腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞外泌體調(diào)控KRAS 信號通路影響胰腺癌細(xì)胞糖酵解功能

迪里夏提·阿力木,鄭堅(jiān)江,多力坤·吐拉哈孜,阿木提江·馬合木提 （新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院肝膽胰醫(yī)學(xué)診療中心，新疆 烏魯木齊 830001）

胰腺癌是發(fā)病于胰腺導(dǎo)管上皮及腺泡細(xì)胞的惡性腫瘤，其早期發(fā)病隱匿，缺乏診斷的標(biāo)志物，患者生存時(shí)間短，被稱為“癌中之王”，因此探究胰腺癌診斷的標(biāo)志物和治療的新靶點(diǎn)一直是研究的重點(diǎn)領(lǐng)域[1-2]。有研究指出，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可調(diào)控胰腺癌的病理進(jìn)程，包括腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[3]。根據(jù)巨噬細(xì)胞的激活方式可分為M1 型和M2 型，其中M2 型巨噬細(xì)胞與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型及功能相似，因此常用于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的體外研究[4]。Ye等[5]研究指出，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能夠通過調(diào)控CCL18/NF-κB/VCAM-1信號通路從而促進(jìn)胰腺癌的轉(zhuǎn)移。Wang 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞亦可促進(jìn)胰腺癌的免疫耐受。外泌體是多種細(xì)胞分泌的納米級囊泡，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可通過分泌外泌體調(diào)控胰腺癌血管新生、進(jìn)展、耐藥等[7-9]。高水平糖酵解是胰腺癌腫瘤微環(huán)境的特征之一，既可為腫瘤的生長提供ATP，又可創(chuàng)造利于腫瘤生長的酸性環(huán)境[10]。本研究探究了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞外泌體對胰腺癌細(xì)胞糖酵解的影響及機(jī)制，以期為胰腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌細(xì)胞株CAPAN-2 和ASPC-1，人單核細(xì)胞THP-1 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；佛波酯、rhIL-4和rhIL-13 購自美國Sigma 公司；外泌體提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Lipofectamin 2000試劑盒購自美國Invitrogen 公司；CCK-8 試劑盒、葡萄糖攝取試劑盒購自美國Abcam 公司；TRIzol 和Prime Script RT Reagent 試劑盒購自日本Takara 公司；SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒購自美國Med Chemexpress 公司；乳酸檢測試劑盒購自江蘇KeyGEN Bio-TECH 公司；CD9、CD81、TSG101、KRAS、GAPDH 抗體及山羊抗兔IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基中，THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

M2 型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)：THP-1 培養(yǎng)基更換為含150 nmol/L 佛波酯的培養(yǎng)基誘導(dǎo)72 h，使其分化為貼壁的M0 型巨噬細(xì)胞，所得M0 型巨噬細(xì)胞與20 μg/L rhIL-4 和20 μg/L rhIL-13 共培養(yǎng)，誘導(dǎo)72 h，使其分化為M2型巨噬細(xì)胞。

1.3 外泌體的提取與鑒定

收集M0 和M2 型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清，將細(xì)胞上清液于4 ℃以3 000 g 離心10 min，取上清液，每1 mL 上清加入250 μL 的外泌體提取試劑，4 ℃靜置2 h，以12 000 g 離心20 min，棄上清，所得外泌體（M0 exo和M2 exo）用500 μL 無菌PBS 重懸。使用透射電鏡觀察外泌體的結(jié)構(gòu)，Western blot 檢測外泌體標(biāo)志物CD9、CD81、TSG101表達(dá)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞分為PBS 組、M0 exo組、M2 exo 組、M2 exo+siKRAS 組。M0 exo 組和M2 exo組CAPAN-2、ASPC-1 細(xì)胞分別與10 μg/mL M0 exo 和10 μg/mL M2 exo 共孵育24 h，M2 exo+siKRAS 組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染KRAS siRNA 后與10 μg/mL M2 exo共孵育24 h，PBS組加入等體積PBS。按照Lipofectamin 2000 試劑盒說明書，將KRAS siRNA轉(zhuǎn)染至CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將PBS 組、M0 exo 組、M2 exo 組、M2 exo+siKRAS組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔細(xì)胞密度為5×104/mL，每孔100 μL，按照細(xì)胞分組將細(xì)胞與等體積的PBS、10 μg/mL M0 exo、10 μg/mL M2 exo、轉(zhuǎn)染KRAS siRNA+10 μg/mL M2 exo 共孵育24、48、72 h，在各時(shí)間點(diǎn)取出對應(yīng)的96 孔板，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育4 h 后，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔光密度（optical density，OD）值。

1.6 qRT-PCR

使用TRIzol 試劑盒提取各組巨噬細(xì)胞總RNA，使用Prime Script RT Reagent 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。以GAPDH 為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法檢測各組細(xì)胞iNOS、IL-12β、Arg-1和IL-10表達(dá)，引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.7 葡萄糖的攝取實(shí)驗(yàn)

將各組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞接種至96 孔板中，每孔2 000 個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，PBS 清洗3 次，每孔更換為100 μL 含2%牛血清白蛋白的KRPH 溶液孵育30 min，再加入10 μL 2-DG 孵育20 min 后，加入80 μL 裂解液，分別于80 ℃孵育40 min，冰上孵育5 min，然后各孔加入10 μL 中和溶液，收集各孔上清液，加入10 μL 復(fù)合物A 溶液，37 ℃孵育1 h，然后加入等體積的中和緩沖液，混勻后使用酶標(biāo)儀檢測412 nm 波長處各孔的OD 值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各孔葡萄糖濃度，葡萄糖攝取率=（空白組葡萄糖含量-每孔剩余葡萄糖含量）/空白組葡萄糖含量×100%。

1.8 乳酸生成實(shí)驗(yàn)

收集各組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照乳酸檢測試劑盒說明書，每孔加入待測樣品20 μL（標(biāo)準(zhǔn)管加入3 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液20 μL，空白管加入PBS 20 μL）、酶工作液1 mL、試劑盒D 工作液200 μL，混合均勻后于37 ℃水浴10 min，然后每管加入2 μL的Buffer E 溶液，混勻后，使用酶標(biāo)儀檢測530 nm 波長處各孔的OD 值。乳酸含量=（待測樣品OD 值-空白管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)品管OD 值-空白管OD 值）×樣品測試前稀釋倍數(shù)×3 mmol/L。

1.9 Western blot

RIPA試劑盒提取M0 exo、M2 exo和各組CAPAN-2和ASPC-1 細(xì)胞總蛋白，所得蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜后，將PVDF 膜與CD9、CD81、TSG101、KRAS、p-ERK1/2、ERK1/2、GAPDH 抗體于4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次后，以1∶10 000 的比例稀釋山羊抗體IgG并室溫孵育1 h，洗膜，使用ECL試劑盒顯影。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Graphpad prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果

與THP-1 細(xì)胞比較，M0 型巨噬細(xì)胞中iNOS、IL-12β、Arg-1 和IL-10 表達(dá)無顯著變化（P>0.05），而M0+rhIL-4+rhIL-13 細(xì)胞中M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白iNOS和IL-12β表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.001），M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白Arg-1 和IL-10 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.001），見圖1。說明rhIL-4 和rhIL-13 可誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞的極化。

圖1 qRT-PCR檢測細(xì)胞iNOS、IL-12β、Arg-1和IL-10 mRNA表達(dá)

2.2 M2型巨噬細(xì)胞外泌體鑒定結(jié)果

提取的M0 exo 和M2 exo 均呈雙層膜結(jié)構(gòu)，粒徑100 nm 左右，呈“杯托”樣，并且均表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD81、TSG101，符合外泌體的特征，見圖2。

圖2 M0 exo和M2 exo鑒定結(jié)果

2.3 M2型巨噬細(xì)胞外泌體促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞中KRAS/ERK1/2信號通路激活

與PBS組比較，M0 exo組CAPAN-2和ASPC-1細(xì)胞中KRAS 表達(dá)以及ERK1/2 磷酸化水平均無顯著差異（P>0.05）；與M0 exo組和PBS組比較，M2 exo組CAPAN-2和ASPC-1細(xì)胞中KRAS表達(dá)顯著增加（P<0.001），ERK1/2磷酸化水平顯著升高（P<0.001），見圖3。

圖3 外泌體對CAPAN-2和ASPC-1細(xì)胞中KRAS/ERK1/2信號通路的影響

2.4 M2型巨噬細(xì)胞外泌體促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖

與PBS 組比較，M0 exo 組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞增殖能力在24、48、72 h 均無顯著變化（P>0.05）；M2 exo 組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞在24、48、72 h 的增殖能力均顯著高于其他組（P<0.05），見圖4。

圖4 外泌體調(diào)控KRAS 對CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞增殖能力的影響

2.5 M2型巨噬細(xì)胞外泌體上調(diào)KRAS從而促進(jìn)糖酵解

與PBS 組比較，M0 exo 組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞的葡萄糖攝取率與乳酸生成水平均無顯著變化（P>0.05）；M2 exo 組CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞的葡萄糖攝取率與乳酸生成水平均顯著高于其他組（P<0.001），見圖5。

圖5 外泌體調(diào)控KRAS對CAPAN-2和ASPC-1細(xì)胞糖酵解的影響

3 討論

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是一類腫瘤微環(huán)境中重要的免疫細(xì)胞，其表型和功能與M2 型巨噬細(xì)胞相似，具有促進(jìn)腫瘤惡性生物學(xué)行為的功能[11]。Hwang 等[12]的研究指出，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤的增加與非小細(xì)胞肺癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)。D'Errico等[13]的研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可促進(jìn)胰腺癌的轉(zhuǎn)移。Kemp 等[14]的研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的水平能夠反映胰腺癌患者全身免疫水平的變化。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對腫瘤的調(diào)控是通過多種途徑進(jìn)行。Liu 等[15]的研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β 而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。越來越多的研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞亦可通過分泌外泌體而調(diào)控胰腺癌的血管新生、進(jìn)展、耐藥等[7-9]。本研究將單核細(xì)胞THP-1誘導(dǎo)分化為M2 型巨噬細(xì)胞，用于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的體外研究，并且提取M2 型巨噬細(xì)胞分泌的外泌體，將外泌體與胰腺癌細(xì)胞CAPAN-2 和ASPC-1 共孵育后發(fā)現(xiàn)，CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞的增殖能力顯著增加。Wu等[16]也發(fā)現(xiàn)M2 型巨噬細(xì)胞外泌體可促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長。Wei 等[17]亦發(fā)現(xiàn)，M2 型巨噬細(xì)胞外泌體可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的生長。上述結(jié)果均說明M2 型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。

研究表明，KRAS 通路的異?；罨c胰腺癌的病理進(jìn)程密切相關(guān)，超過90%的胰腺癌患者均存在KRAS 基因突變，KRAS 異?；罨瘯?dǎo)致胰腺癌細(xì)胞的快速生長[18]。Diehl 等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，KRAS/ERK 信號通路在胰腺癌中異常激活，靶向抑制ERK 可抑制KRAS 突變誘導(dǎo)的腫瘤生長。本研究將M2 型巨噬細(xì)胞外泌體與CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞共孵育后，CAPAN-2和ASPC-1細(xì)胞中KRAS 基因表達(dá)顯著上調(diào)，ERK1/2 磷酸化水平亦顯著升高，說明M2 型巨噬細(xì)胞外泌體可顯著激活KRAS/ERK1/2信號通路。Katopodi等[20]的研究表明，KRAS 突變可促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的形成。Humpton 等[21]的研究表明，原癌基因KRAS 的表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌的生長。Dey等[22]的研究表明，KRAS 突變可誘導(dǎo)胰腺癌腫瘤微環(huán)境的代謝重編程。本研究發(fā)現(xiàn)，與M2 型巨噬細(xì)胞外泌體共孵育后，CAPAN-2 和ASPC-1 細(xì)胞糖酵解增加，抑制細(xì)胞中KRAS 的表達(dá)后，M2 型巨噬細(xì)胞外泌體對腫瘤細(xì)胞的糖酵解誘導(dǎo)能力顯著下降，說明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞外泌體可通過誘導(dǎo)KRAS 信號通路而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的糖酵解。

綜上所述，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可通過分泌外泌體誘導(dǎo)KRAS/ERK 信號通路的激活而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和糖酵解。