迪里夏提·阿力木,鄭堅(jiān)江,多力坤·吐拉哈孜,阿木提江·馬合木提 (新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院肝膽胰醫(yī)學(xué)診療中心,新疆 烏魯木齊 830001)
胰腺癌是發(fā)病于胰腺導(dǎo)管上皮及腺泡細(xì)胞的惡性腫瘤,其早期發(fā)病隱匿,缺乏診斷的標(biāo)志物,患者生存時(shí)間短,被稱(chēng)為“癌中之王”,因此探究胰腺癌診斷的標(biāo)志物和治療的新靶點(diǎn)一直是研究的重點(diǎn)領(lǐng)域[1-2]。有研究指出,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可調(diào)控胰腺癌的病理進(jìn)程,包括腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[3]。根據(jù)巨噬細(xì)胞的激活方式可分為M1 型和M2 型,其中M2 型巨噬細(xì)胞與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型及功能相似,因此常用于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的體外研究[4]。Ye等[5]研究指出,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能夠通過(guò)調(diào)控CCL18/NF-κB/VCAM-1信號(hào)通路從而促進(jìn)胰腺癌的轉(zhuǎn)移。Wang 等[6]研究發(fā)現(xiàn),腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞亦可促進(jìn)胰腺癌的免疫耐受。外泌體是多種細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌外泌體調(diào)控胰腺癌血管新生、進(jìn)展、耐藥等[7-9]。高水平糖酵解是胰腺癌腫瘤微環(huán)境的特征之一,既可為腫瘤的生長(zhǎng)提供ATP,又可創(chuàng)造利于腫瘤生長(zhǎng)的酸性環(huán)境[10]。本研究探究了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)胰腺癌細(xì)胞糖酵解的影響及機(jī)制,以期為胰腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。
人胰腺癌細(xì)胞株CAPAN-2 和ASPC-1,人單核細(xì)胞THP-1 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);佛波酯、rhIL-4和rhIL-13 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;外泌體提取試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;Lipofectamin 2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;CCK-8 試劑盒、葡萄糖攝取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司;TRIzol 和Prime Script RT Reagent 試劑盒購(gòu)自日本Takara 公司;SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Med Chemexpress 公司;乳酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇KeyGEN Bio-TECH 公司;CD9、CD81、TSG101、KRAS、GAPDH 抗體及山羊抗兔IgG購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。
CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基中,THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。
M2 型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo):THP-1 培養(yǎng)基更換為含150 nmol/L 佛波酯的培養(yǎng)基誘導(dǎo)72 h,使其分化為貼壁的M0 型巨噬細(xì)胞,所得M0 型巨噬細(xì)胞與20 μg/L rhIL-4 和20 μg/L rhIL-13 共培養(yǎng),誘導(dǎo)72 h,使其分化為M2型巨噬細(xì)胞。
收集M0 和M2 型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清,將細(xì)胞上清液于4 ℃以3 000 g 離心10 min,取上清液,每1 mL 上清加入250 μL 的外泌體提取試劑,4 ℃靜置2 h,以12 000 g 離心20 min,棄上清,所得外泌體(M0 exo和M2 exo)用500 μL 無(wú)菌PBS 重懸。使用透射電鏡觀察外泌體的結(jié)構(gòu),Western blot 檢測(cè)外泌體標(biāo)志物CD9、CD81、TSG101表達(dá)。
將CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞分為PBS 組、M0 exo組、M2 exo 組、M2 exo+siKRAS 組。M0 exo 組和M2 exo組CAPAN-2、ASPC-1 細(xì)胞分別與10 μg/mL M0 exo 和10 μg/mL M2 exo 共孵育24 h,M2 exo+siKRAS 組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染KRAS siRNA 后與10 μg/mL M2 exo共孵育24 h,PBS組加入等體積PBS。按照Lipofectamin 2000 試劑盒說(shuō)明書(shū),將KRAS siRNA轉(zhuǎn)染至CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。
將PBS 組、M0 exo 組、M2 exo 組、M2 exo+siKRAS組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞接種于96 孔板中,每孔細(xì)胞密度為5×104/mL,每孔100 μL,按照細(xì)胞分組將細(xì)胞與等體積的PBS、10 μg/mL M0 exo、10 μg/mL M2 exo、轉(zhuǎn)染KRAS siRNA+10 μg/mL M2 exo 共孵育24、48、72 h,在各時(shí)間點(diǎn)取出對(duì)應(yīng)的96 孔板,每孔加入10 μL CCK-8 溶液,孵育4 h 后,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔光密度(optical density,OD)值。
使用TRIzol 試劑盒提取各組巨噬細(xì)胞總RNA,使用Prime Script RT Reagent 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng),反應(yīng)條件為:95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s,40 個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。以GAPDH 為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt法檢測(cè)各組細(xì)胞iNOS、IL-12β、Arg-1和IL-10表達(dá),引物序列見(jiàn)表1。
表1 基因引物序列
將各組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞接種至96 孔板中,每孔2 000 個(gè)細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁后,PBS 清洗3 次,每孔更換為100 μL 含2%牛血清白蛋白的KRPH 溶液孵育30 min,再加入10 μL 2-DG 孵育20 min 后,加入80 μL 裂解液,分別于80 ℃孵育40 min,冰上孵育5 min,然后各孔加入10 μL 中和溶液,收集各孔上清液,加入10 μL 復(fù)合物A 溶液,37 ℃孵育1 h,然后加入等體積的中和緩沖液,混勻后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)412 nm 波長(zhǎng)處各孔的OD 值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各孔葡萄糖濃度,葡萄糖攝取率=(空白組葡萄糖含量-每孔剩余葡萄糖含量)/空白組葡萄糖含量×100%。
收集各組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞培養(yǎng)上清,按照乳酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū),每孔加入待測(cè)樣品20 μL(標(biāo)準(zhǔn)管加入3 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液20 μL,空白管加入PBS 20 μL)、酶工作液1 mL、試劑盒D 工作液200 μL,混合均勻后于37 ℃水浴10 min,然后每管加入2 μL的Buffer E 溶液,混勻后,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)530 nm 波長(zhǎng)處各孔的OD 值。乳酸含量=(待測(cè)樣品OD 值-空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)品管OD 值-空白管OD 值)×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)×3 mmol/L。
RIPA試劑盒提取M0 exo、M2 exo和各組CAPAN-2和ASPC-1 細(xì)胞總蛋白,所得蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳,濕法轉(zhuǎn)膜后,將PVDF 膜與CD9、CD81、TSG101、KRAS、p-ERK1/2、ERK1/2、GAPDH 抗體于4 ℃孵育過(guò)夜,TBST 清洗3 次后,以1∶10 000 的比例稀釋山羊抗體IgG并室溫孵育1 h,洗膜,使用ECL試劑盒顯影。
使用Graphpad prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,2 組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
與THP-1 細(xì)胞比較,M0 型巨噬細(xì)胞中iNOS、IL-12β、Arg-1 和IL-10 表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05),而M0+rhIL-4+rhIL-13 細(xì)胞中M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白iNOS和IL-12β表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.001),M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白Arg-1 和IL-10 表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001),見(jiàn)圖1。說(shuō)明rhIL-4 和rhIL-13 可誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞的極化。
圖1 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞iNOS、IL-12β、Arg-1和IL-10 mRNA表達(dá)
提取的M0 exo 和M2 exo 均呈雙層膜結(jié)構(gòu),粒徑100 nm 左右,呈“杯托”樣,并且均表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD81、TSG101,符合外泌體的特征,見(jiàn)圖2。
圖2 M0 exo和M2 exo鑒定結(jié)果
與PBS組比較,M0 exo組CAPAN-2和ASPC-1細(xì)胞中KRAS 表達(dá)以及ERK1/2 磷酸化水平均無(wú)顯著差異(P>0.05);與M0 exo組和PBS組比較,M2 exo組CAPAN-2和ASPC-1細(xì)胞中KRAS表達(dá)顯著增加(P<0.001),ERK1/2磷酸化水平顯著升高(P<0.001),見(jiàn)圖3。
圖3 外泌體對(duì)CAPAN-2和ASPC-1細(xì)胞中KRAS/ERK1/2信號(hào)通路的影響
與PBS 組比較,M0 exo 組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞增殖能力在24、48、72 h 均無(wú)顯著變化(P>0.05);M2 exo 組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞在24、48、72 h 的增殖能力均顯著高于其他組(P<0.05),見(jiàn)圖4。
圖4 外泌體調(diào)控KRAS 對(duì)CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞增殖能力的影響
與PBS 組比較,M0 exo 組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞的葡萄糖攝取率與乳酸生成水平均無(wú)顯著變化(P>0.05);M2 exo 組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞的葡萄糖攝取率與乳酸生成水平均顯著高于其他組(P<0.001),見(jiàn)圖5。
圖5 外泌體調(diào)控KRAS對(duì)CAPAN-2和ASPC-1細(xì)胞糖酵解的影響
腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是一類(lèi)腫瘤微環(huán)境中重要的免疫細(xì)胞,其表型和功能與M2 型巨噬細(xì)胞相似,具有促進(jìn)腫瘤惡性生物學(xué)行為的功能[11]。Hwang 等[12]的研究指出,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的增加與非小細(xì)胞肺癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)。D'Errico等[13]的研究表明,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可促進(jìn)胰腺癌的轉(zhuǎn)移。Kemp 等[14]的研究表明,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的水平能夠反映胰腺癌患者全身免疫水平的變化。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤的調(diào)控是通過(guò)多種途徑進(jìn)行。Liu 等[15]的研究表明,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。越來(lái)越多的研究表明,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞亦可通過(guò)分泌外泌體而調(diào)控胰腺癌的血管新生、進(jìn)展、耐藥等[7-9]。本研究將單核細(xì)胞THP-1誘導(dǎo)分化為M2 型巨噬細(xì)胞,用于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的體外研究,并且提取M2 型巨噬細(xì)胞分泌的外泌體,將外泌體與胰腺癌細(xì)胞CAPAN-2 和ASPC-1 共孵育后發(fā)現(xiàn),CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞的增殖能力顯著增加。Wu等[16]也發(fā)現(xiàn)M2 型巨噬細(xì)胞外泌體可促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。Wei 等[17]亦發(fā)現(xiàn),M2 型巨噬細(xì)胞外泌體可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。上述結(jié)果均說(shuō)明M2 型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
研究表明,KRAS 通路的異常活化與胰腺癌的病理進(jìn)程密切相關(guān),超過(guò)90%的胰腺癌患者均存在KRAS 基因突變,KRAS 異?;罨瘯?huì)導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞的快速生長(zhǎng)[18]。Diehl 等[19]的研究發(fā)現(xiàn),KRAS/ERK 信號(hào)通路在胰腺癌中異常激活,靶向抑制ERK 可抑制KRAS 突變誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)。本研究將M2 型巨噬細(xì)胞外泌體與CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞共孵育后,CAPAN-2和ASPC-1細(xì)胞中KRAS 基因表達(dá)顯著上調(diào),ERK1/2 磷酸化水平亦顯著升高,說(shuō)明M2 型巨噬細(xì)胞外泌體可顯著激活KRAS/ERK1/2信號(hào)通路。Katopodi等[20]的研究表明,KRAS 突變可促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的形成。Humpton 等[21]的研究表明,原癌基因KRAS 的表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌的生長(zhǎng)。Dey等[22]的研究表明,KRAS 突變可誘導(dǎo)胰腺癌腫瘤微環(huán)境的代謝重編程。本研究發(fā)現(xiàn),與M2 型巨噬細(xì)胞外泌體共孵育后,CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞糖酵解增加,抑制細(xì)胞中KRAS 的表達(dá)后,M2 型巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞的糖酵解誘導(dǎo)能力顯著下降,說(shuō)明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞外泌體可通過(guò)誘導(dǎo)KRAS 信號(hào)通路而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的糖酵解。
綜上所述,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌外泌體誘導(dǎo)KRAS/ERK 信號(hào)通路的激活而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和糖酵解。