二代基因測(cè)序技術(shù)聯(lián)合半乳甘露聚糖檢測(cè)對(duì)重癥肺炎合并真菌感染的診斷價(jià)值*

王美玉，王文博，李翠娟

[大慶龍南醫(yī)院（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院） 1.臨床藥學(xué)科，2.急診重癥監(jiān)護(hù)室，3.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，黑龍江 大慶 163458]

近年來(lái)，重癥肺炎一直是醫(yī)學(xué)界和公眾關(guān)注的焦點(diǎn)之一。重癥肺炎作為一種嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)感染，常見(jiàn)于重癥監(jiān)護(hù)病房患者，以呼吸困難、高熱、咳嗽及胸痛等臨床癥狀為主，伴隨病情遷延不愈，可導(dǎo)致多器官功能衰竭，病死率達(dá)20%～50%[1-2]。此外，部分重癥肺炎患者常合并真菌感染，加重肺部炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)失調(diào)及全身炎癥反應(yīng)綜合征病情進(jìn)展，增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。

目前，臨床上針對(duì)重癥肺炎合并真菌感染的診斷以臨床癥狀、影像學(xué)檢查及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)為主。然而，臨床癥狀及影像學(xué)檢查在敏感性和特異性方面存在一定局限性，尤其對(duì)早期真菌感染的檢測(cè)，無(wú)法及時(shí)準(zhǔn)確地確定感染的存在及病原菌種類[5-6]。病原微生物培養(yǎng)作為臨床診斷真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，診斷效能高，但培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，時(shí)效性差，加之患者病情多變，不利于患者的針對(duì)性治療及預(yù)后改善[7]。

半乳甘露聚糖（Galactomannan，GM）可通過(guò)檢測(cè)血液中GM抗原水平鑒別真菌感染，具有快速、非侵入性及定量化的優(yōu)勢(shì)[8]。二代基因測(cè)序技術(shù)（nextgeneration sequencing，NGS）是一種新型的高通量測(cè)序技術(shù)，可對(duì)樣本中的全部基因組進(jìn)行廣泛測(cè)序，不僅能夠檢測(cè)真菌的存在及種類，還可檢測(cè)部分耐藥基因，確定相關(guān)致病機(jī)制，從而指導(dǎo)個(gè)體化治療決策[9]。目前，鮮有研究報(bào)道GM聯(lián)合NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染的效能分析，因此本研究嘗試分析GM聯(lián)合NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染的價(jià)值，為合并真菌感染患者的早期診斷、治療決策及預(yù)后改善提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年3月—2023年3月大慶龍南醫(yī)院急診重癥監(jiān)護(hù)室收治的重癥肺炎患者148例。其中，女性72例，男性76例；年齡41～77歲，平均（63.01±6.08）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《美國(guó)胸科學(xué)會(huì)及感染病學(xué)會(huì)-成人社區(qū)獲得性肺炎診治標(biāo)準(zhǔn)2019》[1]，符合下述≥1項(xiàng)主要診斷標(biāo)準(zhǔn)且≥ 3項(xiàng)次要診斷標(biāo)準(zhǔn)確診，主要標(biāo)準(zhǔn)：①氣管插管機(jī)械通氣，②膿毒癥患者液體復(fù)蘇后維持血管活性藥物治療；次要標(biāo)準(zhǔn)：①多肺葉受累或低血壓需液體復(fù)蘇或意識(shí)障礙，②氧合指數(shù)≤ 250，③呼吸頻率≥ 30次/min，④血尿素氮≥ 20 mg/dL，⑤血小板計(jì)數(shù)＜100×109/L，⑥白細(xì)胞計(jì)數(shù)＜4×109/L。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合重癥肺炎的臨床診斷；②影像學(xué)檢查可見(jiàn)肺部存在病灶；③完成支氣管鏡檢及支氣管肺泡灌洗液收集。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并多器官衰竭綜合征；②合并紅斑狼瘡、類風(fēng)濕等免疫性疾??；③精神病史；④肺癌；⑤妊娠或哺乳期女性。

1.3 研究方法

所有患者行支氣管鏡檢查并收集支氣管肺泡灌洗液，行病原微生物培養(yǎng)、血清GM及肺泡灌洗液NGS檢測(cè)。以病原微生物培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，分析血清GM及肺泡灌洗液NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染的敏感性、特異性，評(píng)估血清GM檢測(cè)、肺泡灌洗液NGS檢測(cè)單獨(dú)及聯(lián)合診斷重癥肺炎合并真菌感染結(jié)果與病原微生物培養(yǎng)結(jié)果的一致性。

1.3.1 肺泡灌洗液收集 入院72 h內(nèi)，咪達(dá)唑侖靜脈鎮(zhèn)靜，鼻腔進(jìn)鏡，采用2%利多卡因行氣道黏膜表面局部麻醉，將支氣管鏡頂端嵌頓在病變相對(duì)嚴(yán)重段的支氣管分支，注入60～120 mL生理鹽水灌洗，100 mmHg負(fù)壓抽吸，回收率為40%～60%，灌洗液培養(yǎng)量≥ 10 mL。

1.3.2 病原微生物培養(yǎng) 灌洗液樣本常規(guī)富集培養(yǎng)、涂片，革蘭染色鏡檢剔除假陽(yáng)性菌。使用全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Biolog公司，型號(hào)：GEN ⅢOmnilog型）檢測(cè)病原微生物種類。

1.3.3 血清GM檢測(cè) 入院72 h內(nèi)，采集患者肘靜脈血4 mL，3 500 r/min離心10 min，離心半徑13 cm，取上清液用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清GM水平，檢測(cè)結(jié)果判定：I值≥ 1為陽(yáng)性。

1.3.4 肺泡灌洗液NGS檢測(cè) 將肺泡灌洗液低溫4 ℃、4 000 r/min離心10 min、離心半徑13.5 cm，取上清液。采用DNA提取試劑盒提取上清液中游離DNA。DNA超聲破碎至150 bp的片段，插入200～300 bp的片段，使用DNA質(zhì)控試劑（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，商品名：Qubit dsDNA HS Assay Kit）將線性的DNA轉(zhuǎn)化為單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)，后滾環(huán)復(fù)制生成DNA納米球。使用高通量測(cè)序平臺(tái)BGISEQ-5/MGISEQ-2000（深圳華大基因和MGISEQ公司）進(jìn)行測(cè)序，篩除長(zhǎng)度＜35 bp的低質(zhì)量片段。采用BEA測(cè)序軟件對(duì)比人參考基因組序列，剔除人基因組序列；剩余數(shù)據(jù)與細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行自動(dòng)對(duì)比，獲取匹配到病原體的序列數(shù)，判定病原體種類。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；一致性檢驗(yàn)用Kappa值，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原學(xué)培養(yǎng)結(jié)果

148例重癥肺炎中合并真菌感染患者30例，其中肺孢子菌10例、白色念珠菌8例、曲霉菌7例、根霉菌1例、肺孢子菌感染合并白色念珠菌3例、肺孢子菌感染合并鮑曼不動(dòng)桿菌1例。

2.2 兩組患者臨床資料比較

重癥肺炎合并真菌感染30例，未合并真菌感染患者118例。兩組年齡、氧合指數(shù)、氧分壓、中性粒細(xì)胞比例、急性生理與慢性健康評(píng)分比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組性別構(gòu)成、糖尿病、高血壓、慢性呼吸道疾病比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

2.3 血清GM診斷重癥肺炎合并真菌感染

血清GM試驗(yàn)結(jié)果顯示，陽(yáng)性28例，陰性120例；病原學(xué)培養(yǎng)，感染30例，非感染118例，Kappa值為0.700，經(jīng)一致性檢驗(yàn)，兩者具有一致性（χ2=39.981，P=0.001）。見(jiàn)表2。

表2 血清診斷重癥肺炎合并真菌感染的結(jié)果 例

2.4 肺泡灌洗液NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染

肺泡灌洗液NGS診斷結(jié)果顯示，陽(yáng)性34例，陰性114例；病原學(xué)培養(yǎng)，感染30例，非感染118例，Kappa值為0.841，經(jīng)一致性檢驗(yàn)，兩者具有一致性（χ2=54.716，P=0.001）。見(jiàn)表3。

表3 泡灌洗液NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染的結(jié)果 例

2.5 血清GM聯(lián)合肺泡灌洗液NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染

血清GM聯(lián)合肺泡灌洗液NGS診斷結(jié)果顯示，陽(yáng)性30例，陰性118例；病原學(xué)培養(yǎng)，感染30例，非感染118例，Kappa值為0.916，經(jīng)一致性檢驗(yàn)，兩者具有一致性（χ2=66.293，P=0.001）。見(jiàn)表4。

表4 血清GM聯(lián)合肺泡灌洗液NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染的結(jié)果 例

2.6 血清GM聯(lián)合肺泡灌洗液NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染的價(jià)值

ROC曲線結(jié)果分析顯示，血清GM、肺泡灌洗液NGS單獨(dú)及聯(lián)合診斷重癥肺炎合并真菌感染的敏感性分別為73.3%（95% CI：0.538，0.870）、93.3%（95% CI：0.765，0.988）、93.3%（95% CI：0.765，0.988），特異性分別為94.9%（95% CI：0.888，0.979）、94.9%（95% CI：0.889，0.979）、98.3%（95% CI：0.934，0.997），曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.841、0.941和0.958。見(jiàn)表5。

表5 血清GM聯(lián)合肺泡灌洗液NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染的效能分析

3 討論

近年來(lái)，抗菌藥物在臨床濫用現(xiàn)象增多，以及糖皮質(zhì)激素應(yīng)用增加，導(dǎo)致住院患者真菌感染率明顯升高，尤其是重癥肺炎患者，真菌感染可導(dǎo)致臨床癥狀加重，甚至危及生命[10-11]?？股氐难舆t使用是引起病原菌感染患者死亡的危險(xiǎn)因素[12]。因此臨床上針對(duì)重癥肺炎疑似合并真菌感染的患者，在尋找病原學(xué)證據(jù)的同時(shí)，經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療仍為現(xiàn)階段治療中的應(yīng)急方案，但易增加藥物耐藥性，不利于抗生素的合理應(yīng)用。目前，侵襲性肺曲霉是肺部真菌感染中檢出率偏高的一類病原菌，可導(dǎo)致肺泡壁的破裂及組織壞死，并形成炎癥灶及壞死區(qū)域，嚴(yán)重?fù)p傷患者肺功能[13-14]。此外，近些年研究報(bào)道，肺念珠菌、肺隱球菌等病原菌在肺部真菌感染中檢出率不斷升高，同樣是威脅肺部真菌感染患者預(yù)后的高危病原菌[15-16]。目前，病原菌培養(yǎng)作為臨床診斷真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，診斷效能良好，然而因病原菌培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，患者無(wú)法及時(shí)實(shí)施早期干預(yù)治療，導(dǎo)致病情進(jìn)展，增加后期治療難度，不利于患者預(yù)后[17-18]。目前，G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)是診斷肺炎患者合并真菌感染的常用方法，其中G試驗(yàn)在識(shí)別免疫球蛋白G抗體中具有較高的特異性，但感染初期可能無(wú)法檢測(cè)到特異性的免疫球蛋白G抗體，往往需要進(jìn)行免疫球蛋白M試驗(yàn)或核酸檢測(cè)等補(bǔ)充測(cè)試，同時(shí)G檢驗(yàn)無(wú)法區(qū)分活動(dòng)感染和既往感染，只能檢測(cè)是否存在特定病原體的免疫球蛋白G抗體，臨床實(shí)踐中局限性明顯。GM試驗(yàn)是篩查侵襲性曲霉菌感染的方法，在侵襲性曲霉菌感染中的輔助診斷價(jià)值良好，但血清GM試驗(yàn)存在一定的局限性。有研究發(fā)現(xiàn)，血清GM試驗(yàn)可能受時(shí)間窗口效應(yīng)的影響，在病原菌感染早期，部分患者的抗原水平上升幅度并不顯著，局限性明顯[19-20]。因此，尋求更具特異性、敏感性及高效、快捷的輔助診斷方法，提高重癥肺炎合并真菌感染的診斷價(jià)值，成為近幾年臨床醫(yī)學(xué)者不斷探索的關(guān)鍵。

近年來(lái)，NGS技術(shù)不斷發(fā)展，已逐步從實(shí)驗(yàn)室研究應(yīng)用于臨床，早期實(shí)踐階段在腫瘤基因檢測(cè)、遺傳性疾病篩查等領(lǐng)域發(fā)揮作用，近年來(lái)已拓展至感染性疾病病原學(xué)診斷及監(jiān)測(cè)，并展現(xiàn)了巨大的臨床實(shí)用價(jià)值及應(yīng)用前景。NGS是通過(guò)對(duì)宏基因組的樣本開(kāi)展大規(guī)模測(cè)序，以獲得基因組核酸序列，進(jìn)而借助生物信息工具進(jìn)行定量分析，獲得詳細(xì)的病原基因信息，與基因庫(kù)基因型對(duì)比，從而獲得該病原微生物的分型、耐藥性及毒力等信息[21]。YANG等[22]研究表明，宏基因組學(xué)用于重癥肺炎合并診斷真菌感染的診斷中，與陽(yáng)性微生物培養(yǎng)物及從培養(yǎng)物陰性樣本中測(cè)序獲得的臨床可操作信息一致，有潛力成為指導(dǎo)重癥肺癌抗菌決策的重要醫(yī)療技術(shù)。此外，肺泡灌洗液NGS技術(shù)具有高效、病原體覆蓋廣等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)微生物檢測(cè)的耗時(shí)問(wèn)題，可盡早地由經(jīng)驗(yàn)治療轉(zhuǎn)為目標(biāo)治療，減輕患者痛苦，縮短治療時(shí)間，降低細(xì)菌耐藥率，節(jié)約醫(yī)療資源，為臨床疾病診治提供新的可靠依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，30例重癥肺炎中合并真菌感染中肺孢子菌、白色念珠菌及曲霉菌的檢出率最高，表明重癥肺炎中合并真菌感染患者的真菌感染種類仍以肺孢子菌、白色念珠菌及曲霉菌為主，與張安兵等[23]報(bào)道結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，血清GM診斷重癥肺炎合并真菌感染的敏感性、特異性、AUC及Kappa值分別為73.3%、94.9%、0.841及0.700，提示血清GM診斷重癥肺炎合并真菌感染的效能良好。與毛伍兵等[24]研究結(jié)果相近。但仍有8例合并真菌感染的患者未檢出，血清GM試驗(yàn)鑒別真菌感染的效能取決于真菌細(xì)胞壁中的抗體成分GM，當(dāng)重癥肺炎患者合并真菌感染時(shí)，活體或死亡的真菌細(xì)胞可分解釋放GM至體液中，從而顯示抗體陽(yáng)性，但其含量及釋放同樣取決于菌種的種類，分析是導(dǎo)致血清GM試驗(yàn)誤診、漏診的原因。此外，SADAQAT等[25]研究報(bào)道，部分細(xì)菌基因?qū)Π肴楦事毒厶羌棒然瑯颖憩F(xiàn)出生物活性，可能會(huì)通過(guò)釋放與血清GM結(jié)構(gòu)或抗原性相似的活性物質(zhì)或代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)其產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致血清GM試驗(yàn)顯示為假陽(yáng)性，增加誤診、漏診率。本研究結(jié)果顯示，肺泡灌洗液NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染的敏感性、特異性、AUC及Kappa值分別為93.3%、94.9%、0.941及0.841，提示肺泡灌洗液NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染的效能良好。但其中2例NGS診斷陰性患者經(jīng)病原學(xué)培養(yǎng)后檢出霉菌菌絲，提示肺泡灌洗液NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染同樣存在誤診、漏診風(fēng)險(xiǎn)。肺泡灌洗液NGS診斷通過(guò)DNA純化后與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析得出真菌感染種類，而對(duì)于低豐度感染的真菌，DNA或RNA可能被掩蓋，在早期感染、局部感染或低病原體負(fù)荷的情況下導(dǎo)致NGS無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)到真菌感染。

本研究樣本量有限，而重癥肺炎合并真菌感染的種類豐富。何德華等[26]研究認(rèn)為，NGS對(duì)于罕見(jiàn)菌、不典型菌的檢出率低。因此，后續(xù)研究仍需完善多中心、大樣本研究，明確血清GM、NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染的缺陷，不斷完善臨床診斷方案，改善患者預(yù)后。

綜上所述，血清GM聯(lián)合肺泡灌洗液NGS診斷重癥肺炎合并真菌感染，在肺孢子菌、白色念珠菌及曲霉菌等常見(jiàn)菌種中的診斷效能良好。