低滲腸內(nèi)喂養(yǎng)減輕壞死性小腸結(jié)腸炎腸上皮損傷及其機(jī)制研究

余夢(mèng)楠,劉鋼,黃柳明,封志純（解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心,出生缺陷防控關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,兒童器官功能衰竭北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100700）

壞死性小腸結(jié)腸炎（Necrotizing enterocolitis，NEC）是常發(fā)生于新生兒，尤其是早產(chǎn)和低出生體重兒的胃腸道疾病；嚴(yán)重病例常出現(xiàn)白細(xì)胞、血小板下降[1]。NEC在存活新生兒中的發(fā)病率在0.5/1000-5/1000[2]，出生體重500-1500g的新生兒發(fā)病率可達(dá)7%[3]。隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)和兒科學(xué)發(fā)展、重癥新生兒監(jiān)護(hù)病房的建立，早產(chǎn)和低出生體重兒的存活率明顯提高，使NEC的發(fā)病率不斷提升[4-5]。NEC的發(fā)生通常認(rèn)為是由多因素參與、瀑布式進(jìn)展的消化系統(tǒng)炎癥性疾病[4-8]。研究[9]表明，與人工喂養(yǎng)相比，母乳喂養(yǎng)的早產(chǎn)兒NEC發(fā)病率降低接近4倍。為了滿足早產(chǎn)兒能量需求，往往會(huì)提高腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)熱卡，這使配方奶滲透壓增高。高滲性喂養(yǎng)可能損傷早產(chǎn)兒尚不成熟的腸黏膜，誘發(fā)NEC發(fā)生[10]。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，以稀釋配方奶喂養(yǎng)的早產(chǎn)或低出生體重兒，喂養(yǎng)不耐受發(fā)生率明顯低于接受未稀釋配方奶喂養(yǎng)的患兒，本研究通過以不同滲透壓的配方奶喂養(yǎng)大鼠，檢測(cè)腸道形態(tài)學(xué)、上皮細(xì)胞間緊密連接（tight junction，TJ）蛋白的特點(diǎn)，從而為NEC的預(yù)防治療提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料 脂多糖、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）購(gòu)于武漢谷歌生物科技公司，新生兒暖箱為寧波戴維醫(yī)療器械股份有限公司生產(chǎn)，人工喂養(yǎng)采用雀巢早產(chǎn)/低出生體重配方奶粉，自制缺氧箱。閉鎖小帶蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot，WB）實(shí)驗(yàn)抗體購(gòu)自Santa公司，閉合蛋白（Occludin，Occ）抗體購(gòu)自Invitrogen公司，β-Actin抗體及HRP山羊抗兔二抗購(gòu)自Servicebio公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將60只出生12小時(shí)內(nèi)SD大鼠標(biāo)號(hào)，交替隨機(jī)分為對(duì)照組、標(biāo)準(zhǔn)配方奶喂養(yǎng)組（標(biāo)準(zhǔn)組）和低滲配方奶喂養(yǎng)組（低滲組），每組20只。對(duì)照組乳母鼠同籠、鼠乳喂養(yǎng)；標(biāo)準(zhǔn)組、低滲組大鼠在培育箱中用不同滲透壓配方奶粉喂養(yǎng)，為實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 NEC模型建立 采用聯(lián)合人工喂養(yǎng)、缺氧5分鐘及胃注脂多糖（4mg/kg）建立NEC模型，建模48小時(shí)。

1.2.3 不同滲透壓配方奶配制方案 標(biāo)準(zhǔn)奶液為30ml溫水+5.37g奶粉（一勺），滲透壓256mOsm/kg（廠家標(biāo)示），低滲奶液30ml溫水+2.61g奶粉，計(jì)算得出滲透壓約為128mOsm/kg。

1.2.4 取材時(shí)間及方法 NEC造模后48小時(shí)，采取頸椎脫臼法處死全部大鼠，于冰袋上解剖，辨認(rèn)空腸、回腸、結(jié)腸，留取回盲瓣近端2cm回腸。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析使用IBMSPSS22.0軟件進(jìn)行，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)；計(jì)量資料以(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模過程中各組大鼠無(wú)死亡。各組小鼠出生時(shí)體重?zé)o差異[對(duì)照組：（7.40±0.98）g，標(biāo)準(zhǔn)組：（7.36±1.0）g，低滲組：（7.35±0.99）g]，造模48小時(shí)后，三組（n=20）平均體重分別為（10.12±0.78）g、（7.29±0.84）g及（7.09±0.97）g（P＜0.05）。對(duì)照組大鼠體重穩(wěn)定增長(zhǎng)，進(jìn)食、排便正常，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，無(wú)腹脹、吐奶。標(biāo)準(zhǔn)組大鼠部分皮膚發(fā)青，表現(xiàn)為懶動(dòng)、刺激后反應(yīng)減慢，灌胃時(shí)阻力較大、嘔吐；無(wú)血便及明顯腹脹。低滲組部分大鼠出現(xiàn)皮膚發(fā)青、活動(dòng)減少、刺激后反應(yīng)減慢；未見血便及明顯腹脹，胃潴留少見（見圖1）。參照Z(yǔ)ani提出的大鼠NEC評(píng)分方法，對(duì)照組0.2分，標(biāo)準(zhǔn)組3.9分，低滲組3分（P＜0.05）。

圖1 大鼠腸道形態(tài)表現(xiàn)。A：對(duì)照組，腸道形態(tài)正常；B：低滲組，回腸未見明顯擴(kuò)張、淤血、積氣，結(jié)腸腸壁積氣；C：標(biāo)準(zhǔn)組，回腸擴(kuò)張且彈性差，腸壁間積氣，腸腔內(nèi)可見氣泡

2.2 各組大鼠腸道大體病理比較 對(duì)照組大鼠空腸乳白色，回腸淡黃色，彈性好，未見積氣積液。標(biāo)準(zhǔn)組部分大鼠可見腸管擴(kuò)張伴腸壁淤血或積氣；結(jié)腸病變最重，回腸次之，空腸較輕，腸道大體病理符合NEC表現(xiàn)（見圖1）。低滲組部分大鼠腸管擴(kuò)張，回腸無(wú)明顯腸壁或積氣，部分結(jié)腸腸壁積氣（見圖1）。根據(jù)Zani評(píng)分，對(duì)照組0分，標(biāo)準(zhǔn)組2分，低滲組1分（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠腸道組織學(xué)病理改變比較 對(duì)照組大鼠回腸結(jié)構(gòu)完整，腸黏膜完整連續(xù)，腸絨毛多而細(xì)長(zhǎng)，呈葉狀或指狀突入腸腔，上皮隱窩豐富，部分存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。標(biāo)準(zhǔn)組腸壁變薄、部分壁內(nèi)出血，腸絨毛參差不齊并縮短增寬；隱窩減少并部分裸露、結(jié)構(gòu)紊亂。低滲組回腸腸黏膜多完整連續(xù)，腸絨毛葉狀或指狀、表面為單層柱狀上皮細(xì)胞，固有層內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖2）。

圖2 各組大鼠腸組織HE染色結(jié)果（×100）。A：對(duì)照組，絨毛細(xì)長(zhǎng)且排列規(guī)則，上皮細(xì)胞柱狀；B：標(biāo)準(zhǔn)組，絨毛縮短脫落；C：低滲組，絨毛細(xì)長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)完整，絨毛固有層內(nèi)見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

光鏡下（10×10倍）測(cè)量視野中絨毛高度（n=3），對(duì)照組（178±5.8）um，標(biāo)準(zhǔn)組（105±6.5）um，低滲組（134±5.4）um，提示NEC時(shí)腸上皮絨毛高度縮短，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)Nadler腸組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組（0.5±0.50）分，標(biāo)準(zhǔn)組（1.5±0.55）分，低滲組（0.8±0.54）分，組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠腸道上皮超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn) 電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)兩實(shí)驗(yàn)組上皮細(xì)胞微絨毛出現(xiàn)破壞（見圖3）。在放大倍數(shù)為×4.0k時(shí)，每組選5個(gè)切面、每切面選擇10個(gè)上皮細(xì)胞進(jìn)行觀察，計(jì)算微絨毛破壞的上皮細(xì)胞占總上皮細(xì)胞比率。得出對(duì)照組3%，標(biāo)準(zhǔn)組18%，低滲組12%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組上皮細(xì)胞間TJ結(jié)構(gòu)存在，部分結(jié)構(gòu)模糊不清（見圖3）。在×5.0k放大倍數(shù)下為每組各選擇10個(gè)TJ，平行微絨毛軸對(duì)TJ長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量并取平均值（μm），結(jié)果為：對(duì)照組（0.24±0.01），標(biāo)準(zhǔn)組（0.29±0.01），低滲組（0.26±0.02）（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠腸道TJ蛋白表達(dá)比較 WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著滲透壓增加，ZO-1、Occ表達(dá)逐漸降低，其中ZO-1/Actin：對(duì)照組（0.66±0.04），標(biāo)準(zhǔn)組（0.06±0.015），低滲組（0.18±0.03），P＜0.05。Occ/Actin：對(duì)照組（2.13±0.2），標(biāo)準(zhǔn)組：（0.14±0.005），低滲組（0.97±0.025），P＜0.05（見圖4）。

圖4 各組大鼠回腸中ZO-1、Occ的蛋白表達(dá)水平

3 討論

高滲透性嬰兒配方奶可導(dǎo)致滲透性腹瀉的發(fā)生，并誘發(fā)NEC發(fā)生。Basuki[11]等人報(bào)道，降低配方奶滲透壓可使早產(chǎn)或低出生體重兒出現(xiàn)喂養(yǎng)不耐受、嘔吐或腹脹的現(xiàn)象減少，并較快達(dá)到全腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)。筆者發(fā)現(xiàn)，以稀釋配方奶喂養(yǎng)NEC高?；純?，逐漸加量到一定程度，再以正常配方奶喂養(yǎng)，可使NEC發(fā)生率降低。

本研究發(fā)現(xiàn)新生大鼠接受人工喂養(yǎng)、缺氧及LPS灌胃48小時(shí)后，腸道可以出現(xiàn)NEC樣變化，包括腸管擴(kuò)張、積氣，腸道上皮細(xì)胞出現(xiàn)絨毛脫落、縮短，微絨毛破壞比率增加，上皮細(xì)胞間TJ長(zhǎng)度增長(zhǎng)等變化；在蛋白水平，實(shí)驗(yàn)組大鼠TJ蛋白表達(dá)下降。對(duì)于缺氧及存在細(xì)菌負(fù)荷的大鼠，低滲配方奶可減輕腸道損傷。與標(biāo)準(zhǔn)配方奶喂養(yǎng)相比，低滲組大鼠的腸絨毛長(zhǎng)度較長(zhǎng)；超微水平可觀測(cè)到腸上皮微絨毛破壞較少。在超微水平另一主要發(fā)現(xiàn)是兩實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組TJ長(zhǎng)度增加，而低滲組TJ長(zhǎng)度的增加要低于標(biāo)準(zhǔn)組。此外還發(fā)現(xiàn)，低滲喂養(yǎng)可減輕實(shí)驗(yàn)條件下TJ蛋白ZO-1和Occ的表達(dá)下調(diào)。

TJ位于上皮細(xì)胞頂端及側(cè)膜，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞通道的作用，也通過阻斷脂類及蛋白質(zhì)自由擴(kuò)散，保持細(xì)胞極性。TJ是最重要的腸機(jī)械屏障結(jié)構(gòu)，決定腸黏膜通透性。研究發(fā)現(xiàn)，腸道通透性增高出現(xiàn)在腸道組織形態(tài)發(fā)生變化之前。如胃注FITC標(biāo)記的右旋糖酐后，可在12小時(shí)、24小時(shí)在血液中檢測(cè)出[12]；處理24小時(shí)后，上皮細(xì)胞組織學(xué)無(wú)損傷表現(xiàn)而上皮通透性增加，提示此時(shí)可能發(fā)生TJ缺陷。電鏡觀察到母乳組及NEC組上皮細(xì)胞間TJ結(jié)構(gòu)均完整，而TJ從頂端到基底外側(cè)的長(zhǎng)度在NEC組約為（0.31±0.02）um，母乳組約（0.25±0.01）um，NEC組比母乳組長(zhǎng)約23.6%，提示TJ結(jié)構(gòu)重塑[12]。Occ是最初發(fā)現(xiàn)的完整TJ蛋白，其功能尚不完全清楚，目前認(rèn)為它在維持腸上皮TJ結(jié)構(gòu)和通透性中發(fā)揮重要作用。ZO蛋白是最早發(fā)現(xiàn)的TJ特異性蛋白之一，有三個(gè)組成蛋白，包括ZO-1、ZO-2和ZO-3。ZO有許多結(jié)構(gòu)域，其N末端與許多TJ蛋白結(jié)合，C末端連接肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，發(fā)揮維持和調(diào)節(jié)TJ結(jié)構(gòu)的作用。TJ結(jié)構(gòu)和功能的完整性呈動(dòng)態(tài)變化，許多因素可影響其完整。早產(chǎn)兒TJ相對(duì)于足月兒發(fā)育不成熟，上皮屏障的破壞可導(dǎo)致早產(chǎn)兒出現(xiàn)NEC的風(fēng)險(xiǎn)增高。

腸上皮屏障出現(xiàn)功能異常不僅使早產(chǎn)兒更容易發(fā)生NEC，還可使腸道損傷和炎癥程度更重，從而使NEC嚴(yán)重程度增加。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)腡J組成蛋白表達(dá)和在不成熟腸道中的分布，可使實(shí)驗(yàn)NEC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和嚴(yán)重程度降低。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激狀態(tài)下人工喂養(yǎng)大鼠TJ家族蛋白表達(dá)下降，而降低配方奶滲透壓可減輕這一變化，這可能在預(yù)防NEC的發(fā)生中具有實(shí)用臨床價(jià)值。未來研究中，確定TJ哪些核心成分異常可增加NEC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)或加重其嚴(yán)重程度，可能是確定治療時(shí)機(jī)和選擇治療方式的重要手段。