Omega 公司;基因特異性引物的合成及重組質(zhì)粒的序列測定均由擎科(北京)公司完成;小鼠抗Myc 標(biāo)簽單體克隆抗體(TA-01)購自碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗β-actin 單克隆抗體(ZM-0001)、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(ZB-2305)、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(ZB-2301)、FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(ZB-0312)購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    1.3 引物的設(shè)計

    以已經(jīng)發(fā)表在GenBank 網(wǎng)站中的PEDV 毒株基因序列為根據(jù),利用軟件Primer 5.0 進行PEDV Nsp7基因上、下游引物設(shè)計。特異性上游引物序列:5′-GCCATGGAGGCCCGAATTCGGATGTCTAAACTGA -CTGATATTAAGTGTA-3′(包含EcoRⅠ酶切位點),特異性下游引物序列:5′-CGCGGCCGCGGTACCTCGAGAACTCTGCAACATA C TATTGTC ATTAA-3′(包含XhoⅠ酶切位點)。

    1.4 PEDV Nsp7 基因的RT-PCR 擴增

    將保存的病變豬小腸用液氮研磨,將其放于1.5 mL EP 管中,進行劇烈搖晃1 min 后靜止15 min,將EP 管放入冰盒中,加入200 μL 三氯甲烷,快速搖晃20 s 后靜置15 min。將低溫靜置后的EP 管置于轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1的4 ℃離心機中離心15 min。離心后取出EP 管,再將EP 管中的上清液轉(zhuǎn)移至空的EP 管中,向新的管中加入600 μL 異丙醇,輕輕搖晃,搖晃后靜置12 min。靜置結(jié)束,將EP管離心15 min,轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1。離心后取出EP 管,將管中的上清液舍棄,向管中加入由DEPC 水配制的75%乙醇溶液600 μL,靜置5 min。靜置后將EP 管4 ℃離心5 min,轉(zhuǎn)速為7 500 r·min-1。離心結(jié)束,取出EP 管,將上清液舍棄,繼續(xù)12 000 r·min-1離心1 min。棄取上清液,將其余液體吹干,去除酒精,加入20 μL DPEC 水進行溶解,溶解后靜置15 min,放入-80 ℃冰箱中保存。

    RNA 提取完畢后,加入DEPC 水2 μL、Specific Primer(特異性下游引物)2 μL、Random Primer 1 μL、提取好的RNA 模板1 μL。PCR 條件為70 ℃10 min,共1 個循環(huán)。再向上述PCR 管中加入混合液:5×MMLV Buffer 2 μL、dNTP mix(10 mM)0.5 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、M-MLV 1 μL、DEPC 水1 μL,PCR反應(yīng)過程為30 ℃保溫10 min,42 ℃保溫60 min,70 ℃保溫15 min,共1 個循環(huán)。得到含PEDV 全基因組的cDNA 溶液。

    以得到的cDNA 為模板,加入模板1 μL、上游引物0.2 μL、下游引物0.2 μL、Buffer 3 μL、dNTP 2 μL、酶0.13 μL、ddH2O 13.47 μL,總反應(yīng)體系為20 μL。Nsp7 基因擴增反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,57.1 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共25 個循環(huán);72 ℃保溫7 min。將所得到的PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,切下目的條帶,利用膠回收試劑盒對目的產(chǎn)物膠回收,在-20 ℃冰箱中保存。

    1.5 Nsp7 基因真核表達載體的構(gòu)建及鑒定

    將pCMV-Myc 載體使用EcoRⅠ與XhoⅠ進行雙酶切,酶切條件為37 ℃、2 h,然后將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,隨后利用Omega 膠回收試劑盒將目的條帶進行膠回收。將切下的DNA 膠用700 μL Binding Buffer 溶解,條件為60 ℃、10 min。將溶解后的混合液倒入吸附柱中,轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1離心1 min,重復(fù)該步驟一遍。離心結(jié)束后棄掉下管液體,向上管中加入300 μL Binding Buffer,繼續(xù)12 000 r·min-1離心1 min。棄下管液體,加入700 μL Wash Buffer于上管中,轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1離心1 min,此過程重復(fù)1 次。丟棄下管液體,13 700 r·min-1離空2 min。離心后向上管加入30 μL 已經(jīng)加熱到60 ℃左右的去離子水,靜止溶解5 min,13 700 r·min-1離心2 min,得到純化后的基因片段和載體片段。

    準(zhǔn)備PCR 管,放入兩種純化后的產(chǎn)物,同時加入無縫克隆酶2×Seamless、Buffer 和去離子水,總體系為10 μL,放入水浴鍋中,連接溫度為50 ℃,連接時間為15 min。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α,平板涂布,培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h。挑取單菌落,在液體LB 培養(yǎng)基中37 ℃搖床培養(yǎng)10~12 h 后,將菌液進行PCR 鑒定。PCR 結(jié)果顯示,擴增出的條帶與目的基因大小相符,隨后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,并將提取后的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。將鑒定成功的樣品送至公司進行測序,將測序結(jié)果與理論序列進行比對,結(jié)果證明重組質(zhì)粒正確構(gòu)建,可做后續(xù)實驗,將正確質(zhì)粒命名為pCMVMyc-Nsp7。

    1.6 Western Blot 檢測

    待IPEC-J2 細胞、HEK-293T 細胞密度為80%時,開始轉(zhuǎn)染。首先將質(zhì)粒在13 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min,達到除菌的目的。將細胞板中原有的培養(yǎng)基換成DMEM 培養(yǎng)基,放在細胞培養(yǎng)箱備用。將質(zhì)粒取出,根據(jù)質(zhì)粒的濃度計算加到24 孔細胞培養(yǎng)板中的體積。轉(zhuǎn)染空載體pCMV-Myc 質(zhì)粒和pCMVMyc-Nsp7 質(zhì)粒各800 ng,并設(shè)置空白對照。準(zhǔn)備兩個EP 管,管1 中加入50 μL DMEM 和800 ng 質(zhì)粒溶液。管2 中加入50 μL DMEM 和1 μL 脂質(zhì)體。靜置5 min 后,將兩管液體混合,再靜置20 min。靜置結(jié)束后,將混合液分別加入到24 孔板的細胞培養(yǎng)液中,放入37 ℃培養(yǎng)箱中,轉(zhuǎn)染4~6 h,換成500 μL 10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。置于5% CO2培養(yǎng)箱中,37 ℃培養(yǎng)24 h,收取樣品。樣品收集:將轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)板放置于冰盒上,棄掉培養(yǎng)液,用500 μL的PBS 洗滌2 次,在細胞板每孔中加入40 μL 的RIPA 裂解液,將細胞板放置于4 ℃裂解30 min,裂解工作完成后,將每孔中被裂解的細胞從細胞板上刮下,分別加入到1.5 mL 離心管中,在4 ℃離心機中12 000 r·min-1離心10 min,吸取上清,棄沉淀。加入10 μL 的5×Loading Buffer,最后把蛋白質(zhì)和染料煮沸10 min,使得蛋白完全發(fā)生變性,可直接進行電泳。跑膠:配置聚丙烯酰胺凝膠,等待膠凝固以后,組裝膠和電泳槽,在確定不漏的情況下倒入1×SDS電泳液,插上電極,分離蛋白樣品,將蛋白樣品煮沸10 min,12 000 r·min-1離心10 min。吸取10 μL 上層樣品點樣,設(shè)置電壓80 V,跑完上層膠,再把電壓改為120 V,當(dāng)目標(biāo)蛋白完全分離后,關(guān)閉電源。轉(zhuǎn)膜:將膠板撬開,按照條帶大小切下對應(yīng)膠條,切下的凝膠和濾紙放到轉(zhuǎn)膜液中,打開轉(zhuǎn)膜儀,底層鋪入浸泡過轉(zhuǎn)膜液的墊網(wǎng),然后鋪上浸泡過的三層濾紙,在濾紙上淋加轉(zhuǎn)移液,驅(qū)趕濾紙下層氣泡。用鑷子將PVDF 膜平鋪在濾紙上,采用先中間再兩邊的鋪放辦法,避免氣泡的產(chǎn)生(膜要提前進行切角做標(biāo)記,以記住反正面),然后將膠輕輕的鋪放在PVDF 膜上,用手調(diào)整,使膠各邊緣與膜平齊,用玻璃棒趕出多余氣泡。再鋪一層濾紙及墊網(wǎng),將轉(zhuǎn)膜夾合緊,放在轉(zhuǎn)膜槽中,將轉(zhuǎn)膜槽放入冰浴的轉(zhuǎn)膜盒中電壓200 V、電流100 mA,2 h 后將膠體取出(可以看到轉(zhuǎn)移到膜上的Marker)。封閉:將PVDF 膜放入0.5%的脫脂奶粉中,在搖床上封閉孵育2 h。封閉結(jié)束后,需要用1×TBST 溶液洗膜4 次,每次洗膜5 min。孵育抗體:按照說明書配置一抗和二抗,將PVDF 膜先后置于配置好的一抗和二抗中孵育,一抗孵育時間為2 h,1×TBST溶液洗膜2 h,洗膜時間為每次15 min;二抗孵育2 h,1×TBST 溶液洗膜2 h,洗膜時間為每次15 min。曝光:用AI600 儀器曝光,保存結(jié)果圖片。

    1.7 間接免疫熒光

    在細胞板中放入爬片,接種細胞,待細胞密度達到60%左右時,開始轉(zhuǎn)染,用Lipofectin2000 將pCMV-Myc 和pCMV-Myc-Nsp7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至IPECJ2、HEK-293T 細胞中,4~6 h 后更換含有10%胎牛血清的DMEM 500 μL。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,取出細胞培養(yǎng)板,棄掉培養(yǎng)液,PBS 洗2 次;向24 孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入500 μL 的4%多聚甲醛溶液,10 min 后棄掉溶液,加入PBS 清洗3 次,每次15 min,均放置于水平搖床上;棄掉PBS,加入500 μL的0.1%曲拉通溶液,靜置20 min,增加細胞膜的通透性;將曲拉通吸棄,用PBS 洗3 次,每次15 min。每孔加入500 μL 的5% BSA 溶液,靜置2 h 后加入PBS,搖床清洗細胞板,每次15 min,清洗3 次;然后用1%BSA 溶液稀釋特異性抗體,每孔加入500 μL,靜置孵育2 h,加入PBS 清洗細胞板;再加FITC 熒光標(biāo)記的二抗,室溫避光孵育2 h。回收二抗稀釋液,加入PBS,將細胞板放在搖床上清洗3 次,每次15 min,最后制片。制片操作如下:首先用鑷子取出干凈的載玻片,向載玻片上滴加少量DAPI 封片劑,然后挑出細胞爬片,放在封片劑中央,用干凈的紙巾輕輕壓在細胞爬片上,吸干多余的封片劑,避光放置30 min。待晾干后,黑暗條件下用激光顯微鏡觀察細胞的情況,最后拍照并保存。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 RT-PCR 擴增Nsp7 基因全長序列

    從病變豬小腸提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄出cDNA,利用設(shè)計的特異性Nsp7 的上、下游引物,并以cDNA為模板對目的基因進行PCR 擴增,所得目的條帶為252 bp 的PEDV Nsp7 基因片段,結(jié)果如圖1 所示。

    圖1 Nsp7 基因片段的PCR 擴增Fig.1 PCR amplification of Nsp7 gene fragment

    2.2 真核表達載體pCMV-Myc 雙酶切

    為構(gòu)建PEDV Nsp7 基因的真核表達載體,試驗將利用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ兩種限制性內(nèi)切酶對pCMV-Myc 載體進雙酶切,將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,顯示真核表達載體雙酶切成功,結(jié)果如圖2 所示。

    圖2 pCMV-Myc 載體的雙酶切Fig.2 Digestion of pCMV-Myc vector

    2.3 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7 的鑒定

    利用無縫克隆酶2×Seamless 將目的基因和載體的酶切產(chǎn)物進行連接,連接產(chǎn)物用感受態(tài)DH5α 轉(zhuǎn)化,過夜培養(yǎng),挑取單菌落擴大培養(yǎng),37 ℃搖床10~12 h,對其進行菌液PCR 鑒定,瓊脂糖凝膠電泳后在250 bp 附近出現(xiàn)明亮單一的條帶,結(jié)果如圖3 所示。菌液鑒定成功后,提取質(zhì)粒,進行雙酶切鑒定。酶切體系:EcoRⅠ1 μL、XhoⅠ1 μL、10×H Buffer 1 μL、質(zhì)粒2 μL、去離子水5 μL,總體系10 μL,置于37 ℃水浴鍋中2 h。雙酶切產(chǎn)物電泳后在3 000 bp 和250 bp附近出現(xiàn)兩條條帶,得到試驗條帶與預(yù)期理論設(shè)計結(jié)果相符,結(jié)果如圖4 所示。結(jié)果均顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,將其命名為pCMV-Myc-Nsp7。

    圖3 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7 的菌液PCR 鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pCMV-Myc-Nsp7 by PCR

    圖4 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7 的雙酶切鑒定Fig.4 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pCMV-Myc-Nsp7

    2.4 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7 的測序及其序列分析

    為比較構(gòu)建的重組質(zhì)粒與原始Nsp7 基因序列的同源性,將篩選的陽性重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7取10 μL 送至生物公司進行測序。將NCBI 網(wǎng)站上的PEDV Nsp7 基因序列與所得到的測序結(jié)果進行序列比對,最終結(jié)果顯示,其同源性高達99%,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。序列比對結(jié)果如圖5 所示。

    圖5 pCMV-Myc-Nsp7 與CV777 毒株Nsp7 基因序列比對Fig.5 Sequence alignment between pCMV-Myc-Nsp7 and CV777 strain Nsp7

    2.5 重組質(zhì)粒的Western Blot 鑒定

    為檢測重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7 在細胞中的表達情況,將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HEK-293T 細胞、IPEC-J2 細胞中,先后利用鼠抗Myc 單抗及山羊抗小鼠熒光二抗標(biāo)記,檢測空載體pCMV-Myc 及重組表達載體pCMV-Myc-Nsp7 的表達情況。Western Blot 結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7 在IPEC-J2 細胞、HEK-293T 細胞均能夠成功表達,結(jié)果如圖6 表示。

    圖6 Western Blot 鑒定蛋白融合表達Fig.6 Identification of fusion protein expression by Western Blot

    2.6 重組蛋白Nsp7 的免疫熒光鑒定

    研究以間接免疫熒光技術(shù)探究了pCMV-Myc-Nsp7 在IPEC-J2 細胞和HEK-293T 細胞中的分布情況。免疫熒光結(jié)果顯示,重組表達載體pCMVMyc-Nsp7 質(zhì)粒在IPEC-J2 細胞和HEK-293T 細胞中成功表達,結(jié)果如圖7 所示。

    圖7 重組蛋白Nsp7 在細胞中表達的免疫熒光鑒定Fig.7 Immunofluorescence identification of recombinant protein Nsp7 expression in cells

    3 討論

    豬腸道冠狀病毒(SECoV)包括豬流行性腹瀉病毒(PEDV),傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬δ 型冠狀病毒(PDCoV),占新生豬致命性水樣腹瀉的大部分,并給世界帶來重大的經(jīng)濟和公共衛(wèi)生負擔(dān)。冠狀病毒感染的共同特征是逆轉(zhuǎn)宿主細胞周期,以促進病毒復(fù)制,但具體機制在很大程度上仍未知。雖然這三種SECoV 主要感染體內(nèi)腸上皮,并引起相似的臨床體征,但其細胞向性和致病性存在明顯差異[12]。PEDV 最初在20 世紀(jì)70 年代報道,導(dǎo)致新生仔豬死亡率最高。主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、厭食、消瘦,年齡越小,癥狀則越為明顯,對養(yǎng)殖業(yè)以及畜牧業(yè)造成巨大的威脅。該病在英國被首次發(fā)現(xiàn),與豬胃腸炎病癥狀極為相似,給豬進行診斷和治療帶來了極大的困難[13-14]。而兩者主要區(qū)別是豬流行性腹瀉主要針對于幼豬,對幼豬威脅較大,對成年豬而言,癥狀較輕,不致死[15-16]。自豬流行性腹瀉在歐洲多個國家爆發(fā)以來,使得農(nóng)場中豬的產(chǎn)量直線下降,造成了非常大的影響[17]。在PEDV 流行期間,不同的出版物引用了與PEDV 快速傳播相關(guān)的幾個風(fēng)險因素(動物運動,卡車污染,屠宰場污染,受污染的飼料和飼料廠,以及農(nóng)場員工等),控制PEDV 感染最有效的途徑之一是接種疫苗[18]。

    豬流行性腹瀉病毒核酸型為RNA,編碼的5 種結(jié)構(gòu)蛋白為S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白、N 蛋白、ORF3蛋白,其中ORF3 蛋白是其唯一編碼的輔助性蛋白。該病毒還編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,即Nsp1-Nsp16。這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復(fù)制、裝配、拮抗天然宿主免疫中發(fā)揮重要的作用?,F(xiàn)在關(guān)于PEDV 編碼的各種蛋白的表達及生物學(xué)功能研究的文獻相對較少。有研究表明,CoV 的Nsp7 蛋白是相對保守的,由于蛋白構(gòu)象的緣故,發(fā)揮功能時可能受到Nsp8 的影響,或是與Nsp8相互作用[17]。但在PEDV 中,Nsp7 抑制干擾素的產(chǎn)生,與Nsp8 無關(guān)[19]。豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的Nsp7 在病毒組裝過程中發(fā)揮重要作用,其定位在細胞質(zhì),下調(diào)豬小腸上皮細胞中IL-8 的表達[20]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的Nsp7 在誘導(dǎo)宿主體液免疫應(yīng)答中起重要作用[21]。在SARS-CoV-2 中,Nsp7、Nsp8 和Nsp12 為RNA 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(RTC)的三個組分,負責(zé)識別和處理RNA,用于新病毒的繁殖和病毒蛋白的核糖體轉(zhuǎn)錄[22]。

    Nsp7 在病毒生命周期中發(fā)揮重要作用,由于與已知結(jié)構(gòu)的同源性非常低,導(dǎo)致對Nsp7 的功能和結(jié)構(gòu)機制知之甚少。為探討Nsp7 蛋白功能,研究利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建了pCMV-Myc-Nsp7 真核表達載體,并驗證Nsp7 蛋白在細胞中能正常表達,為豬流行性腹瀉病毒Nsp7 蛋白的功能研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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